Нанотехнологията в диагностични техники за SARS- CoV-2

Резюме

Напредъкът на нанотехнологиите е от съществено значение за диагностицирането на COVID-19. Профилактиката и диагностиката са важни за контролиране на разпространението на инфекцията. Нанотехнологиите предлагат нови методи за бърза диагностика, детектиране на инфекции в ранните етапи и идентифициране на COVID-19. Поради по-малкия си размер и по-голямата си повърхност, нанотехнологичните продукти могат да детектират заболяването с висока точност. Тъй като симптомите на COVID-19 са близки до тези на други респираторни заболявания, от съществено значение е наличието на прецизни, чувствителни и бързи диагностични инструменти за детектиране на инфекцията в ранен етап.

Ключови думи/фрази: нанотехнология, COVID-19, диагностика

1. 1. Въведение

Коронавирусното заболяване от 2019 г. (COVID-19), предизвикано от тежък остър респираторен синдром коронавирус 2 (SARS-CoV-2), е глобален здравен проблем, който СЗО обяви за пандемия. COVID-19 доведе до световен локдаун и застраши глобалната икономика. SARS-CoV-2 се разпространи бързо по целия свят, генерирайки повсеместна пандемия. Този вирус се разпространява от човек на човек чрез респираторни капки и близък контакт. Хора от всички възрасти могат да бъдат инфектирани. Разпространяването на COVID-19 оказа международен натиск върху модерните общества, особено върху инфраструктурата, свързана със здравеопазването. Следователно, необходими са диагностични тестове, специфични за това заболяване, за да се диагностицират положителните случаи, пациентите да бъдат подложени на скрининг и за да се извърши проследяване на вирусното поведение. Диагностиката играе голяма роля в предотвратяването на COVID-19 като позволява бързо предприемане на действия от институциите, ограничаващи разпространението чрез детекция и изолиране на индивиди и чрез проследяване на контактните лица. Следователно, светът е изправен пред ново предизвикателство: да създаде ултрабързи, ултрачувствителни устройства и наномащабни аналитични инструменти или сензорни системи (напр. нанобиосензори), които да бъдат високоефективни в детектирането на новия коронавирус от 2019 г. (COVID-19) или тежкия остър респираторен синдром (SARS) [3, 10, 17].

С напредъка в нанотехнологиите, изключителните свойства на наноматериалите, включително способността им да усилват сигнала при детекция, могат да бъдат използвани за разработването на нанобиосензори и нановизуализационни процеси. Заедно с други диагностични инструменти могат да бъдат приложени за детектиране в ранен етап на заболяването. Нанотехнологиите биват цялостно изследвани за перспективите си в разработването на диагностични техники, терапии, ваксини и стратегии за облекчаване на здравеопазването [10].

2. Съвременни лабораторни методи за диагностициране на SARS-CoV-2

Диагностицирането на COVID-19 се основава на анализиране на симптомите на пациента или изследване за наличието на вируса, например неговата РНК или белтък. Температурата на пациента (повишена температура), чувството за отпадналост и затруднено дишане предполагат наличието на инфекция. Въпреки това, тези симптоми са неспецифични и могат да се наблюдават при инфекция с други патогени. Патологичните изменения в органи на пациента, като например органите в гръдния кош, могат да бъдат наблюдавани чрез компютърна томография (CT). Компютърната томография може да бъде надежден тест за скрининг на SARS-COV 2 случи, както при други видове пневмония. Анализът обаче, изисква специализирано оборудване и не успява да отговори на голяма част от изискванията. COVID-19 може да бъде диагностициран чрез лабораторни измервания. Тези методи обикновено се използват за изследване на пациенти. Те не могат да се използват за анализ на замърсени проби като повърхност и въздух [1].

Фигура 1. Методи за диагностика на COVID-19.

Разработени са няколко метода за диагностика на COVID-19. Основните тестове за диагностика могат да бъдат класифицирани в три основни категории [1]:

1. Генетични тестове (тестове за наличието на вирусна нуклеинова киселина): анализ на вирусния геном, използващ методи като количествена полимеразна верижна реакция в реално време, използваща ензима обратна транскриптаза (RT-qPCR), изотермична амплификация (например изотермична амплификация, медиирана от формирането на структури наподобяващи примка (LAMP), амплификация базирана на последователност в нуклеиновата киселина (NASBA), транскрипционно медиирана амплификация (TMA), амплификация на търкалящото се колело (RCA), клъстерирани къси палиндромни повтори (CRISPR)) и нaнопорово таргетирано секвениране (NTS).
2. Антигенни тестове:анализ на вирусните белтъци (мембранно свързани шипчести белтъци или нуклеокапсидни белтъци) чрез колориметрични техники, техники използващи полеви транзистор (FET), ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) и масспектрометрия (MS).
3. Серологични тестове: анализ на антитела (имуноглобулин M (IgM) и имуноглобулин G (IgG)) срещу вируса [18, 19]. Изследването на антителата на пациента може да бъде постигнато чрез методи като електрически (EC) биосензори, локализиран повърхностен плазмонен резонанс (LSPR), усилено повърхностно Раманово разсейване (SERS), кварцов кристален микробаланс (QCM), флуоресцентен биосензор, колориметричен биосензор, имунохроматография със златни наночастици, ELISA, хемилуминесцентен имуноанализ и пиезоелектрични микроконзолни сензори (PEMS).

