Терапии срещу COVID-19: приложения на нанотехнологиите за разработване на антивирусни препарати и ваксини

Резюме

SARS-CoV-2 (коронавирус тип 2, причиняващ тежък остър респираторен синдром) е причинителят на заболяването, известно като COVID-19. Заразяването със SARS-CoV-2 обикновено е свързано с развитие на леко до умерено изразена респираторна симптоматика, но част от пациентите може да се нуждаят от хоспитализация и, понякога, от интензивно лечение. Консервативната терапия при COVID-19 се основава на използване на комбинация от кортикостероиди, антикоагуланти или антиагреганти и, при развитие на бактериална пневмония, антибиотици. Разработени са няколко типа специализирани терапии за COVID-19 (антивирусни агенти, моноклонални антитела, и други), които могат да се използват под формата на пре-експозиционна профилактика или като лечение на ранните етапи на инфекцията при пациенти, за които има висок риск от възникване на усложнения. Съвременните нанотехнологии предлагат редица високотехнологични решения за целите на превенцията на заразяването, диагностиката и пост-експозиционната профилактика, както и ефективно лечение в случаите, когато COVID-19 и неговите усложнения вече са се развили. Базираните на наноматериали сензори, лекарства и ваксини имат потенциал да играят важна роля в управлението на пандемията от COVID-19 в недалечното бъдеще.

Ключови думи/фрази: COVID-19, антивирусни агенти, моноклонални антитела, ваксини, нанотехнологии

1. Ваксини и лекарства за лечение на COVID-19 – общи сведения

1.1. SARS-CoV-2 и COVID-19 – преглед на етиологията, патогенезата и потенциалните подходи за намаляване на усложненията след прекаран COVID-19

На 31 декември 2019 г. Световната здравна организация (СЗО) беше информирана за бързо увеличаване на броя случаи в град Ухан, Китай на пневмония с причинител, който по това време все още не беше известен. Причинителят беше идентифициран от местните здравни власти на 7 януари 2020 г. като непознат до този момент досега представител на семейството на бета-коронавирусите.

SARS-CoV-2 (коронавирус тип 2, предизвикващ тежък остър респираторен синдром) причинява инфекциозно заболяване, наречено COVID-19 (съкратено от Coronavirus Disease of 2019). В повечето случаи инфекцията със SARS-CoV-2 е свързана с развитие на лека до умерена клинична картина, включваща едно или повече от следните сипмтоми и признаци: астеноадинамия, хрема, кашлица, главоболие, ставни и мускулни болки, коремна болка, диария и други. В повечето случаи възстановяването е спонтанно, в рамките на няколко дни до две седмици. Някои пациенти обаче могат да развият синдром на остър респираторен дистрес (acute respiratory distress, ARDS) и прогресираща дихателна недостатъчност. В сравнение със сходните по протичане SARS (тежък респираторен синдром) и MERS (близкоизточен респираторен синдром), COVID-19 обикновено предизвиква по-леки клинични симптоми и води до по-ниска смъртност. Въпреки това, на практика всеки може да се зарази и да умре от SARS-CoV-2, независимо от пола и възрастта (макар че рискът от смърт е по-висок при мъжете и децата, както и възрастните с тежки предходни заболявания).

1.2 Патогенетични механизми

 

Подобно на повечето коронавируси, SARS-CoV-2 навлиза в клетката чрез ендоцитоза, използвайки като входна врата мембранно-свързаната форма на ангиотензин-конвертиращия ензим тип 2 (angiotensin-converting enzyme 2, ACE2, популярно наричана ACE2 рецептор). Процесът се осъществява посредством свързване на рецептор-свързващия домен (receptor-binding domain, RSD) на белтъка S (spike, шипов) към ACE2 рецептора на прицелната клетка [67]. След навлизането си в клетката, вирусът „съблича” белтъчната си обвивка и освобождава вирусната нуклеинова киселина. Геномът на SARS-CoV-2 представлява плюс-сенс едноверижна РНК, която бива транслирана до два полипротеина. От последните чрез хидролиза се генерират 16 неструктурни белтъка, които образуват комплекса РНК репликаза-транскриптаза. Той синтезира, от една страна, копия на вирусния геном и, от друга, генерира отворени рамки за четене за синтез на вирусни белтъци. Следва самосглобяване на вирусната РНК със структурните протеини, при което се образуват нови инфекциозни вирусни частици, които се освобождават чрез екзоцитоза [66, 38]. Тъй като генът ACE2, освен в белия дроб, се експресира и в много други тъкани (стомашно-чревния тракт, бъбреците и други [74, 15]), при пациентите с COVID-19, освен белодробното увреждане, често се развиват увреждания и на много други тъкани и органи.

1.3. Патоморфологични и клиниколабораторни особености при пациентите с COVID-19

Основните патоморфологични находки при пациенти с COVID-19 са дифузното увреждане на белодробните алвеоли, патологичните промени в белодробното съдово русло и алвеоларните хеморагии [Pathology of COVID-19: Atlas, 2020]. Друг често срещан тип тъканна увреда при пациентите с COVID-19 е системното възпаление с изразена лимфоцитна и моноцитна инфилтрация, където основни прицелни тъкани са белият дроб и сърцето [22, 38]. Типични лабораторни находки при пациенти с тежко протичащ COVID-19 са лимфопения (въпреки че при някои пациенти може да се наблюдава и лимфоцитоза), тромбоцитопения, повишени нива на прокалцитонина, фибриногена, D-димера, лактатдехидрогеназата, феритина, интерлевкини -2, -7 и -6, моноцитният хемоатрактантен белтък (monocyte chemoattractant protein 1, MCP1), макрофагеалният възпалителен белтък 1-алфа (macrophage inflammatory protein 1-alpha, MIP1-alpha) и тумор-некротизиращият фактор-алфа (tumour necrosis factor (TNF-α). При пациентите с насложена бактeриална инфекция се наблюдават повишени нива на С-реактивния протеин (C-reactive protein, CRP).

1.4. Механизми на предаване на причинителя от човек на човек и методи за превенция на заразяване

Както всички коронавируси, SARS-CoV-2 е нестабилен извън живата клетка, поради което предаването на инфекцията се осъществява при близък контакт със секрети от дихателните пътища на заразено лице. Главният път на разпространение на вируса е въздушно-капковият. Към момента, най-ефективните начини за предотвратяване или поне за забавяне на предаването му от човек на човек са поддържане на безопасна дистанция (над 1,5 м) между хората, самоизолация при проява на симптоми, често миене на ръцете (и/или използване на дезинфектанти за ръце на базата на 70% етанол), редовна дезинфекция на повърхностите и предметите, които често биват докосвани и използване на правилно поставени лицеви маски при пребиваване в закрити пространства. СЗО редовно публикува осъвременени насоки за превенция на инфекция със SARS-CoV-2: https://www.covid19treatmentguidelines.nih.gov/about-the-guidelines/whats-new/

1.5. Прицелни точки за патогенетичното лечение при инфекция със SARS-CoV-2

Геномът на SARS-CoV-2 кодира 4 основни структурни белтъка, а именно: шипов белтък (spike, S), белтък на обвивката (envelope, E), мембранен белтък (membrane, M) и белтък на нуклеокапсида (nucleocapside, N), както и редица други белтъци без структурна функция и спомагателни белтъци. Механизмите на действие на разработваните в момента лекарствени средства са насочени както към вирусната РНК, така и към структурните вирусни белтъци. Най-често използваните в момента агенти с антивирусно действие обикновено са насочени към РНК синтезата (и по-точно, към РНК-зависимата РНК полимераза на вируса), докато моноклоналните антитела са по-често насочени към структурните белтъци.

1.6. Рискови фактори, допринасящи за възникване на усложнения след прекарана инфекция със SARS-CoV-2

Основните непредотвратими рискови фактори за неблагоприятен изход (смърт или трайни увреждания) при пациентите с COVID-19 са мъжкият пол и предходно съществуващи у пациента сериозни хронични заболявания – сърдечно-съдови заболявания, бъбречни заболявания, диабет, хронични респираторни заболявания и неоплазми [51]. Обструктивната сънна апнея е специфичен рисков фактор, който увеличава риска от хоспитализация и дихателна недостатъчност при инфекция със SARS-CoV-2 почти 8 пъти в сравнение с пациентите без обструктивна сънна апнея [36]. В самото начало на пандемията се смяташе, че напредналата възраст е основен рисков фактор за неблагоприятен изход от заболяването. По-късно, обаче, се установи,че наличието на предходно тежко хронично заболяване като рисков фактор за неблагоприятен изход има значително по-голяма тежест от тази на фактора възраст: [https://www.cdc.gov/aging/covid19/covid19-older-adults.html; https://gis.cdc.gov/grasp/COVIDNet/COVID19_5.html].

1.7. Лечение на инфекциите със SARS-CoV-2 и потенциалните им усложнения

1.7.1. Консервативно лечение

При неусложнени случаи на COVID-19 най-подходящият терапевтичен подход е почивка и симптоматично лечение със съпътстващ мониторинг в условия на домашна самоизолация. При около 10-20% от заразените се развиват усложнения, които водят до тежко протичане на заболяването. Те може да се нуждаят от специализирана медицинска помощ и интензивни грижи [https://www.uptodate.com/contents/covid-19-clinical-features]. При усложнените случаи се прилагат стратегиите, заложени в протоколите, издадени специално за тази цел от на СЗО и Центъра за превенция и контрол на заболяванията (Center for Disease prevention and control, CDC) в Атланта, САЩ, както и модифицирани версии на тези протоколи съобразно локалните политики. Тъй като COVID-19 протича със системен възпалителен отговор и активиране на системата на кръвосъсирване, критично важни компоненти от всеки протокол за лечение на усложнени инфекции със SARS-CoV-2 са противовъзпалителната, антикоагулационната и/или антиагрегационна терапия [https://covidprotocols.org/en/chapters/inpatient-management/]. Основа на противовъзпалителната терапия при пациентите с COVID-19 са кортикостероидите, и то най-вече тези с намалена минералкортикоидна активност и дълго действие – напр. дексаметазон. При пациенти с тежка дихателна недостатъчност към него може да се добави кортикостероид с по-краткотрайно действие, напр. метилпреднизолон. Мощното противовъзпалително действие на кортикостероидите обаче, е за сметка на редица нежелани ефекти. Сред тези ефекти най-често срещан е гастроинтестиналното дразнене, поради което обикновено лечението с кортикостероиди е съпроводено с приложение на H2 антагонисти или инхибитори на протонната помпа. Антибиотиците влизат в употреба при пациенти с COVID-19, когато има данни за развитие на вторична бактериална пневмония. Това е често срещано усложнение при пациентите с тежко протичащ COVID-19, тъй като инфекцията води и до значително подтискане на вродения имунитет и общо разрегулиране на имунната сигнализация [76]. Обикновено се използват широкоспектърни антибиотици, като антибиотиците с бактерицидно действие (напр. пеницилини, 4-хинолони и аминогликозиди) обикновено се предпочитат пред тези с бактериостатично действие (напр. макролиди и тетрациклини). При около 2% от заразените пациенти има риск от развитие на прогресивна тежка дихателна недостатъчност. Тези пациенти имат нужда от интензивно лечение [https://www.uptodate.com/contents/covid-19-clinical-features].
По отношение на антикоагулантната терапия, обичайният избор при пациенти с COVID-19 е нискомолекулен хепарин, но понякога се използва нефракциониран хепарин или нови перорални антикоагуланти, както и антиагреганти като аспирин, клопидогрел, дихидропиридамол и други.

