Нови платформи за контрол на вирусните инфекции: системи за насочен транспорт и доставка на лекарства, основани на нанотехнологии

Резюме

Новото поколение наносистеми за транспорт и доставка на лекарства осигурява ефективна доставка на лекарства и ваксини до техните прицелни тъкани и органи със значително по-нисък риск от възникване на нежелани ефекти в сравнение с конвенционалните терапии. Този тип лекарствени препарати дават също така и възможност за модулиране на имунните реакции на организма към чужди и собствени антигени и за разработване на високочувствителни технологии за образна диагностика с цел ранно откриване на болести при човека. COVID-19 се оказа сериозно предизвикателство както за изследователската дейност, така и за клиничната медицина. медицината, така и за науката. Арсеналът за борба с тази „модерна” пандемия включва биосензори, диагностични устройства, антивирусни лекарства и ваксини, основани на нанотехнологични разработки – както предходно съществуващи, така и разработени специално за целта. Масовото разпространение и поразяващата мощ на SARS-CoV-2 създаде необходимост от тясна колаборация между секторите, занимаващи се с научноизследователска и развойна дейност. Това доведе до създаване на нови ефективни начини за предотвратяване и лечение на усложненията на COVID-19. Тези нови подходи по всяка вероятност ще продължат да се развиват и след потушаването на настоящата пандемична ситуация, за да бъдат прилагани и при други заболявания при човека.

Ключови думи/фрази: COVID-19, антивирусни средства, моноклонални антитела, ваксини, нанотехнологии

1. SARS-CoV-2 и COVID-19 – преглед на произхода на една „модерна” пандемия и ефектът й върху начина на мислене в областта на научните изследвания и в клиничната медицина

Счита се, че инфекцията със SARS-CoV-2 при човека е възникнала като зооноза през седмиците и месеците, предшествали първия документиран случай (който беше докладван в началото на декември 2019 г.) [69]. На 31. декември 2019 г. Световната здравна организация (СЗО) беше сезирана за бързо нарастващ брой случаи на атипична пневмония с неустановен причинител в град Ухан, Китай. На 7. януари 2020 г. причинителят беше идентифициран от местните здравни власти като неизвестен до този момент член на семейството на бета-коронавирусите. В края на януари 2020 г. генералният директор на СЗО д-р Тедрос Аданом Гебрейесус обяви, че новата епидемия от коронавирус е извънредна ситуация за общественото здраве от международно значение [https://www.who.int/news/item/30-01-2020-statement-on-the-second-meeting-of-the-international-health-regulations-(2005)-emergency-committee-regarding-the-outbreak-of-novel-coronavirus-(2019-ncov)]. Заслужава си да се отбележи, че по времето на това изявление броят на случаите общо беше около 100 и смъртни случаи сред инфектираните все още не бяха регистрирани, но вирусът беше успял да се разпространи в още около 20 страни освен Китай. Незабавно започнаха изследвания с цел разработване на методи за превенция на инфекцията и етиологично лечение. За тази цел се наложи да се обединят усилията на изследователи, клиницисти, биотехнологични и фармацевтични компании, като първите резултати под формата на изпитания на лекарства и ваксини се появиха още в следващите няколко месеца.