За съжаление много традиционни методи за детекция на респираторни вируси, като RT-PCR, имат много недостатъци. Те отнемат много време, скъпи са, не винаги са възпроизводими и изискват квалифициран персонал и други технически съоръжения [3].

Фигура 2. Недостатъци на традиционните методи.

3. Нанотехнологии

Нанотехнологиите предлагат нови техники за бърза диагностика, ранно откриване на инфекции и идентифициране на вирусни патогени, причиняващи пандемии. Те подобряват ефективността и качеството на детекционния процес чрез използване на нанобиосензори. Освен това, новите наноструктури и наносензори показват свойства и характеристики, невиждани досега на макроскопично ниво, за детектиране и улавяне на инфекции [3]

Нанотехнологиите могат да подобрят диагностицирането на COVID-19 и да предложат най-съвременен диагностичен метод, базиран на „Point Of Care“ (POC) сенсинг технологията. Освен това, те могат да бъдат свързани с изкуствен интелект (AI) и биосензори, интегрирани в интернет-свързани медицински устройства (IoMT) за изучаване на практическа информатика чрез съхранение, споделяне и анализ на данни. Освен това, те могат да заобиколят традиционните процеси с ниска чувствителност, ниска селективност, висока цена и удължено време за диагностика. Могат да се използват в нови методи за безболезнени анализи на проби, като например анализиране на слюнката на пациента с помощта на графенов оксид (GO)/Au/Fiber Bragg grating (FBG) сонда. Нанотехнологиите могат да усъвършенстват технологии като свободни от бележене биосензори, хартиени латерални поточни анализи, оптични технологии и цифрови технологии [1].

3.1. Нанобиосензори

По-големият превес на вирусни огнища може да се дължат на неправилни детекционни инструменти, използвани за откриване на инфекциозни агенти. Необходим е инструмент за детектиране или диагностика с убедителни, бързи и прецизни биосенсинг свойства. Биосензорите могат да бъдат характеризирани като аналитични инструменти, които могат да анализират ниски концентрации от аналита в биологични проби (като човешки серум, кръв, сълзи, слюнка и др.). В сравнение с традиционните китове за качествени и количествени анализи, тези биосензори са по-предпочитани поради своята прецизност и чувствителност към избраната целева молекула [15].

Фигура 3. Класификация и приложения на различните биосензори.

Необходимостта от точност и бързина при диагностицирането на COVID-19 не се удовлетворява от традиционните методи като серологични тестове и полимеразна верижна реакция с обратна транскрипция (RT-PCR), които рутинно се използват за детектиране и диагностициране на COVID-19. Това условие може да бъде изпълнено чрез използване на ултрачувствителни нанобиосензори, които играят важна роля в детектирането на новия коронавирус. Нанобиосензорите предоставят бърза, рентабилна, прецизна и миниатюризирана платформа за детектиране на SARS-CoV-2 [10]. Биосензорите обикновено са изградени от молекула за биологично разпознаване, имобилизирана върху повърхността на сигнален трансдуктор и могат да бъдат използвани за анализ, диагностика, защита, сигурност и тестване на по-големи популации [3].

Нанобиосензорите предоставят няколко предимства, водещи до ефективно детектиране, като например [3]:

• Рентабилност;
• Дълъг живот;
• Лесни за употреба;/li>
• Автономност;
• Прецизност;
• Портативни са;
• Бързо получаване на резултати;
• Силно чувствителни;
• Мултиплексни възможности;
• Приложим процес.

Нанобиосензорите са устройства, в които трансдукторът се променя, за да улови целевия компонент, биологичният отговор се превръща в електрически сигнали, който бива детектиран бързо и с висока точност. Физичните отговори могат да бъдат изчислени чрез използване на подходящи биорецептори, като нуклеинови киселини, антигени, ДНК сонда, пептид, цяла клетка, микроорганизъм и тъкан. Тези рецептори са лесно разпознаваеми, силно чувствителни и могат да детектират специфичен биоаналит. Таргетната молекула се свързва с биорецептора. След това трансдукторът с интегрирани наноструктури трансформира детекцията в електрически сигнал, дефиниран от детектора (фиг. 4) [3].

Фигура 4. Схема на различни аналити, биорецептори и трансдуктори като части от типичния нанобиосензорен дизайн за детекция на респираторни вируси.