1.7.2. Специфично лечение

Множество вещества с антивирусно действие и моноклонални антитела вече са били са изпитвани за потенциална активност срещу SARS-CoV-2. По-голямата част от тях са предходно съществуващи лекарства, които вече са преминали изпитания за безопасност и ефикасност при други заболявания, причинени от вируси с РНК геном. Такива са, например, антивирусните агенти фавипиравир, ремдесивир, комбинацията лопинавир/ритонавир, моноклоналното антитяло тоцилизумаб и други (виж по-долу). Други, като нирматрелвир (компонент от наскоро одобрения от Pfizer комбиниран препарат Paxlovid) и сотровимаб са специално разработени за целите на лечението на COVID-19, въпреки че се основават на базата на други, предходно разработени антивирусни лекарства или моноклонални антитела.

Появата на ваксините срещу SARS-CoV-2 измени съществено стратегията за борба с разпространението на инфекцията, както и прогнозата за изхода от болестта при пациентите, развили COVID-19. Причинителят на COVID-19 беше изолиран към края на 2019 г. [70] и първата геномна секвенция на вируса беше публикувана по-малко от 2 седмици след това [71]. По този начин изследователската общност, клиницистите и фармацевтичната индустрия получиха най-рано необходимите данни за биологията и генетичната изменчивост на SARS-CoV-2. Благодарение на това, те имаха възможността да насочат и обединят усилията си към разработването на ефективно лечение за COVID-19 и ваксини срещу вируса още преди първата вълна от пандемията да се разгърне през м. март и април 2020 г. Първата експериментална ваксина срещу SARS-CoV-2 (Convidecia, разработена от CanSino Biologics) беше одобрена за спешна употреба в Китай в края на юни 2020 г. През следващите няколко месеца около десетина различни ваксинални препарата от векторен, пептиден и иРНК тип и преминаха в ускорени срокове клиничните изпитания и бяха одобрени за употреба при възрастни, а по-късно и при деца. Към 21 декември 2020 г., 14 ваксини срещу SARS-CoV-2 бяха преценени като напълно завършени и още около 10 бяха в процес на разработка или изпитване (напр. EpiVac Corona на изследователския център по вирусология и биотехнология „Вектор“ в Русия), или им предстоеше окончателна оценка (такива бяха, например ваксиналните продукти на BioCubaPharma, CanSinoBio, Sanofi, Clover Pharmaceuticals, както и други). Актуализирана информация за статуса на ваксиналните препарати срещу SARS-Cov-2 могат да се видят на този адрес: Status_COVID_VAX_23Dec2021.pdf (who.int).

Някои ваксинални продукти не достигнаха финалната фаза на разработка или отпаднаха на ниво изпитания. Такава беше, за съжаление, първата ваксина, изцяло базирана на наночастици (зорецимеран на CureVac). Отначало СЗО прецени, че този препарат заслужава внимание, но по-късно заявката за оценка на безопасността и ефективността беше оттеглена от производителя, тъй като експериментално доказаната ефикасност на защита на ваксината срещу симптоматично заболяване се оказа сравнително ниска – под 50% (по-точно, 48%) във всички изследвани в проучването групи. Наистина, същата ваксина демонстрира 100% ефикасност на защита срещу хоспитализация и смърт при изследваните индивиди, но тъй като експерименталната група се състоеше само от 134 индивида, окончателният анализ посочи, че е било необходимо в изследваната група да има поне още 80 допълнителни индивида, за да може да има надеждна оценка на безопасноста и ефикасността [https://www.reuters.com/business/healthcare-pharmaceuticals/curevacs-covid-19-vaccine-misses-efficacy-goal-mass-trial-2021-06-16/]. CureVac прекрати работата си по проекта с разработване на тази ваксина и започна да работи в сътрудничество със Sanofi-GlaxoSmithCline по разработката на друг ваксинален препарат [https://www.reuters.com/business/healthcare-pharmaceuticals/curevac-withdraw-first-generation-covid-19-vaccine-candidate-2021-10-12/]. Към м. януари 2021, в официалните списъци на СЗО се числяха общо 63 ваксини в клиничен стадий на изпитания и още 173 препарата в преклиничен стадий на разработка.

2. Нанотехнологични решения за превенция на инфекции със SARS-CoV-2 и лечение на COVID-19

Според актуалната дефиниция на Центъра за контрол на заболяванията в Атланта, САЩ, нанотехнологиите представляват: „…манипулиране на материята на ниво отделни атоми с цел производство на нови структури, материали и устройства… чрез използване на материали, изградени от частици с размер в диапазона 1 – 100 нанометра… при който размер материалите проявяват уникални свойства, които влияят на [тяхното] физично, химично и биологично поведение”: https://www.cdc.gov/niosh/topics/nanotech/default.html#:~:text=Nanotechnology%20is%20the%20manipulation%20of,new%20structures%2C%20materials%20and%20devices.&text=Nanotechnology%20refers%20to%20engineered%20structures,between%201%20and%20100%20nanometers. Наноматериалите показват добра разтворимост в биологични течности и високо съотношение повърхност/обем. Това им позволява да бъдат използвани като носители на лекарствени вещества. Тъй като взаимодействат добре с биологичните мембрани, те осигуряват възможност за по-добър контрол върху отделянето на съдържащото се в тях лекарствено средство в сравнение с класическите фармацевтични продукти.

SARS-CoV-2 е вирус със среден размер (60-140 nm, средно 100 nm) и, съответно, попада в диапазона на размери, обхванат от дефиницията на наноматериалите. Съвременните нанотехнологии предлагат разнообразие от високотехнологични решения за целите на превенцията на инфекции (дизайн и производство на ефективни лични предпазни средства (ЛПС), разработване на ваксини, на лекарства за предекспозиционна профилактика и др.); за диагностика (откриване на вируса в биологични проби и проби от околната среда, като напр. смивки, отривки, отпечатъци и пр.); за управление на ранните етапи на инфекцията (постекспозиционна профилактика), както и ефективни лечения в случаите, когато заболяването, свързано със SARS-CoV-2, вече се е развило. Към момента има всички основания да се очаква, че базираните на наноматериали сензори, лекарства и ваксини ще играят критична роля в управлението на пандемията в близко бъдеще [52, 41].

Към днешна дата са разработени редица нанотехнологични решения за детекция на SARS-CoV2, ограничаване на разпространението на инфекцията, за подобряване на ефективността на лекарствата и ваксините. Подробен преглед на разнообразието на наноматериали и техните приложения може да се види тук: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8308319/table/nanomaterials-11-01788-t001/?report=objectonly

2.1. Приложение на нанотехнологиите за превенция на заразяване със SARS-CoV-2

Сериозният инфекциозен потенциал на SARS-CoV-2 беше открит още при ранните му варианти в самото начало на пандемията. Впоследствие, обаче, по-късните варианти Делта и Омикрон определено надминаха очакванията по отношение на капацитета си за разпространение [https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/science/science-briefs/sars-cov-2-transmission.html]. Най-голям инфекциозен потенциал имат вирусните частици на SARS-CoV-2, които се съдържа във фините капчици секрет, отделящи от инфектирания индивид когато той говори, кашля и киха, тъй като те могат да попаднат директно в дихателните пътища на други индивиди. По-едрите капки (които, естествено, също съдържат вирусни частици) също имат висок инфекциозен потенциал, когато се намират върху повърхности и предмети, които често се докосват [https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/variants/omicron-variant.html].

Рутинното защитно облекло и оборудване (платнени, марлени и хирургически лицеви маски, респиратори, престилки, ръкавици и пр.) е доказало ефективността си при използване за защита от заразяване с други често срещани заболявания, предавани по въздушно-капков път (грип, варицела и други). Вирусната частица на SARS-CoV-2, обаче, прониква лесно през обичайните предпазни средства. Поради това се положиха много усилия за разработването на нови или модифицирани видове ЛПС и именно поради размера на вируса се наложи използването на нанотехнологии. Бяха разработени нови материали за изготвяне на нановлакна и фино омрежени тъкани от нановлакна (наномрежи) за изготвяне на защитни лицеви маски за медицинския персонал и екипите, оказващи доболнична помощ. Лицевите маски с висока ефективност на предпазване от SARS-CoV-2 (покриващи изискванията на стандарт FFP2, FFP3 и N95) използват комбинация от наномрежа и електростатичен заряд, които дават висока степен на защита от по-големите капки секрет от дихателните пътища [9]. Стандартните FFP маски се изработват чрез 3D принтиране, за да прилягат плътно към лицето на потребителя. Някои от тях имат формован накрайник за нос за създаване на херметично уплътнение между лицето и маската. Според изискванията, които маските с висока ефективност за предпазване от по-големи капки (>0,3 μm) трябва да покриват, за да могат да бъдат пуснати на пазара, процентът на филтрирани капки трябва да бъде най-малко 78% за маските стандарт FFP1, 92% за FFP2 и 98% за FFP3 [https://www.protectivemasksdirect.co.uk/ffp3-masks-hse-guidance].

Допълнително повишаване на филтрационната ефективност може да се осигури чрез импрегниране на слоевете на маската със съединения с антимикробно и антивирусно действие. Към момента успешно за тази цел са използвани наночастици от сребърен и меден оксид, както самостоятелно, така и натоварени с други вещества с бактерицидно и/или вирусоцидно действие (напр. йод) [6, 1].

Тъй като маските с висока степен на филтрация са скъпи, осигурена е възможност за многократното им използване след почистване чрез специални нанопокрития (силициеви, графенови и други), които дават възможност за почистване на филтъра[14, 75].