COVID-19 беше при възникването си (и все още е) предизвикателство както за изследователската дейност, така и за клиничната медицина. Неговата поява ни напомни отново за това, че еволюцията е процес, протичащ в реално време, както и ни представи за пореден път спектъра на разнообразие от еволюционни механизми и причинно-следствената връзка между промените, настъпващи на нано- и микрониво, и величината на ефектите от това върху макросвета. Тази „модерна” пандемия създаде необходимост от тясна колаборация между секторите, занимаващи се с научно-изследователска и развойна дейност с цел създадаване на нови, по-ефикасни начини за предотвратяване и лечение на заболяванията при човека. Показателен пример за тази колаборация е разработването на векторни и иРНК ваксини против инфекция със SARS-CoV-2. До края на 2019 г. одобрена за употреба при хора беше всичко на всичко една векторна ваксина (rVSV-ZEBOV или Ervebo на Merck, срещу инфекция с вируса Ебола). Въпреки че първите клинични изпитания на иРНК ваксина срещу бяс започнаха още през 2013 г., към момента на появата на SARS-CoV-2 нямаше одобрена нито една такава. Първата иРНК ваксина срещу SARS-CoV-2 (Comirnaty на Pfizer BioNTech) беше одобрена за спешна употреба на 11.12.2020 г., т.е. малко по-малко от година след началото на пандемията. Това наистина много бързо развитие в областта на ваксинопрофилактиката беше изтълкувано от широката публика като нередно или недостатъчно проверено и с това беше свързана голяма част от протестите срещу ваксинирането. Действително, за неспециалистите в областта вероятно е трудно да се оцени, че в областта на ваксинопрофилактиката на инфекциозните заболявания има много натрупани предходни данни – както по принцип, така и в областта на заболяванията, предизвикани от бета-коронавируси. Поради голямото количество предходно съществуваща информация, процесът на разработка на нови ваксини или адаптиране на налични ваксини може да бъде наистина много бърз и това не се отразява на тяхната ефикасност или безопасност на използване. Същото важи и за разработването на безопасни и ефективни лекарства срещу COVID-19. Използваните в момента антивирусни средства, за които има доказана значителна ефикасност в лечението на пациенти с COVID-19 (ремдесивир, фавипиравир и други) в по-голямата си част са лекарства, които преди това са претърпели дълги изпитания за използването им при лечението на други вирусни заболявания. Така че съвременните терапии на COVID-19 лечения не се основават на принципно нов механизъм на действие и може да се счита за експериментално доказано, че имат достатъчно добър профил на безопасност. Новостта в тези „нови“ ваксини се основава на използваните в тях нови подходи за въздействие на ваксинналния препарат върху прицелните молекули – нуклеинови киселини или белтъци.

2. Базови презумпции при развитието на платформи за насочен транспорт и доставка на лекарства, основани на нанотехнологии

По-голямата част от лекарствата навлизат в живите клетки чрез лиганд-рецепторно взаимодействие. Утвърдените консервативни терапии, най-общо казано, се основават на обогатяване на жизнената среда на прицелните клетки с лекарство, което да увеличи шанса за свързването му с мишената му на действие (напр. клетъчен рецептор). Рецептори от един и същи тип може да се експресират върху повече от един тип клетки и едно и също лекарство – лиганд може да се свърже с повече от един вид рецептор. Поради това, възможно е едно лекарство да въздейства върху повече от една прицелна тъкан, което води до плейотропни ефекти. Те могат да бъдат както положителни (благоприятно повлияване на повече от едно ниво), така и отрицателни (повишен риск от неблагоприятни ефекти, свързани с ефектите на лекарството върху тъкани и органи, различни от прицелните). Плейотропните ефекти са особено изразени при цитостатиците и лекарствата, използвани в психиатрията.

Безопасността и ефикасността на лекарствата (а също така и на ваксините) не зависят единствено от активната съставка на лекарството, но и от биологично неактивния компонент, отговорен за транспорта, доставката и освобождаването на лекарството – т.нар. вехикулум. Ролята на вехикулума се състои основно в регулация на взаимодействието на лекарството и прицелната тъкан.
Съгласно дефиницията, предоставена от Центровете за контрол и превенция на заболяванията (Centers for Disease Control and Prevention, CDC) в Атланта, САЩ, нанотехнологиите представляват: „…манипулиране на материята на близко до атомното ниво с цел производство на нови структури, материали и устройства… като се използват материали с най-голямо лонгитудинално измерение 1 – 100 нанометра… при който размер материалите започват да проявяват уникални свойства, които засягат [технитe] физически , химическr и биологични свойства.” https://www.cdc.gov/niosh/topics/nanotech/default.html#:~:text=Nanotechnology%20is%20the%20manipulation%20of,new%20structures%2C%20materials%20and%20devices.&text=Nanotechnology%20refers%20to%20engineered%20structures,between%201%20and%20100%20nanometers.

Наноматериалите се отличават със значително съотношение повърхност-обем, което значително повишава тяхната разтворимост във водна или липидна фаза (в зависимост от локацията на прицелните молекули и желания ефект) и е основа на тяхното използване за модулиране на разпределението на биоактивни вещества в различни прицелни клетки и тъкани. Размерът на частиците им е сравним с размера на биологичните макромолекули. Новото поколение нано-вехикулуми за фармацевтични продукти за хуманна употреба осигурява ефективна доставка на активното вещество до целта със значително по-нисък риск от неблагоприятни ефекти. Нанотехнологиите предоставят нови начини за преодоляване на природните бариери за навлизане на ксенобиотици, което води до подобряване на проникването на лекарствата в иначе трудно достъпни прицелни места (напр. кръвно-мозъчната бариера). Те могат да се използват за модулиране на имунните реакции към чуждите и собствените антигени и като инструмент за подпомагане на развитието на високочувствителни технологии за образна диагностика за ранно откриване на заболявания при човека. Разработени са и много други приложения на нанотехнологиите за целите на съвременната изследователска дейност. По-важните от тях са представени на на фиг. 1.