Нанобиосензорите, използвани за детектиране на SARS или MERS коронавируси, могат да бъдат категоризирани въз основа на биологичната молекула към която са насочени (нуклеинови киселини, антигени или антитела) като биосензори,базирани на нуклеинова киселина, биосензори базирани на антиген и биосензори базирани на антитяло (Фиг. 5) [3].

Фигура 5. Схема на класификация на различни биосензори за детекция на SARS и MERS коронавируси.

3.1.1. Електрохимични нанобиосензори

Електрохимичните биосензори са най-широко използвания и най-предпочитания тип биосензори. Според дефиницията на IUPAC, електрохимичният биосензор е „интегрирано устройство, което е способно да предоставя специфична количествена или полуколичествена аналитична информация, използвайки елемент за биологично разпознаване (биохимичен рецептор), който поддържа пряк пространствен контакт с електрохимичен трансдуциращ елемент.“ [8, 13].

Електрохимичния нанобиосензор е молекулно сензорно устройство, което свързва процеса на биологично разпознаване с електроден трансдуктор, за да създаде използваем електричен сигнал. Тъй като в електрохимичните наносензори има електроди, полупроводниковите свойства, диелектричните свойства и разпределението на заряда са критични елементи [3].

Фигура 6. Схема, показваща компонентите на биосензор, използвани за сенсинг на целеви аналитни проби. Обърнато е внимание на използването на електрохимична биосензорна платформа, която трансформира биохимичната информация в ток или напрежение върху електрохимична трансдукторна повърхност.

Основните предимства на електрохимичните биосензори са [5, 11]:

• Лесно разработване;
• Възможност за миниатюризация;
• Висока чувствителност;
• Сравнително ниска цена.

Електрохимичните сензори са привлекателен избор за детектиране на различни биомолекули, тъй като те могат да бъдат лесно комбинирани с множество модули като а) евтини микроелектронни вериги; б) миниатюризирани „lab-on-a-chip“; в) електронни системи за отчитане на сигнала и г) устройства за обработка на сигнали. Тъй като електрохимичните биосензори са чувствителни, лесни за миниатюризиране, изискват малки обеми от аналита, имат по-добра граница на детектиране на аналита и предоставят бързи резултати, те са най-предпочитани в медицинската диагностика и много други изследователски области, включително безопасност на храните и мониторинг на околната среда [8].

Електрохимичният биосензор може да бъде категоризиран въз основа на видовете трансдуктори, използвани за измерване на сигнала. Те включват кондуктометрични, амперометрични и потенциометрични трансдукторни платформи. Общият принцип на електрохимичния (био-електрохимичния) биосенсинг се основава на електрохимичния отговор, протичащ върху или в близост до електрода и/или между електродите. Това води до формирането на: (i) измерим токов сигнал (амперометричен), (ii) кумулативен заряд или потенциал (потенциометричен), или (iii) промени в проводимостта на средата (кондуктометричен). [8].

Фигура 7. Класификация на електрохимичните биосензори в зависимост от типа на трансдуктора и видовете сигнал.

Електрохимичните нанобиосензори могат да се използват и за идентифициране на вирусни нуклеинови киселини. Разработен е електрохимичен геносензор за детектиране на SARS. Той използва монослой от тиолирани олигонуклеотиди, самосглобени върху въглеродни електроди, покрити със златни наночастици. Олигонуклеотидните последователности са специфични за нуклеокапсидния протеин на SARS и детектирането на вирусната инфекция се осъществява чрез ензимна амплификация на вирусна ДНК. Нанобиосензорът спомага за осъществяване на високочувствителна детекция на SARS. Проектиран е електрохимичен нанобиосензор за детектиране на MERS-CoV, който използва въглероден електрод, покрит със златни наночастици и рекомбинантен шипчест протеин S1 като биомаркер. Този подход е обещаващ за детектиране и на други коронавируси. Биосензорът е създаден с помощта на флуор-легиран субстрат и златни наночастици, амплифициращи сигнала благодарение на значителната им електрическа проводимост. [10].

Модифицирането на електрохимични сензори със златни наночастици (AuNP) показва подобрени свойства на сензора. Такива сензори могат да бъдат използвани за детектиране на MERS-CoV. AuNP притежават електрокаталитични свойства и позволяват амплификация на електричния сигнал (Фигура 8). Проектиран е имуносензор, детектиращ вируса MERS-CoV, който свързва перспективата на електрохимичните сензори и златните наночастици. Нанобиосензорът е изграден от въглеродни електроди, покрити със златни наночастици.

Фигура 8. Операционни стъпки на COVID-19 електрохимична сенсинг платформа: (A) Вземане на проба от носа или слюнката, (B) РНК екстракция, (C) имобилизиране на РНК върху графен-евДНК-AuNP платформа, (D) инкубиране за 5 min и (E) отчитане на електрохимичния сигнал.