Вирусните частици проникват през порите на филтъра на маската. Размерът на порите във филтъра може да бъде намален допълнително чрез импрегниране с полимери – напр. ß-циклодекстрин. Трябва да се отбележи обаче, че докато безопасността за носителя на маската е от решаващо значение, една абсолютно плътно прилягаща лицева маска за лице с минимален размер на порите в действителност може, парадоксално, да доведе до повишаване на риска от заразяване поради създаване на дискомфорт на потребителя. Стандартните хирургически маски и респиратори се характеризират със сравнително ниска пропускливост за въздух, вследствие на което потребителят сравнително бързо започва да изпитва дискомфорт и започва да придърпва, разхлабва и намества маската. Съвременните нановлакна създават фина мрежа с отлична въздушна пропускливост, подобрявайки ефективността на филтрацията на маските.

Нанотехнологии се използват и за производството на медицински ръкавици и други бариерни ЛПС. Специално внимание заслужават ръкавиците, импрегнирани със сребърни наночастици, които имат както бактерициден, така и вирусоциден ефект.

През 2021 г. беше направено едно интересно предложение за разработка на ЛПС, базирано на нанотехнологии – улавяне и секвестриране на вирусни частици чрез лиганд-рецепторно взаимодействие, основано на патогенетичния механизъм на навлизане на SARS-CoV-2 в клетката. По-точно, предложението беше филтрите на лицевите маски, ръкавиците и другите ЛПС, използвани от медицинския персонал да бъдат импрегнирани с ACE2-рецептор, изготвен с помощта на рекомбинантни ДНК технологии (които също са, по същество, нанотехнологии). По този начин вирусните частици, които са преодолели чисто бариерната функция на защитните средства биха се свързали с изкуствения АСЕ2 рецептор и по този начин рискът от заразяване би бил сведен до минимум [2]. Публикуването на пълните резултати от това проучване, обаче, тепърва предстои.

SARS-CoV-2 е вирус с липидна обвивка, както и грипният вирус, HCV, HBV и HIV. Поради това, най-често използваните в момента дезинфектанти за ръце и повърхности са на базата на етанол или 2-изопропанол. Счита се, че концентрацията на етанол, която напълно инактивира вируса, е над 35 % v/v [44]. Етанолът и изопропанолът обаче са летливи и лесно запалими, както и сравнително скъпи. Също така, излагането на действието им може да има неблагоприятни ефекти, както локални (дразнене на кожата, алертични реакции), така и системни (главоболие, гадене, замаяност). Поради естеството на производството им, в тях могат да се съдържат други вредни за човека съединения в потенциално опасни концентрации. Вече са разработени няколко вида дезинфектанти за ръце и повърхности на базата на наночастици от титанов оксид, сребро, капсулиран водороден пероксид, както и на инженирани водни наноструктури [49, 7, 65]. Те осигуряват добро бактерицидно и вирусоцидно действие.

2.2. Приложение на нанотехнологиите за диагностика на наличие на вирусни частици на SARS-CoV-2

Независимо от сродството му с досега известните бета-коронавируси, SARS-CoV-2 се оказа различен от тях както по отношение на биологията си, така и по отношение на параметрите си на разпространение. Вирусът има много висок инфекциозен потенциал, но не всички хора, изложени на вируса, се заразяват. Заразеното лице, дори когато е симптомно, не произвежда специфичен клиничен и лабораторен фенотип, който да позволява надеждно диагностициране на COVID-19 въз основа само на клинични или клиниколабораторни данни. Инкубационният период след заразяване може да варира значително – между 2 и 14 дни (въпреки че понастоящем се смята, че ако няма проявени симптоми 7 дни след последния контакт с вируса, малко вероятно е контактното лице да е заразено). Диференциалната диагноза на леки и умерени случаи на COVID-19 може да включва практически всякаква друга респираторна инфекция, тъй като няма патогномонични за инфекцията с COVID-19 симптоми и признаци. При тежките случаи клиничната картина е неспецифична и може да наподобява усложнени възпалителни заболявания, сепсис, съдови инциденти и др. Значителна част от случаите се откриват само при образни изследвания, тъй като относителният дял на фалшиво-отрицателните тестове за наличие на вирусен антиген или вирусна РНК при SARS-CoV-2 е относително висок.

Както всеки РНК вирус, SARS-CoV-2 има вътрешно присъщ много висок мутационен потенциал. Това му дава възможност чрез ускорена микроеволюция да избягва от обсега на рутинната диагностика. Разработването на диагностичен тест за COVID-19, който да съчетава едновременно бързина на получаване на резултата, висока чувствителност и висока специфичност все още е въпрос на бъдещето.

COVID-19 е модерна пандемия, поради което съвременните технологии, включително и нанотехнологиите, бяха впрегнати в борбата с вируса. Повечето от технологиите и устройствата, използвани за откриване на SARS-CoV-2, са базирани на тези, разработени няколко години преди това за откриване на родствените вируси SARS и MERS. Поради наличието на предходни данни, нанотехнологиите бяха използвани за целите на диагностицирането на инфекции със SARS-CoV-2 още в първите месеци след началото на пандемията. Едни от първите наноматериали, тествани и одобрени за бърза детекция на вирусни агенти още преди появата на COVID-19 бяха сребърни и златни наночастици, към които са свързани полипептиди и белтъчни молекули [32, 47]. Други, също успешно използвани за откриване на вирусни частици, се основават на молекулна хибридизация. Такива са технологиите, основани на ДНК сонди, имобилизирани върху въглероден електрод, покрит със златни наночастици; както и златни наночастици, покрити с антисенс олигонуклеотиди. Разпознаването и свързването към таргетната нуклеинова киселина е спрегнато с ензимна реакция, при кояго от хромогенен или флуоресцентен субстрат се получава цветен или флуоресциращ продукт, осигурявайки бърза визуална детекция и, при нужда, количествена оценка [39, 30, 42].

Тъй като основната входна врата и първично място за намножаване на SARS-CoV-2 в човешкия организъм е лигавицата на носоглътката, в тестовете за детекция на SARS-CoV-2 обикновено се използва материал, събран от назофаринкса или гърлото с помощта на тампон или четчица. Този метод на пробовземане има относително ниска степен на инвазивност, но тъй като неминуемо включва близък контакт между пациента и пробовземащия, понякога се разглежда от пациентите като нарушение на личното им пространство. Това може да доведе до неефективна техника на пробовземане, за да се избегнат оплакванията на пациента, и, съответно до повишаване на и без това немалкия процент на фалшиво-отрицателни резултати. Като решение на този въпрос бяха предложени по-малко инвазивни подходи за откриване и бърз скрининг за SARS-CoV-2 – в издишан въздух с помощта на биосензор, съдържащ на златни наночастици [57, 19]. Засега обаче тази методология не се е наложила.

Магнитните наночастици се използват сравнително отдавна в молекулярната диагностика за изолиране и пречистване на нуклеинови киселини от биологични проби и проби от околната среда. През 2008, магнитни наночастици бяха използвани за изолиране на РНК на SARS-CoV-1, причинителят на тежкия остър респираторен синдром [20]. На тази база през 2020-2021 г. беше разработен специализиран протокол за екстракция на РНК на SARS-CoV-2 с използване на намагнитени наночастици от цинков ферит [58; 76].

Квантовите точки са кристали с изкуствен произход с размери в нанодиапазона. Те съдържат електрони, чието квантово състояние може да бъде променено при облъчване с точно определени дължини на вълната. Те могат да преминат във високоенергетично възбудено състояние или в нискоенергетично състояние, излъчвайки светлина с определена дължина на вълната. Квантовите точки притежават свойства на полупроводници и могат да имат различни оптически характеристики в зависимост от размера си. Специфичните оптични свойства на квантовите точки им позволяват да се използват като репортерни елементи в биосензори. Още през 2011 г. , квантови точки бяха били използвани в биосензор за откриване на нуклеокапсидния антиген на SARS [56]. През 2020 г. Liu et al. адаптираха същата технология за откриване на SARS-CoV-2 [33].

Други видове наноматериали, като напр. т.нар. „въглеродни квантови точки“, въглеродни нанотръбички, нанодиаманти и пр. са използвани предходно за пречистване и концентриране на проби, съдържащи нисък вирусен товар [72]. Беше установено, че това значително увеличава чувствителността на детекция на вирусни нуклеинови киселини.

Нанозимите са друг вид изкуствено създадени молекули с размери в нанодиапазона, които притежават каталитична активност. Сравнително наскоро, през 2020 г., беше разработена методология за бърза и високочувствителна детекция на SARS-CoV-2, базирана на използване на нанозим по-точно, изкуствено създадена Co-Fe хемин пероксидаза [33]. Според авторите, тази технология осигурява откриване на присъствие на вирусен белтък в концентрация по-малко от 10 pg/ml. Не е за подценяване и фактът, че времето от пробовземането до получаването на резултатите е само около 15 минути (колкото е и технологичното време на най-масово използваните в момента „бързи тестове“).

Нанотехнологиите подпомогнаха и серологичната детекция за SARS-CoV-2 (популярно известна като „изследване на антитела“). През 2020 г. от Huang et al. беше разработен диагностичен тест за бързо откриване на IgM срещу SARS-CoV-2 (свидетелстващи за „прясна“ инфекция) с помощта на вирусен нуклеопротеин, конюгиран със златни наночастици [23]. Получаването на резултатите при тази методология също отнема, според авторите на цитираното проучване, по-малко от 15 минути.

3. Нанотехнологиите в помощ на борбата срещу COVID-19: научно-изследователска дейност в областта на разработване на лекарства

Когато в началото на 2019 г. SARS-CoV-2 за първи път демонстрира капацитета си за заразяване и предизвикване на кратковременни и отдалечени последствия, изследователите, разработчиците на технологични решения и клиничната и фармацевтичната общност осъзнаха заплахата почти незабавно и реагираха като обединен фронт за отпор на пандемията. Това даде възможност сравнително бързо (в рамките на седмици и месеци) да бъдат преустроени съществуващите дотогава представа за особеностите на защитата от инфекциозни заболявания и да се модифицира драстично първоначално разработеният протокол за лечение на инфекцията. По този начин се осигури възможност за контрол над разпространението на пандемията и за намаляване на относителния дял на случаите с неблагоприятен изход. Към настоящия момент нанотехнологиите имат потенциала да се превърнат в неразделна част от разработването на лечения за COVID-19. Те могат да предоставят нови платформи за насочена доставка на лекарства, моноклонални антитела и други биоактивни вещества до прицелната тъкан или орган и контролирано по време освобождаване на лекарствения продукт. Тази област на материалознанието се развива интензивно, макар и за момента да изостава в сравнение с огромния подем в областта на разработките на фармацевтични продукти с антивирусни и имуномодулиращи свойства. Като се има предвид ускоряването на процеса на изследователска и развойна дейност във връзка с пандемията, може да се очаква, че разработването на нови нано-базирани лекарства и ваксини срещу вируса ще бъде основа на диагностиката и терапията на заболяването в близкото бъдеще.