Фиг. 1. Някои от приложенията на нанотехнологиите в съвременната изследователска и развойна дейност.

Размерите на повечето вируси попада в диапазона между 20 и 250 нанометра. Това означава, че нанотехнологиите притежават много добър потенциал за използване с цел създаване на антивирусни средства.

SARS-CoV-2 притежава много висок инфекциозен потенциал (сравним с този на грипния вирус и вируса, причиняващ морбили). Лабораторните изследвания (включително молекулярно-биологични), рентеновата диагностика и компютърната томография се използват рутинно за диагностика на инфекция със SARS-CoV-2 и в клиничната диагностика на COVID-19. Находките от ренгенографското изследване и от компютърна томография, които се считат за „типични“ за COVID-19 (дифузни промени тип „матово стъкло”), обаче, се появят със значително изоставане след началото на първите симптоми и може да персистират дълго време след настъпването на подобрение в клиничния статус. Освен това провеждането им е свързано със значителна доза облъчване. Поради това, те трудно биха могли да се използват за рутинен скрининг и за диагностика на ранни етапи на заболяването. Първият лабораторен тест, разработен за целите на скрининга за COVID-19 беше основан на полимеразна верижна реакция със синтез на първа верига чрез обратна транскрипция (reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR). Това е донякъде парадоксално, тъй като този метод на изследване има много висока чувствителност, но има сравнително дълго технологично време, включващо подготовка на пробите, анализ и интерпретация на крайния резултати. Изпълнението му изисква специализирана апаратура и обучен персонал. Това го прави сравнително скъп и времеотнемащ диагностичен метод, т.е. неподходящ за рутинен скрининг. Впоследствие в практиката бяха въведени и т.нар. „бързи тестове”, каквито обикновено са рутинните скринингови тестове за инфекциозни причинители.

PCR-базираните тестове за откриване на болести при човека и животните са по дефиниция базирани на нанотехнологии (въпреки че принципът им на работа датира от 90-те години на ХХ век). Антигенните тестове за SARS-CoV-2 (които са друг пример за аналитични средства, базирани на нанотехнологии) бяха разработени по-късно с цел да се намали технологичното време за диагностика, да се намали сложността на изпълнение и да се направи лесно достъпна за пациентите и техните близки. Тези „бързи“ тестове, обаче, като допълнение към общите ограничения, свързани с нивото на инвазивност, имат и допълнителни проблеми, свързани с голямата вариация от марка до марка в чувствителността и специфичността на теста. Серологичните тестове (откриващи наличие на антитела – IgG, IgM в серум и понякога IgA в други биологични течности) могат да дадат информация за в момента протичащи и предходно случили се инфекции със SARS-CoV-2, но са по-малко приложими за пресимптоматично откриване на инфекции. Това е свързано с техния принцип на действие – тъй като развитието на имунен отговор изисква време, серологичните тестове трябва да се извършват със значително забавяне след самия акт на инфектиране и, нерядко, след началото на симптомите. Тъй като ваксините също пораждат антителен отговор, серологичните тестове често са ненадеждни при предходно ваксинирани симптоматични пациенти.

Биосензорите (друг тип устройства, базирани на нанотехнологии) бяха разработени за целите на диагностиката на инфекции със SARS-CoV-2 на сравнително ранен етап (първите статии, посветени на тази тема бяха публикувани през м. юни 2020 г.) [76]. Понастоящем, биосензори се използват в диагностиката на инфекции със SARS-CoV-2, но са все още предимно за изследователска употреба поради високата им цена.

Вирусната частица на SARS-CoV-2 е с размер около 100 nm, което е в средата на диапазона, характерен за вирусите, причиняващи инфекции при човека, както и в рамките на нанодиапазона. Потенциалът за приложение на лечения, базирани на нанотехнологии беше подложен на сериозно проучване от самото начало на пандемията. До настоящия момент са разработени и пилотно изпитани редица нанотехнологични подходи за целите на превенцията на инфекцията, диагностиката и лечението на COVID-19.