При този имуносензор, рекомбинантният шипчест белтък (S1) бива имобилизиран върху златни наночастици. Имобилизирания S1 се конкурира с вирусните частици в пробата за свързване към антитялото (добавено в минимални количества към пробата). Когато отсъства вирусна инфекция, антитялото се свързва към имобилизирания шипчест белтък. Тъй като този сензор съдържа много електроди, той позволява мултиплексна детекция на различни коронавируси [5, 10].

 Електрохимично детектиране на SARS-CoV-2 с графенови сензори

Електрохимичните трансдукторни платформи могат да детектират вируси и други патогенни микроорганизми, използвайки техните специфични елементи за биоразпознаване. Има няколко алтернативни начина за електрохимична детекция на болестотворни микроорганизми. Въпреки това, детектирането на генетични маркери чрез електрохимични сензорни платформи не е чувствителен метод за детектиране на вируси, поради недетектируемите вирусни титри, особено в началото на вирусните инфекции [8, 14].

През последните години са направени няколко опита за прилагане на стратегии, подобни на електрохимичните глюкомери, за детектиране на вируси или вирусни инфекции. Torrente-Rodríguez et al. разработиха евтин графенов преносим електрохимичен биосензор за бърза диагностика и биохимичен мониторинг на COVID-19 от проби от серум и слюнка [8, 14].

Електродите на електрохимичния сензор са изградени от графен, гравиран върху гъвкав полиимиден (PI) полимерен субстрат за мултиплексна детекция на вирусни инфекциозни биомаркери (антигени и антитела). Авторите демонстрират количествено детектиране на специфични за COVID-19 биомаркери в кръв и слюнка, като например шипчестия белтък на SARS-CoV-2 (S1), нуклеокапсидния белтък на SARS (NP), специфични имуноглобулини срещу SARS-CoV-2 шипчестия белтък (S1-IgM и S1-IgG), както и неспецифичния C-реактивен протеин (CRP). Детектирането се осъществява във физиологично значими граници. Тази платформа има мултиплекс капацитет за детектиране на няколко SARS-CoV-2 маркера. Получените резултати се предават безжично към преносимо мобилно устройство. Този тип миниатюризирана електрохимична платформа показва голям капацитет за използването и в бъдещи PoC електрохимични устройства и системи за персонализирана медицина [8, 14].

3.1.2. Оптични нанобиосензори

Благодарение на изключителните характеристики на оптичните биосензори, като висока чувствителност, това че са свободни от маркер (т.е. целевите молекули не са белязани от определено вещество), здравина, устойчивост на електромагнитни смущения, изчислими оптични данни, податливи на миниатюризация, възможности за интегриране, портативни, с мултиплексен капацитет и осигуряване на едновременна детекция на различни цели, оптичните биосензори се използват като диагностични инструменти за респираторни вирусни инфекции. Поради това оптичните биосензори са подходящи за използване извън лабораториите [9, 10].

Фигура 9. Безжична графен-базирана телемедицинска платформа (SARS-CoV-2 RapidPlex) за бързо и мултиплексно електрохимично детектиране на SARS-CoV-2 в кръв и слюнка (A) Схема на SARS-CoV-2 RapidPlex мултисензорна телемедицинска платформа за детектиране на SARS-CoV-2 вирусни белтъци, антитела (IgG и IgM) и възпалителен биомаркер С-реактивен протеин (CRP). Данните могат да се предават безжично към мобилен потребителски интерфейс. WE, работен електрод; CE, противоелектрод; RE, референтен електрод. (B) Масово произвеждани лазерно гравирани графенови сензори. (C) Снимка на гъвкав графенов сензор за еднократна употреба. (D) Изображение на SARS-CoV-2 RapidPlex система с графенов сензор, свързана към платка за обработване на сигнала и безжична комуникация.

Въглеродните нанотръби, златните наноострови и графенът се използват основно в оптични и електрохимични биосензори. Златни наноострови, направени от малки златни наноструктури, могат да бъдат конструирани с изкуствено синтезирани ДНК рецептори и комплементарни РНК последователности на SARS-CoV-2 върху стъклен субстрат. Тъй като COVID-19 е едноверижен РНК вирус, рецепторът на нанобиосензора действа като комплементарна последователност на РНК секвенцията на коронавируса и по този начин детектира вируса. За детектиране на РНК секвенция, свързваща се към сензора се използва LSPR (локализиран повърхностен плазмонен резонанс). След свързване на молекулите на повърхността на нанобиосензора, локалният инфрачервен индекс се променя, оптичния нанобиосензор изчислява промените и определя наличието на РНК вериги [9, 10].