3.1. Антивирусни средства срещу COVID-19

3.1.1. Фавипиравир

Фавипиравир представлява гуанозинов аналог, който се свързва и инхибира РНК-зависимата РНК-полимераза на SARS-CoV-2. Той е предходно съществуващо лекарство, първоначално използвано в Япония за лечение на грип под търговската марка Avigan (Fujifilm Toyama Chemical Co, Ltd.) След появата на SARS-CoV-2, в Китай започнаха изпитания на фавипиравир за лечение на COVID-19 и през м. февруари 2020 г. лекарството получи статут на лекарство против с променено предназначение под името Favilavir (Zhejiang Hisun Pharmaceutical) https://www.pharmaceutical-technology.com/news/china-favilavir-testing-approval/. По-късно през 2020 г. фавипиравирът беше одобрен и в Италия за експериментална употреба срещу COVID-19 [13]. Фавипиравир се прилага през устата и се изписва само от лекар. В литературата неколкократно е докладвано, че фавипиравир може да се използва при леки случаи на COVID-19, особено при пациенти, които презентират с повишена температура [27, 62], но лекарството все още не се счита за достатъчно ефикасно, за да бъде прилагано масово. Официалното изявление на Fujifilm Toyama Chemical Co. в тази връзка е: „…на този етап клиничното приложение на Avigan…за лечение на Covid-19 е в процес на проучване и подготовка, за да се получат ясни доказателства за ефикасността и безопасността на лекарството“ [https://www.fujifilm.com/fftc/en/avigan].

През 2020 г. беше докладвана нова технология за насочена доставка на фавипиравир директно в белодробния епител чрез наноемулсия [55]. През 2021 г. бяха разработени твърди липидни наночастици за целите на насочена доставка на фавипиравир до белия дроб посредством разпрашаване [64]. Тези изследвания, обаче, към момента са на етап in vitro, а проучванията in vivo тепърва предстоят.

3.1.2. Молнупиравир (Lagevrio на Merck)

Молнупиравирът също представлява нуклеозиден (пиримидинов) аналог, който инхибира РНК-зависимата РНК-полимераза на SARS-CoV-2 [46]. Подобно на фавипиравир, молнупиравир беше първоначално разработен за целите на лечение на грипна инфекция. Разрешението за спешна употреба (Emergency Use Authorization, EUA) за молнупиравира беше предоставено от Федералната агенция по лекарствата на САЩ (Federal Drug Agency, FDA) на 23 декември 2021 г., на следващия ден след предоставянето на EUA за комбинирания препарат Paxlovid (виж по-долу) [https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-additional-oral-antiviral-treatment-covid-19-certain]. Както и фавипиравирът, молнупиравир се прилага перорално и само по лекарско предписание. Показан е за употреба при нехоспитализирани възрастни пациенти с „…лека до умерена коронавирусна болест…с положителен резултат от тест за наличие на РНК на SARS-CoV-2, при които има висок риск от прогресия до тежък COVID -19, включително хоспитализация или смърт, и за които други варианти за лечение на COVID-19, разрешени от FDA, не са достъпни или не са клинично подходящи“. Понастоящем EUA за това лекарство не разрешава прилагането му при деца. Според действащия протокол, приложението на молнупиравир при наличие на показания за това трябва да започне в рамките на пет дни от появата на първите симптоми. Според проучванията, при пациенти с висок риск прилагането на молнупиравир може да намали риска от хоспитализация или смърт с 50% [37, 25, 69]. Честотата на свързаните с лекарството нежелани събития е сравнима с честотата, която се наблюдава при болни, лекувани с други терапевтични схеми [69]. Има развитие в посока използване на нанотехнологии за осигуряване на по-добро доставяне и по-висока бионаличност на молнупиравир [25], но изпитанията за това все още са в ход.

3.1.3. Ремдесивир

Remdesivir (Veklury на Gilead Sciences) беше едно от първите специфични лекарства срещу COVID-19, което при изпитанията си демонстрира висока ефикасност. Той представлява аденозинов аналог, който се свързва с нарастващата нуклеотидна верига при репликацията на вируса и инхибира нейния синтез [21]. Ремдесивир беше първоначално разработен за лечение на хепатит С. Впоследствие беше установено, че е ефикасен при животни, заразени с вируса Ебола [68], но при употреба при хора, ефикасността му е по-ниска от другите терапевтични средства за лечение на Ебола [43]. За разлика от повечето други антивирусни средства за лечение на COVID-19, ремдесивир се използва само парентерално, като бавна интравенозна инфузия. Той е показан за употреба само при хоспитализирани пациенти с тежко протичане на COVID-19. Първоначално лекарството беше одобрено за използване при възрастни и деца (при условие, че са на възраст ≥12 години и тежат ≥40 kg) с COVID-19 с тежко протичане и дихателна недостатъчност, които вече приемат дексаметазон [https://www.covid19treatmentguidelines.nih.gov/management/clinical-management/hospitalized-adults–therapeutic-management/].

По-късно ремдесивир беше одобрен за употреба и при по-малки деца и при определени групи нехоспитализирани пациенти [https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-takes-actions-expand-use-treatment-outpatients-mild-moderate-covid-19]. Пациентите, които отговарят на критериите за лечение с ремдесивир трябва да имат доказан чрез тестване за наличие на вирусна РНК COVID-19 (въпреки че в случаите, когато няма положителен тест, наличието на образни находки (рентгенографско или от компютърна томография, напр. тип „матово стъкло“) може да е достатъчно, за да бъде оправдана употребата на лекарството). Нуждата от приложение на ремдесивир се преразглежда във всеки отделен случай, но като цяло е противопоказана при пациенти с високостепенна чернодробна и бъбречна недостатъчност и се прилага само след отрицателна кожна алергична проба.

До момента са публикувани няколко доклада във връзка с използването на нанотехнологиите за насочване на доставката на ремдесивир до прицелните тъкани. Един от тях, който е базиран на използването на нановезикули от ко-полимер на млечната и гликоловата киселина, съдържащи ремдесивир, обещава да стане основа на ефективна платформа за подобрено доставяне на лекарството [71]. Приложими клинично резултати, обаче, все още се очакват, тъй като положителните данни засега са на ниво компютърно моделиране.

3.1.4. Нирматрелвир/ритонавир (Paxlovid на Рfizer)

В края на декември 2002 г. FDA издаде разрешение за спешна употреба за комбинирания препарат на Pfizer Paxlovid (нирматрелвир и ритонавир). Нирматрелвир е протеазен инхибитор. Той се свързва ковалентно и инхибира вирусната протеаза 3CLpro, която частично хидролизира полипротеина, генериран от транслацията на вирусната иРНК, за да се получат отделните вирусни белтъци [45]. Нирматрелвир беше разработен на основа луфотрелвир – протеазен инхибитор с подобно действие, който предходно също беше подложен на предклинични изпитания за лечение на COVID-19 [5]. Другият компонент на лекарството – ритонавир – е добре проучен и често използван инхибитор на CYP3A, който често се включва в режимите за високоактивна антиретровирусна терапия (highly active antiretroviral therapy – HAART, сега вече наричана само антиретровирусна терапия – ART) за лечение на HIV инфекция. Това намалява скоростта на разграждане на нирматрелвира от клетъчните протеази и по този начин води до повишаване на серумните му нива [40]. Според едно скорошно прессъобщение на Pfizer, Paxlovid намалява риска от хоспитализация или смърт на пациентите с COVID-19 с 89% [https://www.pfizer.com/news/press-release/press-release-detail/pfizers-novel-covid-19-oral-antiviral-treatment-candidate]. Paxlovid се прилага перорално и е показан за лечение на COVID-19 при възрастни пациенти и деца (на възраст над 12 години и с тегло над 40 килограма), при които протичането е от леко до умерено тежко, но по някаква причина имат висок риск за прогресия до тежък COVID-19 (включително хоспитализация или смърт) [https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-first-oral-antiviral-treatment-covid-19]. Paxlovid се предписва само от лекар и лечението трябва да започне не по-късно от пет дни след появата на първите симптоми. Проучванията за ефекта на Paxlovid върху хода на COVID-19 при пациенти с висок риск все още са малобройни. Това налага допълнителни проучвания, за да се изясни дали е реално предходно докладваното намаление на риска от хоспитализация и смърт. Един от публикуваните мета-анализи показва, че пациентите, които са приемали Paxlovid в ранните етапи на развитие на клиничната картина на COVID-19 са имали по-ниска честота на поява на усложнения и че относителният дял на нежеланите събития, свързани с терапията с Paxlovid, е близък до този в плацебо групата [69]. Натрупаните данни, обаче, все още не са достатъчни, за да се направят надеждни заключения за ефикасността и безопасността на лекарството.

До момента, нанотехнологиите и наноматериалите не са намерили значително приложения за повишаване на бионаличността, ефикасността или подобряването на доставката на Paxlovid до прицелните тъкани.

3.1.5. Лопинавир/ритонавир

Лопинавир/ритонавир (Kaletra на Abbott или Aluvia на AbbVie) също е комбинация от протеазни инхибитори, която е част от съвременната терапия за лечение на HIV-инфекция. Недостатък на лекарството е ниската водоразтворимост, което води до трудно предсказуема бионаличност при различните пациенти. През 2016 г. беше докладвано разработването на гранулирана форма на лопинавира, които при разтваряне във вода спонтанно се самосглобяват до наночастици, съдържащи активния компонент. Това води до подобрение на ефективността на доставка на лекарството [48]. Kaletra е едно от лекарствата, което за кратък период беше използвано в лечението на COVID-19 при хоспитализирани пациенти. Впоследствие, обаче, редица проучвания (включително и проучването RECOVERY) показаха, че използването на Kaletra не намалява значимо риска от хоспитализация и смърт при пациенти с COVID-19 [53]. По-късно проучванията на Patel et al. свидетелстваха, че честотата на нежеланите събития е дори по-висока при пациентите, лекувани с лопинавир/ритонавир в сравнение с пациентите, получили друго лечение [60]. Поради това, в момента този комбиниран препарат не се използва в лечението на пациенти с COVID-19.