Вече съществуват няколко базирани на нанотехнологии устройства за детекция на SARS-CoV-2 с висока чувствителност и специфичност. Понастоящем те не заместват напълно, а по-скоро допълват рутинно използваните подходи за детекция, базирани на RT-PCR и антигенни тестове. Наскоро беше представен нов биосензор на базата на златни наночастици за откриване на SARS-CoV-2 в издишван въздух [75, 78, 27]. Ефективността на екстракцията на нуклеинови киселини за целите на детекцията на SARS-CoV-2 значително се подобрява с използване на магнитни наночастици [81, 97]. Нанокристалите с полупроводникови свойства (т.нар. квантови точки) бяха успешно използвани за изготвяне на биосензор за детекция на нуклеокапсидния антиген на SARS-CoV [70]. Подобни устройства бяха изготвени и за за откриване на SARS-CoV-2 [40 ]. Порази бързото развитие в областта, може да се очаква, че базираните на наноматериали устройства за детекция, лекарства и ваксини в близко бъдеще ще съставляват основната на управлението на пандемията [65, 50].

3. Наносистеми за доставка на антивирусни лекарства

3.1. Наноформулации за транспорт и доставка на лекарства – типове и потенциалните им приложения при лечение на вирусни инфекции

По дефиниция, нанофармацевтикът (наричан понякога и нанолекарство) представлява лекарство с размер на частиците в нанодиапазона. Наночастиците в този лекарствен продукт могат да имат различна форма и химичен състав. Тази част на нанофармацевтика, която отговаря за съхранението, транспорта и освобождаването на активната съставка се нарича нановехикулум (или наноносител). Активната съставка в състава на нанофармацевтика може да бъде разтворена, опакована, капсулирана, адсорбирана, конюгирана или свързана посредством химически връзки с частиците на нановехикулума.
Нановехикулумите могат да бъдат най-разнообразни. Схематично представяне на разработените досега основни видове нановехикулуми е показано на фиг. 2.

Фиг.2. Видове нановехикулуми

Най-често срещаните видове нановехикулуми са описани накратко по-долу. Повече внимание е отделено на липозомите, тъй като те бяха първите нановехикулуми, използвани за насочена доставка на лекарства и в момента са най-често използваният тип.

3.1.1. Наноформулации, основани на използване на липиди

От гледна точка на биобезопасността, липидите са най-подходящи за изработване на нановехикулуми. Те са като цяло биоразградими, биосъвместими, нетоксични и притежават много ниска имуногенност. Технологията им за производство е сравнително лесна и имат ниска себестойност [61]. В липидните наноформулации липидите се използват заедно с други вещества – повърхностноактивни вещества, разтворители, и др. Най-често използваните наноформулации на липидна основа включват липозоми, твърди липидни наночастици (ТЛЧ, solid lipid nanoparticles, SLN), наноемулсии и наносуспензии.

Липозоми

Липозомите са затворени мехурчета (везикули), съставени от две фази – водна и липидна. Водната фаза обикновено е във вътрешността на мехурчетата (сърцевина) и е изцяло обкръжена от един или повече липидни бислоя, съставен от естествени или синтетични фосфолипиди, подредени подобно на липидите в клетъчната мембрана. Липозомите, в зависимост от предназначението си и от технологията на получаване, могат да са еднослойни или многослойни (моно-, олиго- и мултиламеларни). Диаметърът на везикулата може да варира в относително широки граници – между 10 и 1000 nm.

Първото поколение (конвенционални) липозоми, разработени за целите на клиничната медицина, съдържаше хидрофилна биоактивна съставка във водната сърцевина на липозомите. Липозомите от по-късно поколение могат да съдържат в сърцевината си и липофилни съединения и могат да имат допълнителни модификации, предназначени да се увеличи времето на циркулация in vivo на липозомата и да се осигури насочено и контролирано по време навременно доставяне на лекарствения агент [37]. Схематично, различните типове липозоми са представени на фиг. 3.

Фиг. 3. Представяне на различните видове липозомни системи за доставка на лекарства.

Липозомите се получават от лесно достъпни и евтини изходни материали – най-често воден разтвор на фосфолипиди, който се подлага на обработка чрез различни методи: ултразвук (соникация), дехидратация-рехидратация, обратнофазово изпаряване, повтарящи се цикли на замразяване-размразяване, екструзия и др. [31]. Желаният размер и ламеларността на липозомите обикновено се постига чрез екструзия, като се използват филтри с пори с определен размер. Ефективността на улавяне на активни съставки може много да се различава при липозоми, получени чрез различни технологии. Точното насочване на терапевтичните липозоми към желаното място на доставка на лекарството най-често се постига чрез добавяне на лиганди към повърхността на везикулата [37].