Демонстрирано е високоефективно детектиране на SARS-CoV-2 с оптичен биосензор, комбинирано с повърхностен плазмонен резонанс и флуоресценция. Когато оптичен биосензор бива комбиниран с метода на повърхностния плазмонен резонанс, се получава технология за бърза диагностика на SARS инфекции. Тази техника е по-предпочитана дори от ензимно-свързания имуносорбентен анализ (ELISA). Биосензор с оптични влакна, базиран на локализиран повърхностен плазмонен резонанс и комбиниран с флуоресценция (LSPCF), може да детектира рекомбинантен N белтък (SARS-CoV-N), използвайки AuNP. Чрез този метод може да бъде детектиран вирусен товар от 106 частици/mL в рамките на 15 минути. Тези проучвания показват, че вирусните респираторни инфекции могат да бъдат диагностицирани бързо чрез използване на биосензори с наноматериали [9].

Фигура 10. Схема на оптичен биосензор

3.1.3. Графенови биосензори

Графеново FET (полеви транзистор) устройство се използва за определяне на вирусния товар на SARS-CoV-2 в назофарингеални проби на пациенти с COVID-19. Графеновият FET нанобиосензор се състои от субстрат от SiO2/Si, покрит с графен, представляващ сенсинг зоната. Върху графеновото покритие е имобилизирано антитяло, свързващо SARS-CoV-2 шипчестия белтък. Тези биосензори спомагат за детектиране на шипчестия SARS-CoV-2 антиген във фосфатен буфер, дори при концентрация от 1 fg/mL [10].

Графеновите биосензори са ценни за тестване и детектиране на [9]:

• кръвна глюкоза;
• респираторна честота;
• телесна температура в реално време;
• кръвно налягане;
• вируси;
• малки молекули.

Поради рентабилността, високия афинитет и лесното им производство, графеновите наноматериали са едни от най-предпочитаните материали за биосензори. Например, транзисторен биосензор е успешно разработен за откриване на SARS-CoV-2 (шипчест белтък). Биосензорът е произведен от полеви транзистор (FET), покрит с графен. Върху графена е имобилизирано специфично антитяло (Фигура 9). Графенът и неговите производни показват добри резултати при улавянето на вируси. Тези устройства за бисенсинг имат предимства пред другите диагностични методи, налични в момента [9].

Базираните на FET биосензорни устройства могат да правят чувствителни и мигновени измервания, използвайки малки количества аналит. Освен това, FET биосензорите могат да бъдат полезни в клиничната диагностика и в тестването на пациенти на място, извън лабораториите. Създадена е неамплифицираща и бърза наносенсинг платформа за детектиране на РНК на SARS-CoV-2 във фарингеални проби. Проектиран е графенов FET (G-FET) сензор, към който са добавени златни наночастици (AuNP). Върху повърхностите на AuNPs са имобилизирани комплементарни фосфородиамидат морфолино олиго (PMO) сонди. Този сензор излъчва нисък фонов сигнал, тъй като PMO е силно чувствителен към SARS-CoV-2 RdRp. Когато графенов полеви транзистор е се комбинира с CRISPR-Cas9 биосензор, той може да детектира неамплифицирани таргетни гени и по този начин може да бъде използван за детектиране на вирусини таргети, като например нуклеиновите киселини на SARS-CoV-2 [9].

3.1.4. Хирални нанобиосензори

Хиралните биосензори скоро ще станат изключително популярни в областта на бионанотехнологиите поради тяхната ултра-чувствителност и бързо време на действие. Те могат да бъдат инструмент за справяне с пандемията от SARS-CoV-2. Популярността на хиралната нано-оптика нараства поради новите методи за производство на метални наноструктури с променлива повърхностна морфология. Това предлага безпрецедентен контрол върху техните електронни и оптични свойства. Най-важното предимство на такива нанохибридни структури е, че те подобряват хироптичния отговор, който може да бъде от значителен интерес в различни приложения, свързани с хиралния биосенсинг, позволявайки приложението им в нови научни области. В сравнение с естествените хирални молекули, хиралните плазмонни наноструктури не само, че имат значителни хироптични ефекти, но също така въвеждат изцяло нова концепция за суперхирална светлина в технологичните приложения [2, 5].

Фигура 11. Детектиране на SARS-CoV-2 с помощта на FET: Схемата показва вземане на биологични проби от пациент и тяхното поставяне в графеновата сензорна зона на FET биосензор. Свързването на SAR-CoV-2 вируса бива детектирано от сензора в реално време.

Ahmed et al. разработват хирален имуносензор, използващ златни наночастици и квантови точки. При него циркониеви квантови точки и магнитни наночастици биват конюгирани със специфични за коронавируса антитела, след което биват смесени. В присъствието на вируса, както квантовите точки, така и наночастиците ще се свържат към вирусната мишена и ще се получат магнитни плазмонни-флуоресцентни нанохибриди, които могат да бъдат разделени от магнит. След това, концентрацията на аналита може да се определи чрез изчисляване на флуоресценцията на отделените нанохибриди. Този сенсинг процес има граница на детектиране от 79,15 EID/50 μl [2, 5, 10].