3.2. Моноклонални антитела (МАБ) за лечение на инфекции със SARS-CoV-2

Моноклоналните антитела се използват успешно при лечението на редица имунни и автоимунни заболявания като ревматоиден артрит, псориатичен артрит, улцерозен колит и болест на Crohn, някои неоплазми, цитокинови бури вследствие на тежки инфекции, при трансплантирани пациенти и др. Най-честите нежелани събития при прилагане на моноклонални антитела са алергични реакции, включително и анафилактичен шок.

Всички МАБ, използвани понастоящем при терапията на COVID-19 се използват при пациенти с леко и умерено тежко протичане, при които има риск от развитие на тежки усложнения. Повечето МАБ са насочени към структурните белтъци на вируса, но могат да бъдат и насочени срещу ключови белтъчни компоненти на пътищата на възпалението (какъвто е тоцилизумаб – виж по-долу). Понастоящем само за моноклоналните антитела, които са насочени към S-белтъка на SARS-CoV-2 е доказано наличие на значима клинична полза [28]. Някои моноклонални антитела могат да се използват като преекспозиционна профилактика (за подробности, виж по-долу). Няколко неутрализиращи моноклонални антитела имат разрешение за спешна употреба от FDA за използване в амбулаторни условия при пациенти с доказана инфекция с SARS-CoV-2. Четири от тях се използват в комбинация (бамланивимаб и етесевимаб, казиривимаб и имдевимаб), докато сотровимаб, бебтеловимаб и регданвимаб могат да се използват самостоятелно. Една комбинация от две антитела (тиксагевимаб и цилгавимаб) е разрешена за употреба в момента само с цел пре-експозиционна профилактика.

3.2.1. Бамланивимаб и етесевимаб (генеричен препарат на Ely Lilly)

Бамланивимаб и етесевимаб се свързват с различни, макар и припокриващи се епитопи в рецептор-свързващия домен на шиповия белтък на SARS-CoV-2. Прилагат се под формата на интравенозна инфузия. Проучването BLAZE-1 демонстрира клинична полза от използването на тази комбинация при пациенти на над двегодишна възраст с леко до умерено тежко протичащ COVID-19 [12]. Бамланивимаб и етесевимаб, обаче, се оказаха с намалена активност срещу варианта Oмикрон и поради това, (поне към момента) FDA ограничи целенасочено тяхната употребата при пациенти с COVID-19 [https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-limits-use-certain-monoclonal-antibodies-treat-covid-19-due-omicron].

3.2.2. Казиривимаб и имдевимаб (REGEN-COV на Regeneron, Ronapreve на Roche)

Казиривимаб и имдевимаб са моноклонални антитела, които се свързват с неприпокриващи се епитопи на рецептор-свързващия домен на шиповия белтък. Според Комитета по лекарства, предназначени за употреба при хора (Human Medicines Committee of the European Medicine Agency, CHMP) на Европейската агенция по лекарствата, комбинираният препарат Ronapreve значително намалява честотата на хоспитализациите и смъртните случаи при пациенти с COVID-19, при които има риск от тежки усложнения [COVID-19: EMA recommends authorisation of two monoclonal antibody medicines | European Medicines Agency (europa.eu)].

3.2.3. Сотровимаб (Xevudy на GlaxoSmithKline)

Сотровимаб е МАБ, специфично към един от епитопите в рецептор-свързващия домен на шиповия белтък, който е висококонсервативен при родствените SARS-CoV и SARS-CoV-2. Поради това, сотровимаб притежава ефикасност срещу варианта Омикрон [https://www.fda.gov/media/149534/download]. Показан е за употреба при нехоспитализирани възрастни пациенти или деца на възраст ≥12 години и с тегло ≥40 kg с леко до умерено тежко протичащ COVID-19, при които има висок риск от развитие на усложнения. Прилага се като еднократна интравенозна инфузия или подкожно в първите 10 дни от появата на първите симптоми.

3.2.4. Бебтеловимаб (генерично, на Ely Lilly)

Бебтеловимаб е друго моноклонално антитело, насочено към шиповия белтък, което, според наличните данни, има значима активност срещу варианта Омикрон. Той получи разрешение за спешна употреба от FDA през февруари 2022 г. за употреба при възрастни и деца с леко до умерено тежко протичащ COVID-19 [https://investor.lilly.com/news-releases/news-release-details/lillys-bebtelovimab-receives-emergency-use-authorization]. Бебтеловимаб се прилага като еднократна интравенозна инжекция.

3.2.5. Тиксагевимаб/цилгавимаб (Evusheld на Astra Zeneca)

Тиксагевимаб и цилгавимаб са МАт, свързващи се с неприпокриващи се епитопи на рецептор-свързващия домен на шиповия белтък [10]. Към момента, комбинацията тиксагевимаб/цилгавимаб се използва за пре-експозиционна профилактика. Подходящи за лечение са лица, за които към момента има данни от молекулярна диагностика, че не са заразени със SARS-CoV-2 и не са били в скорошен контакт със заразено лице, но имат присъщ висок риск от неадекватен имунен отговор при ваксинация срещу COVID-19 или имат документирана анамнеза на тежка нежелана реакция след поставяне на ваксина срещу COVID-19 или някой от нейните компоненти [https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-new-long-acting-monoclonal-antibodies-pre-exposure].

3.2.6. Регданвимаб (Regkirona на Celltrion)

Регданвимаб е човешко моноклонално антитяло, насочено срещу шиповия белтък на SARS-CoV-2. Прилага се парентерално като еднократна венозна инфузия. Показан е за лечение на възрастни с лека до умерена форма на COVID-19, които към момента не се нуждаят от кислородотерапия, но имат повишен риск от прогресия до тежкопротичащ COVID-19 [https://www.ema.europa.eu/en/documents/product-information/regkirona-epar-product-information_en.pdf]. Според официалното становище на CHMP приложението на Regkirona значително намалява риска от хоспитализация и смърт при пациенти с COVID-19, които имат риск от тежки усложнения [COVID-19: EMA recommends authorisation of two monoclonal antibody medicines | European Medicines Agency (europa.eu)].

3.2.7. Тоцилизумаб (Actemra, RoActemra на Roche)

Тоцилизумаб се прилага успешно като биологично лечение при различни автоимунни заболявания, включително ревматоиден артрит и системен ювенилен идиопатичен артрит. Това е хуманизирано моноклонално антитяло срещу рецептора за интерлевкин-6 (IL-6). Тъй като IL-6 играе основна роля в процеса на възпалението и е сред ранните маркери за възпаление при COVID-19, първоначално се считаше, че подтискането на сигнализацията, опосредствана от IL-6 може да намали смъртността сред пациентите. По това време за основен патогенетичен механизъм на усложненията, свързани с COVID-19, се смяташе цитокиновата буря в резултат на разрегулиране на имунната сигнализация. Тоцилизумаб получи разрешение за спешна употреба от FDA за лечение на COVID-19 през юни 2021 г. [https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-drug-treatment-covid-19]. Резултатите от няколко големи проучвания (RECOVERY, REMAP-CAP) по това време показваха, че употребата на тоцилизумаб при пациенти, които вече получават дексаметазон води до допълнително намаление на смъртните случаи сред пациентите [73]. Първоначалният ентусиазъм обаче скоро беше поохладен поради наблюдаваното значително повишаване на нивата на трансаминазите у лекуваните с тоцилизумаб пациенти. Повишаването на трансаминазите е известен нежелан ефект от лечението с тоцилизумаб. Също така това е и типична лабораторна находка в хода на COVID-19, която е както израз на общия възпалителен отговор, така и на чернодробно увреждане. Оказа се, че употребата на тоцилизумаб увеличава риска от развитие на сериозно увреждане на черния дроб при пациенти с COVID-19. През юли 2020 г. Hoffmann-LaRoche обяви, че лечението с тоцилизумаб не подобрява клиничния статус на пациенти с COVID-19 пневмония и не води до намаление на смъртността на пациентите: [Roche provides an update on the phase III COVACTA trial of Actemra/RoActemra in hospitalized patients with severe COVID-19 associated pneumonia“]. Към момента тоцилизумаб не се препоръчва за употреба при пациенти с COVID-19.
През пролетта на 2021 г. беше проведено изпитване на комбиниран инхалаторен препарат, съдържащ фавипиравир и тоцилизумаб, опакован в мукоадхезивни везикули [61] Засега не са публикувани резултати, които да показват значими ползи от използването на тази препарат.

3.3. Други лекарства с потенциал за употреба при пациенти с COVID-19

3.3.1. SQAd/VitE наночастици

Едно проучване, публикувано през 2020 г., описва разработването на препарат с антивъзпалително действие, базирано на използване на наночастици [11]. Наночастиците съдържат конюгат на естествено срещаните съединения сквален (с антивъзпалително действие) и аденозин (с имуномодулаторно действие), опаковани заедно с α-токоферол (антиоксидант). Авторите на това проучване считат, че това лекарство и подобните му препарати имат потенциал за приложение като нов терапевтичен подход при лечението на възпалителни заболявания. Евентуалните клинични приложения, обаче, все още са далече от практиката.

3.3.2. Барицитиниб

Барицитиниб (Olumiant, на Ely Lilly) е предходно съществуващо лекарство, базирано на инхибиране на сигналните пътища, медиирани от Janus киназата (JAK). Най-честата му употреба е при лечение на ревматоиден артрит, където е лекарство от втора линия. Първоначално барицитиниб не беше разрешен като самостоятелно лечение за COVID-19. През ноември 2020 г. FDA издаде разрешение за употребата на комбинацията ремдесивир/барицитиниб при хоспитализирани възрастни и деца на ≥ 2 годишна възраст с COVID-19 и тежка дихателна недостатъчност [https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-drug-combination-treatment-covid-19]. През 2021 г. беше докладвано, че използването на комбинацията барицитиниб/ремдесивир превъзхожда самостоятелното използване на ремдесивир при пациенти с тежък COVID-19, особено при тези, които са на неинвазивна вентилация, и че има добър профил на безопасност [26]. През юли 2021 г. разрешението за спешна употреба беше преразгледано и понастоящем барицитиниб може да се използва и самостоятелно за лечение на COVID-19 [https://www.thepharmaletter.com/article/fda-authorizes-baricitinib-alone-as-treatment-for-covid-19, https://www.fda.gov/media/143822/download]

3.3.3. Флувоксамин (Fevarin на Mylan и Luvox на Solvay Pharmaceuticals, Inc.)