3.1.5. Аптамерни биосензори

Благодарение на надеждния скрининг метод, аптамерите могат да детектират вирусни гени, белтъци или други маркери на вирусна инфекция. Променяйки вече разработените анализи, аптамерните сензори могат да разграничат инфектирани и неинфектирани клетки или активни и неактивни вирусни форми. Поради своите свойства, аптамерната детекция има значителни предимства пред антителата, включително висока устойчивост на широк диапазон от температури, лесен синтез чрез систематично модифициране на лиганди чрез метод на експоненциално обогатяване (SELEX) и лесна трансформация според нуждите на анализа [4].

Фигура 12. Детектиране на SARS-CoV и SARS-CoV-2 чрез аптамерни биосензори.

Биосензорите използват антитяло- и аптамер-базирани механизми за детекция. Аптамерите са по-трайни, по-достъпни и по-бързи за синтез от антителата. Аптамерите, известни също като „химични антитела“ или „изкуствени антитела“, често биват сравнявани с антителата по отношение на тяхната специфичност спрямо мишената. Някои аптамери биват използвани в SARS-CoV-2 детекцията като се инкорпорират в аптасенсинг платформи [7].

Аптамерите са олигонуклеотидни секвенции, които могат ба бъдат разработени така, че да разпознават и да се свързват специфично с различни молекули:

• малки молекули като аминокиселини, нуклеотиди и антибиотици;
• макромолекули като нуклеинови киселини и белтъци;
• повърхностни епитопи на вируси, бактерии и други клетки

Аптамерите формират уникални триизмерни (3D) структури, свързвайки се специфично към аналитите. Те могат да бъдат бързо моделирани и стабилно имобилизирани върху повърхността на биосензорите. Аптамерните биосензори (аптасензори) могат да детектират количествено целеви аналити чрез изчисляване на сигнала, получен от химични и/или биохимични повърхностни взаимодействия. Аптамерите се считат за обещаващ диагностичен инструмент за детектиране на вируси [7].

Аптасензорите представляват аптамер-базирани биосензори, предназначени да изследват и определят количествено таргетни биомолекули чрез определени биохимични реакции, при които се генерира количествено измерим сигнал. Взаимодействието на специфични аптамери с целеви биомолекули представлява механизма на свързване и биоразпознаване, което е съпроводено с отделянето на пропорционален сигнал. Аптасензорите за детектиране на SARS-CoV-2 могат да бъдат разделени в две категории въз основа на естеството на отделения сигнал: оптични и електрохимични аптасензори [7].

3.2. „Point-of-Care“ Тестване

„Point-of-Care“ тестването, дефинирано от Центъра за контрол и превенция на заболяванията, представлява „диагностични тестове, извършвани на или близо до мястото, където е взета пробата, при които се предоставят резултати в рамките на минути, а не часове. Това може да бъдат тестове, при които се амплифицират нуцелинови киселини (NAAT), тестове за детекция на антигени или антитела.“ [18].

Пазарът за „Point-of-Care“ тестване на инфекциозни заболявания (POCT) представлява обещаващ и значителен растеж в глобалната in vitro диагностика (IVD). Нарастващото разпространение на вируса на човешката имунна недостатъчност (HIV), туберкулозата (TB), маларията в развиващите се страни и опасността от възникващи и повторно появяващи се инфекциозни заболявания като респираторния синдром от Близкия изток (MERS), тежък остър респираторен синдром (SARS), ZIKA, различни щамове на грипния вирус и вирусът на Западно нилската треска са фактори, които повишават нуждата от POCT [6].

Инфекциозните заболявания представляват сериозна заплаха за човешкото здраве и водят до повече от половината смъртни случаи в света. Освен това, широко разпространените инфекциозни заболявания непрекъснато увеличават смъртността в развиващите се страни. Най-ефективният начин за ограничаване на епидемията е ранната диагностика, което представлява предизвикателство за използваните досега подходи, поради скъпото оборудване, необходимостта от специалисти и бавното получаване на резултати. Поради това бързите POCT методи са от съществено значение за преодоляване на тези пречки чрез миниатюризиране и намаляване на разходите за оборудване, както и предоставяне на достъпни, бързи и лесни за употреба диагностични тестове без специализирано обучение [6].

PoC тестването позволява диагностициране на инфектирани индивиди, без да е необходимо изпращане на проби от пациенти в лабораториите. Това е изключително важно за населени места или жители, които нямат подходяща лабораторна инфраструктура за анализиране на проби. Съществената част от PoC тестването е биосензорът, който се използва за постигане на биохимична реакция, с цел детекция на патогена.

Предимствата за използването на PoC тестове са [4]:

1. минимално пространство за тестване и съхранение;
2. широкомащабни анализи;

• тестването може да се извърши на различни места;

1. могат да бъдат адаптирани за различни медицински нужди.