Флувоксамин е селективен инхибитор на обратния захват на серотонина (selective serotonine reuptake inhibitor, SSRI), който се използва в клиничната психиатрия от десетилетия. Обикновено се предписва при тежко депресивно разстройство и обсесивно-компулсивно разстройство, но се прилага и при тревожни разстройства [17]. Има добър профил на безопасност, с по-ниска честота на типичните нежелани реакции, свързани с употребата на SSRI – главболие, тревожност, раздразнителност, сексуална дисфункция и усложнения от страна на сърдечно-съдовата система. Механизмът на действие на повечето лекарства, използвани в психиатрията обикновено включва действие върху повече от една молекулни „мишени” и, съответно, са описани множество потенциални странични ефекти. Поради това, възможността за насочена доставка на лекарства винаги е била критично важна в клиничната психиатрия. През 2019 г. беше съобщено за разработване на натоварени с флувоксамин твърди липидни наночастици, които, според авторите, дават възможност за насочен транспорт и ефективно освобождаване на лекарството, които могат да се контролират по време и място [29].

До момента са проведени поне три рандомизирани проучвания, посветени на изучаване на ефектите на флувоксамина при лечение на амбулаторни пациенти с COVID-19. Първото (STOP COVID) – показва намаление на риска от клинично изразено влошаване на статуса при пациентите, лекувани с флувоксамин [69]. Второто проучване беше преустановено от Борда за наблюдение на безопасността на проекта преди завършване на заложените периоди на изпитание, тъй като наблюдаваните на междинни нива ефекти от лечението бяха значително по-ниски от теоретично очакваните [69]. Третото беше проучването TOGETHER, което показа през 2022 г., че в стандартни терапевтични дози флувоксаминът може да доведе до намаляване на тежестта на симптомите, свързани с COVID-19 и намаляване на смъртността при нехоспитализирани пациенти с рано диагностицирано заболяване и висок риск от усложнения [54, 69]. Тъй като резултатите от проучванията са противоречиви, ефектите от употребата на флувоксамин при пациенти с COVID-19 са обект на допълнителни проучвания. Заявление за разрешение за спешна употреба на флувоксамин при пациенти с COVID-19 беше подадено до FDA [https://www.medpagetoday.com/special-reports/exclusives/96431], но към днешна дата няма данни да е издадено такова.

4. Ваксини, съдържащи наночастици

4.1. Исторически преглед и основни механизми на ваксинацията като метод за предпазване от инфекциозни заболявания

От края на XVIII век, когато Едуард Дженър приложи на практика наблюденията си върху кравешката шарка за създаване на невъзприемчивост срещу едра шарка, ваксините се превърнаха в основно оръжие в арсенала на медицината срещу инфекциозните болести. Строго погледнато, заслугата за въвеждането на практиката на ваксинация не е единствено на Дженър, тъй като той несъмнено е бил запознат с източната практика на „вариолизация“ (въведена във Великобритания няколко години от Мери Уортли Монтегю) и изследванията на д-р Джон Фюстър, който също е демонстрирал устойчивост към заразяване с едра шарка при подопитни индивиди, влизали в контакт с материали, съдържащи вируса на кравешката шарка [63]. Блестящата публична репутация на Дженър и високият му социален статус, обаче, допринасят в огромна степен за популяризацията на неговите ваксинални практики. През XX век се разработват множество ваксини срещу различни често срещани инфекциозни заболявания и част от тях стават задължителна част от ваксинационния календар по целия свят. Налични са и ваксини срещу ендемични инфекциозни заболявания като жълта треска, кърлежови енцефалити, японски енцефалит, коремен тиф и други. Някои от тях са задължителни за пътуващите в райони с ендемична ваксинопредотвратима болест, а други са пожелателни.

Най-общо казано, действието на ваксините се заключава в следното: по един или друг начин, на имунната система на гостоприемника се представя антиген, типичен за инфекциозния агент, без при това да се осъществява същинска инфекция. По този начин гостоприемникът може да изгради готов за действие механизъм за защита срещу нарушителя още преди срещата си с него или на много ранни етапи на заразяването. „Ваксинация” и „имунизация” са два различни термина, които обаче много често се използват (неправилно) като взаимозаменими. Имунитетът срещу определен агент може да бъде вроден или придобит. Той може да се развие или след ваксинация, или след като гостоприемникът се е срещнал с инфекциозния агент и е преминал естествения ход на инфекциозното заболяване. Ваксинацията включва представяне само на антигена (или повече от един антиген, какъвто е случаят с инактивираните ваксини) на имунната система на гостоприемника без риск (или, както при живите ваксини, с много нисък риск) от заразяване със свързаното заболяване.

4.2. Типове ваксини

От историческа гледна точка се разграничават четири основни типа ваксини:

• Инактивирани (напр. ваксина на Salk срещу полиомиелит, ваксина срещу бяс, ваксина срещу хепатит А и други);
• Живи атенюирани (ваксина на Sabin срещу полиомиелит, ваксините срещу морбили, рубеола и инфекциозен паротит и други);
• Токсоиди (напр. тетанични и дифтерийни анатоксини);
• Субединични ваксини (някои от ваксините срещу грип, напр. FluMist Quadrivalent на MedImmune; ваксини срещу хепатит В и др.). Към тази категория спадат и пептидните, полизахаридните и конюгираните ваксини.

Наскоро към тези категории бяха добавени още два типа ваксини: а именно векторните ваксини (например Zabdeno – срещу Ебола и няколко ваксини срещу SARS-CoV-2); и иРНК ваксини (засега само срещу SARS-CoV-2).

Може да съществуват и да се използват едновременно няколко различни типове ваксини срещу едно и също заболяване. За някои от най-старите ваксини (като полиомиелитната ваксина) може се използват няколко различни типа (напр. в случая на полиомиелита – жива атенюирана или инактивирана ваксина, които се прилагат по различен начин). Различните страни може да имат различна политика по отношение на вида на ваксината, използвана в общата популация (здравите индивиди) и при специални случаи (напр. при имунокомпрометирани). Допреди появата на COVID-19, обаче, никога не е имало толкова голямо разнообразие от ваксини срещу един и същи инфекциозен агент.

иРНК ваксините имат сходен или дори по-добър профил на безопасност в сравнение с повечето други типове ваксини. Когато се прилагат в поне две дози, те осигуряват високи нива на защита (94-95 %) срещу развитието на COVID-19 и свързаните с него усложнения [50, 3]. Хуморалният имунен отговор, предизвикан от повечето използвани в момента иРНК ваксини срещу SARS-CoV-2 има тенденция да намалява след 6 месеца от втората доза. Временно решение за това беше намерено чрез прилагане на трета бустерна доза [31]. Съобщава се, че бустерната доза повишава ефикасността на защитата, осигурена от ваксината, като при ваксинираните с три дози се наблюдават близо 75 % по-малко посещения в отделенията за спешна помощ, свързани с COVID-19 и нуждата от хоспитализация се намалява с над 80 % [16].

4.3. Ваксини срещу SARS-CoV-2

Ваксините срещу SARS-CoV-2, за които към момента е издадено разрешение за употреба, могат да принадлежат към три от четирите основни „класически“ типа, изброени по-горе, или могат да бъдат от по-новите типове векторни или иРНК ваксини.

4.3.1. Ваксини, основани на използване на „класически“ технологии

Инактивирани ваксини срещу SARS-CoV-2 са и двете ваксини, разработени от Sinopharm (Sinopharm BIBP и Sinopharm WIBP) както и Turkovac (на здравните институти на Турция), CoronaVac (SinoVac Biotech), Covaxin (на Bharat Biotech), QazVac (на Казахския изследователски институт за биобезопасност).

Субединичните ваксини обикновено са основани на представяне на шиповия белтък протеин на имунната система на гостоприемника. Такива са: EpiVacCorona (на Центъра по биотехнологии „Вектор”, Corbevax (на Biological E. Ltd.), Novavax, Soberana и ваксината на Sanofi-GSK, която все още няма официално име;

Живи атенюирани ваксини срещу SARS-CoV-2 все още са най-слабо разработени. Понастоящем единствената разработена жива атенюирана ваксина е COVI-VAC на Codagenix Inc., и тя все още е във фаза 1 на изпитанията си.

4.3.2. Приложение на съвременните нанотехнологии за разработване на ваксини срещу SARS-CoV-2

Голяма част от ваксините срещу SARS-CoV-2 спадат към по-новото поколение векторни ваксини. Такива са, например, ваксините Vaxzevria на Oxford/Astra Zeneca; ваксината, разработена от Janssen-Cilag; Спутник V, Convidecia (на CanSino Biologics), и др.

Разработването на иРНК-базирани ваксини датира от поне 20 години. Преди да се разгърне пандемията от COVID-19, обаче, основните усилия в областа бяха насочени към развитието на противогрипни ваксини и специфични антиракови ваксинални препарати. Представители на иРНК ваксините са препаратите Comirnaty (на Pfizer-BioNTech) и Spikevax (на Moderna). И двете работят на един и същи принцип – създаване и поддържане на имунитет спрямо SARS-CoV-2 чрез предварително представяне на изкуствено създадени модифицирани иРНК, от които чрез транслация се получават сегменти от сравнително висококонсервативния  шипов белтък на SARS-CoV-2. Разработката на иРНК ваксини е добър пример за нанотехнологично решение. Получените чрез синтез in vitro иРНК се опаковат в липидни наночастици (напр. липозоми). Тези частици биват поети от дендритните клетки и се транспортират вътреклетъчно до рибозомите, където се транслират. Получените белтъчни фрагменти се експортират на повърхността на антиген-представящите клетки и, свързани с белтъците на човешкия главен комплекс за тъканна съвместимост, биват представени на Т клетките, което предизвиква имунен отговор.