Фигура 13. Схематична илюстрация на количествена оценка на SARS-CoV-2 с помощта на SARS аптасензор. (a) След като лизатите на SARS-CoV-2 освободят таргетните шипчести белтъци, те се разпознават от аптамерните ДНК, разположени върху повърхността на Au наноструктури. Свързаните с S белтъка аптамери се отделят от повърхността на Au наноструктури, което води до понижаване на интензитета на Raman пика на Cy3 репортерите. (b) Cy3-маркирани аптамерни ДНК молекули хибридизират с ДНК върху Au наносубстрат. Вътрешните стандартни 4-MBA са имобилизирани заедно с аптамерни ДНКи върху Au наносубстрат. (c) Разпознаването на SARS-CoV-2 S белтъка индуцира конформационна промяна на аптамерните ДНКи, което позволява на аптамерните ДНКи да се свържат с RBD на шипчестия белтък.

Едни от най-атрактивните POCT са тези, които се базират на колометричните биосензори, тъй като те позволяват детектиране на аналита чрез промени в цвета, които могат да бъдат наблюдавани с невъоръжено око [5].

Фигура 14: Колориметрична детекция на вируси, базирана на наночастици. Тази фигура изобразява механизма, при който вирусът агрегира с наночастиците, което води до промяна на цвета от червено в лилаво.

Kim et al. създават колориметричен анализ, използващ златни наночастици, за детектиране на вируса MERS-CoV. Този анализ използва две модифицирани с тиол сонди и златни наночастици (AuNPs), покрити с цитрат и потопени в положителен електролит (напр. 0,1 М MgCl2) [5, 6].

Колориметричният тест, базиран на златни наночастици, представлява разтвор на златни наночастици, който свързват вируса, което води до видима промяна на цвета в течността. Това позволява бърза детекция на COVID-19 чрез промяна на цвета на разтвора на златните наночастици. Този евтин тест действа много по-добре от другите диагностични техники, подобни на стандартните PCR тестове. Основното предимство на този тест е, че разтворът на златните наночастици показва специфични цветове, защото абсорбира определена дължина на вълната. Към златните наночастици се добавя пробата, съдържаща SARS-CoV-2, което води до свързване на вируса. Това вода до промяна в абсорбцията и промяна на цвета на разтвора. Тази промяна в цвета може да бъде наблюдавана с невъоръжено око. Недостатъкът на този метод е, че той е осъществим само когато вирусния товар е много висок [12].

Сондите са конюгирани със AuNPs чрез силни Au-S връзки. Хибридизирането на целевите ДНКи с едноверижните ДНКи на повърхността на златните наночастици, води формиране на двойноверижна ДНК, агрегиране на златните наночастици в електролита, водещо до промяна в оптичните свойства на AuNP [5, 6].

TПотенциалната детекционна граница на този анализ е 1 pmol μl-1, което позволява детектиране на по-ниски количества от целевия вирус. Освен това, използването на такъв тип колориметричен анализ позволява евтина и бърза диагностика на заболяването без необходимост от сложни инструменти [5].

3.3. Нанопорово целево секвениране (NTS)

Доказано е, че нанопоровият метагеномен метод (NTS) ефективно детектира бактериални респираторни инфекции и вируси от клинични проби. Патогените и гените за резистентност към антибиотици могат да бъдат разпознати за няколко часа, много по-бързо от конвенционалните методи на култивиране. Нанопоровото секвениране генерира резултати в реално време. Освен това, нанопоровото секвениране може да бъде използвано за транскриптомно характеризиране на отделни секвенции или цели коронавирусни генонми РНКи. Методът NTS открива едновременно SARS-CoV-2 и десет други респираторни вируса само за 6–10 часа. Поради това, той е подходящ за текущата диагностика на COVID-19. Въпреки това, границата на детектиране може да бъде разширена за диагностициране и на други вируси и патогени. NTS се основава на амплифициране на 11 SARS-CoV-2 вирулентни и уникални генни фрагменти (напр. orf1ab) чрез вътрешен първичен панел, последвано от секвениране на амплифицирания фрагмент върху нанопорова платформа. Този проект използва нанопорова платформа за секвениране, която може да секвенира дълги фрагменти от нуклеинови киселини и едновременно с това да анализира изходните данни в реално време. Това позволява потвърждаване на SARS-CoV-2 инфекциите в рамките на минути след секвенирането, чрез картиране на прочетените секвенции към генома на SARS-CoV-2 и анализиране на идентичността и валидността на изходната секвенция [16, 17].

4. Предизвикателства и ограничения на нанотехнологиите в COVID-19 детекцията

Системите, базирани на нанотехнологии, въпреки предимствата си, срещат множество предизвикателства преди да бъдат безопасно представени на пазара. Най-честите проблеми са:

• Мащабируемост и производствени разходи;
• Интелектуална собственост;
• Потенциална токсичност и въздействие върху околната среда.

Преди нанотехнологиите да бъдат широко приети в системата на здравеопазването, трябва да бъдат решени някои проблеми, свързани с тяхното приложение. Основната задача ще бъде да се гарантира безопасността на наноматериалите чрез in vitro изследвания на тяхната биосъвместимост. Съдбата на наноматериалите в тялото може да се промени, когато те навлязат в кръвообращението поради образуването на т.нар. белтъчна корона. Следователно, изследванията in vivo трябва да бъдат извършвани внимателно, за да бъде опозната по-добре токсичността на наночастиците в тялото. Поради тези ограничения са използвани общи протоколи за категоризиране на ранен етап от научноизследователската и развойна дейност, които минимизират шансовете за неуспехи по отношение на клиничния подход в терапия, базирана на нанотехнологии. Необходимо е по-тясно сътрудничество между регулаторните агенции, експертите в науката, фармакологията и токсикологията, за да бъдат преодолени другите ограничения [10].

---

Тест LO 3.2

---

Литература

1. Abdelhamid H., and Badr G.
2. (2021). Nanobiotechnology as a platform for the diagnosis of COVID‐19: a review. Nanotechnology for Environmental Engineering 6:19 https://doi.org/10.1007/s41204-021-00109-0.
3. Ahmed SR., Nagy É., and Neethirajan S. (2017). Self-assembled star-shaped chiroplasmonic gold nanoparticles for an ultrasensitive chiro- immunosensor for viruses RSC Adv. 7 40849–57
4. Alhalaili B., Popescu I.N., Kamoun O., Alzubi F., Alawadhia S., Vidu R. (2020). Nanobiosensors for the detection of novel coronavirus 2019-nCoV and other pandemic/Epidemic Respiratory viruses: A review. Sensors, 20, 6591.
5. Gupta R., Sagar P., Priyadarshi N., Kaul S., Sandhir R., Rishi V. and Singhal N.K. (2020). Nanotechnology-Based Approaches for the Detection of SARS-CoV-2. Front. Nanotechnol. 2:589832. doi: 10.3389/fnano.2020.589832
6. Jindal S., and Gopinath P. (2020). Nano Ex. 1 022003
7. Kim H.,Park M.,Hwang J.,Kim J.H., Chung D-R., Lee Kand Kang M. (2019). Development of label-free colorimetric assay for MERS-CoV using gold nanoparticles ACS Sens.
8. Mandal M., Dutta N., and Dutta G. (2021). Aptamer-based biosensors and their implications in COVID-19 diagnosis. Anal. Methods, 2021, 13, 5400
9. Ozmen E., Kartal E., Turan M., Yazicioglu A., Hiazi J., and Qureshi A. (2021). Graphene and carbon nanotubes interfaced electrochemical nanobiosensors for the detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) and other respiratory viral infections: A review. Materials Science & Engineering C 129 (2021) 112356
10. Pradhan A., Lahare P., Sinha P., Singh N., Gupta B., Kuca K., Ghosh K.K., Krejcar O. (2021). Biosensors as Nano-Analytical Tools for COVID-19 Detection. Sensors 2021, 21,7823. https://doi.org/10.3390/ s21237823
11. Rai M., Bonde S., Yadav A., Bhowmik A., Rathod S., Ingle P., Gade A. (2021). Nanotechnology as a Shield against COVID-19: Current Advancement and Limitations. Viruses 2021,13,1224. https:// doi.org/10.3390/v13071224
12. Satvekar R. (2021). Electrochemical nanobiosensors perspectives for COVID 19 pandemic.  J. Electrochem. Sci. Eng. 00(0) (2021) 000-000; http://dx.doi.org/10.5599/jese.1116
13. Tavakol S., Zahmatkeshan M., Mohammadinejad R., Mehrzadi S., Joghataei M., Alavijeh M., Seifalian A. (2021). The role of nanotechnology in current COVID-19 outbreak. Heliyon 7, e06841
14. Thevenot D.R., Toth K., Durst R.A., Wilson G.S., Biosens. (2001). Bioelectron. 16:121–131.
15. Torrente-Rodríguez R.M., Lukas H., Tu J., Min J., Yang Y., Xu C., Rossiter H.B., Gao W., (2020). Matter. 3: 1981–1998.
16. Varghese R., Salvi S., Sood P., Karsiya J., Kumar D. (2021). Carbon nanotubes in COVID-19: A critical review and prospects. Colloid and Interface Science Communications 46: 100544
17. Wang M., Fu A., Hu B., Tong Y., Liu R., et al. (2020). Nanopore target sequencing for accurate and comprehensive detection of SARS-CoV-2 and other respiratory viruses. medRxiv.
18. Waris A., Ali M., Khan AU., Ali A. (2020). Baset A. Role of nanotechnology in diagnosing and treating COVID-19 during the Pandemic. Int J Clin Virol. 2020; 4: 065-070.
19. https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/point-of-care-testing.html