Липозомите са, общо взето, биосъвместими и практически нетоксични платформи за доставка на лекарства в организма. Липозомни препарати вече многократно са били успешно използвани in vivo при хора за доставяне на лекарства до специфични цели, главно в клиничната онкология [34, 35]. Трябва, обаче, да се отчита риска, че модификациите (включително конюгирането с PEG) могат да доведат до повишена имуногенност на получения препарат. Описани са анафилактични и други имунни реакции при използването на различни PEG-съдържащи препарати (лаксативи, депо стероиди и др.) [59]. иРНК ваксините, общо взето, притежават отличен профил на безопасност. Честотата на нежеланите събития след ваксинация възлиза едва на 0,2 % [https://www.cdc.gov/mmwr/volumes/70/wr/mm7002e1.htm]. Случаи на анафилактични и анафилактоподобни реакции, обаче, са докладвани както за Comirnaty, така и за Spikevax [4, 8]. Понастоящем се смята, че почти всички случаи на анафилаксия след прилагане на ваксината Pfizer-BioNTech са свързани с наличието на PEG3350 във ваксиналния препарат [18]. Тъй като в справката за безопасност на ваксината на Moderna не се описва дали има или не PEG в техния ваксинален препарат, трудно може да се анализира дали докладваните досега случаи на анафилактични реакции са свързани именно с PEG3350 или с някой друг компонент на препарата. Понастоящем официалната препоръка на FDA е: „Ако сте алергични към PEG, Вие не трябва да получавате иРНК ваксина срещу COVID-19…Ако сте алергични към полисорбати, Вие не трябва да получавате ваксината на J&J/Janssen срещу COVID-19.” https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/vaccines/recommendations/specific-groups/allergies.html

Липозомите и свързаната с тях технология за опаковане на биоактивни вещества са само ранни предшественици на възникналото впоследствие много по-голямо разнообразие от технологии, базирани на липидни наночастици. Потенциалните следващи цели в тази област са: подобряване на специфичността към прицелните клетки, тъкани и органи; прецизен контрол върху освобождаването на лекарството, развитие на тригерирани липозоми (чувствителни към определени стимули, като напр. промени в температурата, pH, свързване на специфичен лиганд и т.н.), както и много други. Използването на нанотехнологиите ще подобри защитата на човечеството срещу бъдещи пандемии на всички нива и би позволило създаване на надеждни, стабилни и лесно достъпни диагностични тестове, лични предпазни средства, лекарства и ваксини.

---

Тест LO 4.1

---

Литература

1. Albaz A., Rafeeq M., Sain Z., Almutairi W., Alamri A., Aloufi A., Almalki W., et al. (2021). Nanotechnology-based approaches in the fight against SARS-CoV-2. AIMS Microbiol, 7(4), 368-398.
2. Aydemir D. and Ulusu N. (2020). Angiotensin-converting enzyme 2 coated nanoparticles containing respiratory masks, chewing gums and nasal filters may be used for protection against COVID-19 infection. Travel Med Infect Dis, 37, 101697.
3. Baden L., El Sahly H., Essink B., Kotloff K., Frey S., Novak R., Diemert D., et al., and Zaks T, for the COVE Study Group. (2021). Efficacy and Safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 Vaccine. N Engl J Med, 384(5), 403-16.
4. Bigini P., Gobbi M., Bonati M., Clavenna A., Zucchetti M., Garattini S. and Pasut G. (2021). The role and impact of polyethylene glycol on anaphylactic reactions to COVID-19 nano-vaccines. Nature Nanotechnol, 16, 1169-1171.
5. Boras B. Jones R., Anson B., Arenson D., Aschenbrenner L., Bakowski M., Beutler N., et al. (2021). Preclinical characterization of an intravenous coronavirus 3CL protease inhibitor for the potential treatment of COVID19. Nature Communications, 12 (1), 6055.
6. Borkow G., Zhou S., Page T. and Gabbay J. (2010). A novel anti-influenza copper oxide containing respiratory face mask. PLoS One, 5(6), e1.
7. Campos E., Pereira A., de Oliveira J., Carvalho L., Guilger-Casagrande M., de Lima R. and Fraceto L. (2020). How Can Nanotechnology Help to Combat COVID-19? Opportunities and Urgent Need. J Nanobiotechnol 18, 1-23.
8. CDC COVID-19 Response Team and Food and Drug Administration. (2021). Allergic Reactions Including Anaphylaxis After Receipt of the First Dose of Moderna COVID-19 Vaccine — United States, December 21, 2020–January 10, 2021. MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 70(4), 125-129.
9. Chua M., Cheng W., Goh S., Kong J., Li B., Lim J., Mao L., et al. (2020). Face Masks in the New COVID-19 Normal, Materials, Testing, and Perspectives. Review Research (Wash DC), 7286735. doi, 10.34133/2020/7286735. eCollection 2020.
10. Dong J., Zost S., Greaney A., Starr T., Dingens A., Chen C., Chen R., et al. (2021). Genetic and structural basis for SARS-CoV-2 variant neutralization by a two-antibody cocktail. Nature Microbiol 6 (10), 1233-1244.
11. Dormont F., Brusini R., Cailleau C., Reynaud R., Peramo A., Gendron A., et al. (2020). Squalene based multidrug nanoparticles for improving mitigation of controlled inflammation in rodents. Sci Adv, 6(23), eaaz5466.
12. Dougan M., Azizad M., Mocherla B., Gottlieb R., Chen P., Hebert C., Perry R., et al. (2021). A randomized, placebo-controlled clinical trial of bamlanivimab and etesevimab together in high-risk ambulatory patients with COVID-19 and validation of the prognostic value of persistently high viral load. Clin Infect Dis, ciab912.
13. Dube T., Ghosh A., Mishra J., Kompella U. and Panda J. (2020). Drugs, Molecular Vaccines, Immune-Modulators, and Nanotherapeutics to Treat and Prevent COVID-19 Associated with SARS-CoV-2, a Deadly Nanovector. Review Adv Ther (Weinh), 2000172.
14. El-Atab N., Qaiser N., Badghaish H., Shaikh S. and Hussain M. (2020). Flexible Nanoporous Template for the Design and Development of Reusable Anti-COVID-19 Hydrophobic Face Masks. ACS Nano, 14(6), 7659-7665.
15. Fan C., Li K. and Ding Y. (2021). ACE2 expression in kidney and testis may cause kidney and testis damage after 2019-nCoV infection.  Front Med (Lausanne), 13, 7:56389.
16. Ferdinands J., Rao, Dixon B., Mitchell P., DeSilva M., Irving S., Lewis N., et al. (2022). Waning 2-Dose and 3-Dose Effectiveness of mRNA Vaccines Against COVID-19-Associated Emergency Department and Urgent Care Encounters and Hospitalizations Among Adults During Periods of Delta and Omicron Variant Predominance – VISION Network, 10 States, August 2021-January 2022. MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 71(7), 255-263.
17. Figgitt D. and McClellan K. (2000). Fluvoxamine. An updated review of its use in the management of adults with anxiety disorders. Drugs, 60 (4), 925-54.
18. Garvey L. and Nasser S. (2021). Anaphylaxis to the first COVID-19 vaccine – is polyethylene glycol (PEG) the culprit? Br J Anaesth, 126(3), e106-e108.
19. Giovannini G., Haick H. and Garoli D. (2021). Detecting COVID-19 from Breath, A Game Changer for a Big Challenge. ACS Sens, 6, 1408-1417.
20. Gong P., He X., Wang K., Tan W., Xie W., Wu P. and Li H. (2008). Combination of Functionalized Nanoparticles and Polymerase Chain Reaction-Based Method for SARS-CoV Gene Detection. J Nanosci Nanotechnol, 8, 293-300.
21. Gordon C., Tchesnokov E., Woolner E., Perry J., Feng J., Porter D. and Götte M. (2020). Remdesivir is a direct-acting antiviral that inhibits RNA-dependent RNA polymerase from severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 with high potency. J Biol Chem, 295(20), 6785-6797.
22. Huang C., Wang Y. and Li X. (2020). Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet (London, England), 395(10223), 497-506.
23. Huang C., Wen T., Shi F., Zeng X. and Jiao Y. (2020). Rapid Detection of IgM Antibodies against the SARS-CoV-2 Virus via Colloidal Gold Nanoparticle-Based Lateral-Flow Assay. ACS Omega, 5, 12550-12556.
24. Harris J. and Chess RB. (2003). Effect of pegylation on pharmaceuticals. Nat Rev Drug Discov, 2(3), 214-221.
25. Imran M., Arora M., Asdaq S., Khan S., Alaqel S., Alshammari M., Alshehri M., et al. (2021). Discovery, Development, and Patent Trends on Molnupiravir, A Prospective Oral Treatment for COVID-19. Review Molecules, 26(19), 5795.
26. Kalil A., Patterson T., Mehta A., Tomashek K., Wolfe C., Ghazaryan V., Marconi V., et al., and ACTT-2 Study Group Members. (2021). Baricitinib plus Remdesivir for Hospitalized Adults with Covid-19. Randomized Controlled Trial N Engl J Med, 384(9), 795-807.
27. Krishnan H., Leema M., Gopika G., Hari Prasad P., Rajan A., Anil A., Dev A. and Pillai Z. (2021). SARS CoV-2, Progression and treatment protocols – An overview. Mater Today Proc, 46, 3144-3147.
28. Kumar R., Lee M., Mickael C., Kassa H., Pasha Q., Tuder R. and Graham B. (2020). Pathophysiology and potential future therapeutic targets using preclinical models of COVID-19. ERJ Open Res, 6(4), 00405-2020.
29. Kumar A., Mancy S., Manjunath K., Kulkarni S. and Jagadeesh R. (2019). Formulation and Evaluation of Fluvoxamine Maleate Loaded Lipid Nanoparticle. Int J Pharm Sci Nanotechnol, 12(4), 4593-4600.
30. Layqah L. and Eissa S. (2019). An Electrochemical Immunosensor for the Corona Virus Associated with the Middle East Respiratory Syndrome Using an Array of Gold Nanoparticle-Modified Carbon Electrodes. Microchimica Acta, 186, 224.
31. Levin E., Lustig Y., Cohen C., Fluss R., Indenbaum V., Amit S., Doolman R., et al. (2021). Waning Immune Humoral Response to BNT162b2 Covid-19 Vaccine over 6 Months. N Engl J Med, 385(24), e84.
32. Li H. and Rothberg L. (2004). Colorimetric Detection of DNA Sequences Based on Electrostatic Interactions with Unmodified Gold Nanoparticles. Proc Natl Acad Sci USA, 101, 14036-14039.
33. Liu S., Wang Z., Xie H., Liu A., Lamb D. and Pang D. (2020). Single-Virus Tracking, From Imaging Methodologies to Virological Applications. Chem Rev, 120, 1936-1979.
34. Liu D., Ju C., Han C., Shi R., Chen X., Duan D., Yan J., et al. (2021). Nanozyme Chemiluminescence Paper Test for Rapid and Sensitive Detection of SARS-CoV-2 Antigen. Biosens Bioelectron, 173, 112817.
35. Lu L., Ding Y., Zhang Y., Rodney J., Ho Y., Zhao Y., Zhang T. and Guo C. (2018). Antibody-modified liposomes for tumor-targeting delivery of timosaponin AIII. Int J Nanomedicine, 13, 1927–1944.
36. Maas M., Kim M., Malkani R., Abbott S. and Zee P. (2021). Obstructive Sleep Apnea and Risk of COVID-19 Infection, Hospitalization and Respiratory Failure. Sleep Breath, 25(2), 1155-1157.
37. Mahase E. (2021). Molnupiravir reduces risk of hospital admission or death by 50% in patients at risk, MSD reports. BMJ, 375, n2422.
38. Malone B., Urakova N., Snijder E. and Campbell E. (2022). Structures and functions of coronavirus replication–transcription complexes and their relevance for SARS-CoV-2 drug design. Nature Rev Mol Cell Biol 23, 21-39.
39. Martínez-Paredes G., González-García M.B. and Costa-García A. (2009). Genosensor for SARS Virus Detection Based on Gold Nanostructured Screen-printed Carbon Electrodes. Electroanal. Int J Devoted Fundam Pract Asp Electroanal, 21, 379-385.
40. McDonald E. and Lee T. (2022). Nirmatrelvir-ritonavir for COVID-19. CMAJ, 194(6), E218.
41. Mohammed S. and Shaaban E. (2019). Efficacious nanomedicine track toward combating COVID-19. Randomized Controlled Trial N Engl J Med, 381(24), 2293-2303.
42. Moitra P., Alafeef M., Dighe K., Frieman M. and Pan D. (2020). Selective Naked-Eye Detection of SARS-CoV-2 Mediated by N Gene Targeted Antisense Oligonucleotide Capped Plasmonic Nanoparticles. ACS Nano, 14, 7617-7627.
43. Mulangu S., Dodd L., Davey R. Jr., Mbaya O., Proschan M., Mukadi D., Manzo M., et al., and PALM Consortium Study Team. (2019). A Randomized, Controlled Trial of Ebola Virus Disease Therapeutics. N Engl J Med, 381, 2293-2303.
44. Nomura T., Nazmul T., Yoshimoto R., Higashiura A., Oda K. and Sakaguchi T. (2021). Ethanol Susceptibility of SARS-CoV-2 and Other Enveloped Viruses. Biocontrol Sci 2021, 26(3), 177-180.
45. Owen D., Allerton C., Anderson A., Aschenbrenner L., Avery M., Berritt S., Boras B., et al. (2021). An oral SARS-CoV-2 M(pro) inhibitor clinical candidate for the treatment of COVID-19. Science 374(6575), 1586-1593.
46. Painter W., Holman W., Bush J., Almazedi F., Malik H., Eraut N., Morin M., et al. (2021). Human Safety, Tolerability, and Pharmacokinetics of Molnupiravir, a Novel Broad-Spectrum Oral Antiviral Agent with Activity Against SARS-CoV-2. Antimicrob Agents Chemother, 65, e02428-20.
47. Park T., Lee S., Lee S., Park J., Yang K., Lee K.-B., Ko S., et al. (2006). Protein Nanopatterns and Biosensors Using Gold Binding Polypeptide as a Fusion Partner.  Anal Chem, 7197–7205.
48. Pham K., Li D., Guo S., Penzak S., and Dong X. (2016). Development and in vivo evaluation of child-friendly lopinavir/ritonavir pediatric granules utilizing novel in situ self-assembly nanoparticles. J Control Release, 226, 88-97.
49. Pini M., Cedillo González E., Neri P., Siligardi C., and Ferrari A. (2017). Assessment of Environmental Performance of TiO2 Nanoparticles Coated Self-Cleaning Float Glass. Coatings, 7, 8.
50. Polack F.P., Thomas S.J., Kitchin N., Absalon J., Gurtman A., Lockhart S., Perez J.L., et al., and C4591001 Clinical Trial Group. (2020). Safety and Efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid–19 Vaccine. N Engl J Med, 383(27), 2603-2615.
51. Rashedi J., Poor B., Asgharzadeh V., Pourostadi M., Kafil H., Vegari A., Tayebi-Khosroshahi H., et al. (2020). Risk Factors for COVID-19. Infez Med, 28(4), 469-474.
52. Rasmi Y., Saloua K., Nemati M., and Choi J. (2021). Recent Progress in Nanotechnology for COVID-19 Prevention, Diagnostics and Treatment. Review Nanomaterials (Basel), 11(7), 1788.
53. RECOVERY Collaborative Group. (2020). Lopinavir-ritonavir in patients admitted to hospital with COVID-19 (RECOVERY), a randomised, controlled, open-label, platform trial. Randomized Controlled Trial Lancet, 396(10259), 1345-1352.
54. Reis G., Dos Santos Moreira-Silva E.A., Silva D.C.M., Thabane L., Milagres A.C., Ferreira T.S., Dos Santos C.V.Q., et al., and TOGETHER investigators. (2022). Effect of early treatment with fluvoxamine on risk of emergency care and hospitalisation among patients with COVID-19, the TOGETHER randomised, platform clinical trial. Lancet Glob Health, 10(1), e42–e51.
55. de M Ribeiro N. and Fonseca B. (2020). The role of pharmaceutical nanotechnology in the time of COVID-19 pandemic Review Future Microbiol, 15, 1571-1582.
56. Roh C. and Jo S. (2011). Quantitative and Sensitive Detection of SARS Coronavirus Nucleocapsid Protein Using Quantum Dots-Conjugated RNA Aptamer on Chip. J Chem Technol Biotechnol, 86, 1475-1479.
57. Shan B., Broza Y., Li W., Wang Y., Wu S., Liu Z., Wang J., et al. (2020). Multiplexed Nanomaterial-Based Sensor Array for Detection of COVID-19 in Exhaled Breath. ACS Nano, 14, 12125-12132.
58. Somvanshi S., Kharat B., Saraf S., Somwanshi S., Shejul S. and Jadhav K. (2020). Multifunctional Nano-Magnetic Particles Assisted Viral RNA-Extraction Protocol for Potential Detection of COVID-19. Mater Res Innov, 25, 169-174.
59. Stone C., Liu Y., Relling M.V., Krantz M., Pratt A., Abreo A., Hemler J. and Phillips E. (2019). Immediate hypersensitivity to polyethylene glycols and polysorbates – more common than we have recognized. J Allergy Clin Immunol Pract, 7(5), 1533‐1540.
60. Patel T., Patel P., Barvaliya M., Saurabh M., Bhalla D. and Khoslae P. (2021). Efficacy and safety of lopinavir-ritonavir in COVID-19. A systematic review of randomized controlled trials. J Infect Public Health, 14(6), 740-748.
61. Thakur V., Ratho R., and Panda J. (2021). Respiratory delivery of favipiravir-tocilizumab combination through mucoadhesive protein-lipidic nanovesicles, prospective therapeutics against COVID-19. Virusdisease, 32(1), 131-136.
62. Tiwaskar M., Dhar R., Talwar D., Ansari A., Lakhe M., Panchal S., Bhagat S., et al. (2022). Real-world Experience with Favipiravir for Treatment of COVID-19 among Indian Healthcare Professionals. J Assoc Physicians India, 69(12), 11-12.
63. Thurston L. and Williams G. (2015). An examination of John Fewster’s role in the discovery of smallpox vaccination.  J Royal Coll Phys Edinburgh, 45, 173-79.
64. Tulbah A. and Lee W-H. (2021). Physicochemical Characteristics and In Vitro Toxicity/Anti-SARS-CoV-2 Activity of Favipiravir Solid Lipid Nanoparticles (SLNs). Pharmaceuticals (Basel), 14(10), 1059.
65. Vaze N., Pyrgiotakis G., McDevitt J., Mena L., Melo A., Bedugnis A., Kobzik L., et al. (2019). Inactivation of Common Hospital Acquired Pathogens on Surfaces and in Air Utilizing Engineered Water Nanostructures (EWNS) Based Nano-Sanitizers. Nanomed. Nanotechnol Biol Med, 18, 234-242.
66. V’kovski P., Kratzel A., Steiner S., Stalder H. and Thiel V. (2021). Coronavirus biology and replication, implications for SARS-CoV-2. Nature Rev Microbiol, 19, 155-170.
67. Wang Q., Zhang Y., Wu L., Niu S., Song C., Zhang Z., Lu G., et al. (2020). Structural and Functional Basis of SARS-CoV-2 Entry by Using Human ACE2. Cell. 181 (4), 894-904.
68. Warren T., Jordan R., Lo M., Ray A., Mackman R., Soloveva V., Siegel D., et al. (2016). Therapeutic efficacy of the small molecule GS-5734 against Ebola virus in rhesus monkeys. Nature, 531(7594), 381-385.
69. Wen W., Chen C., Tang J., Wang C., Zhou M., Cheng Y., Zhou X., et al. (2022). Efficacy and safety of three new oral antiviral treatment (molnupiravir, fluvoxamine and Paxlovid) for COVID-19: a meta-analysis. Ann Med, 54(1), 516-523.
70. Wu F., Zhao S., Yu B., Chen Y-M., Wang W., Song Z-G., Hu Yi., et al. (2020). A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature, volume 579, 265-269.
71. Wu J., Wang H. and Li B. (2020). Structure-aided ACEI-capped remdesivir-loaded novel PLGA nanoparticles, toward a computational simulation design for anti-SARS-CoV-2 therapy. Phys Chem Chem Phys, 22, 28434-28439.
72. Yeh Y-T., Tang Y., Sebastian A., Dasgupta A., Perea-Lopez N., Albert I., Lu H., et al. (2016). Tunable and Label-Free Virus Enrichment for Ultrasensitive Virus Detection Using Carbon Nanotube Arrays. Sci Adv, 2, e1601026.
73. Zarębska-Michaluk D., Jaroszewicz J., Rogalska M., Martonik D., Pabjan P., Berkan-Kawińska A., Bolewska B., et al. (2021). Effectiveness of Tocilizumab with and without Dexamethasone in Patients with Severe COVID-19, A Retrospective Study. J Inflamm Res, 14, 3359-3366.
74. Zhang H., Kang Z., Gong H., Xu D., Wang J., Li Z., Cui X., et al. (2020). Digestive system is a potential route of COVID-19, an analysis of single-cell coexpression pattern of key proteins in viral entry process. Gut, 69, 1010-1018.
75. Zhong H., Zhu Z., Lin J., Cheung C.F., Lu V.L., Yan F., Chan C.Y., et al. (2020). Reusable and Recyclable Graphene Masks with Outstanding Superhydrophobic and Photothermal Performances. ACS Nano, 14(5), 6213-6221.
76. Zhou Y., Liao X., Song X., He M., Xiao F., Jin X., Xie X., et al. (2021). Severe Adaptive Immune Suppression May Be Why Patients With Severe COVID-19 Cannot Be Discharged From the ICU Even After Negative Viral Test. Front Immunol, 12, 755579.