Въпреки многото си предимства като нановехикулуми, липозомите имат и своите недостатъци. Сред тях са тяхната сравнително ниска стабилност, налагаща използване на специални модификации за повишаване на циркулационното време in vivo и техният относително нисък капацитет на поемане на лекарства. Производството на липозомите трудна се стандартизира и трудно се адаптира до големи промишлени обеми. Също така, независимо, че липидите рядко предизвикват имунологично-обусловени реакции, някои добавки в наноформулациите имат вътрешно присъщ риск да предизвикат имунни реакции (напр. PEG3350) [11].

Към настоящия момент в клиничната медицина се използван няколко липозомни препарата – за насочено доставяне на цитотоксични агенти, за вътреочно приложение, като адювантно пост-ирадиационно лечение с препарати на Т4 ендонуклеаза V при пациенти с екстремна чувствителност към ултравиолетова светлина, и други [95, 13, 49].

Липозоми, конюгирани с полиетиленгликол (PEG) понастоящем се използват във ваксините Comirnaty (Pfizer BioNTech) и Spikevax (Moderna).

Твърди липидни наночастици (ТЛЧ)

Твърдите липидни частици съдържат липиден матрикс, който при стайна температура (или при желаната температура) е в твърдо агрегатно състояние (триглицериди, стероиди, мастни киселини, восъци и др.). За разлика от липозомите, производството на ТЛЧ може да бъде лесно адаптирано до промишлени мащаби. Твърди липидни частици досега са били употребявани като вехикулуми за различни антивирусни лекарства (ритонавир, маравирок, дарунавир, ефавиренц, зидовудин, лопинавир, долутегравир и други – за подробности виж по-долу).

Следващото поколение ТЛЧ са т.нар. наноструктурирани липидни носители (nano-structured lipid carriers, NSLC). Там липидите са в течно агрегатно състояние, което придават повишена стабилност на структурата и по-добър контрол над освобождаването на лекарството.

Наноемулсии

Наноемулсиите са глобуларни еднофазни системи, състоящи се от емулгирани масла, вода и повърхностноактивни вещества. Те могат да поемат и транспортират сравнително голямо количество лекарство и се характеризират с висока хидрофилност и висока бионаличност на освободеното лекарство. До скоро наноемулсиите се използваха предимно и изключително за разработване на иновативни формулации на някои анти-HIV препарати, напр. протеазни инхибитори (саквинавир, индинавир) [90].

Самоемулгиращите се системи за доставяне на лекарства (self-emulsifying drug delivery systems, SNEDDS) представляват друг вид еднофазни системи, съдържащи липиди, вода и повърхностноактивни вещества. Те се използват като вехикулуми на липофилни лекарства, каквото е, например, анти-HIV лекарството невирапин (виж по-долу) [Selvam and Kulkarni, 2014].
Към днешна дата са разработени и наноемулсия [68] и суспензия от твърди липидни наночастици [87], съдържащи антивирусното лекарство фавипиравир, с цел насоченото му доставяне до белодробния епител при пациенти с COVID-19. Получените до момента резултати от in vitro проучвания са обнадеждаващи.

3.1.2. Наноформулации, основани на използване на полимери

За изготвяне на полимерни наноформулации могат да се използват най-различни естествени и синтетични полимери. Често използвани хидрофилни полимери са, например, желатин, албумин, алгинова киселина, декстран, хитозан, агароза и други. От липофилните полимери, използвани за изготвяне на наноформулации, могат бъдат споменати полимерите на млечната киселина (polylactic acid, PLA), кополимери на млечната и гликоловата киселина (polylactide-co-glycolic acid, PLGA), полистирен, поликапролактон (polycaprolactone, PECL), полиметакрилат (polymethacrylate, PMMA) и други. Към полимерния скелет могат да бъдат добавени повърхностни модификации с цел подобряване на фармакокинетиката и намаляване на потенциалната имуногенност. Други специални модификации се използват, за да се осигури тригерирано (предизвикано от конкретен стимул) освобождаване на лекарството – например в отговор на промени в киселинността на средата, температурата и други стимули. За целите на онкологията бяха разработени специални полимери, инхибиращи P-gp и други белтъци, свързани с множествената лекарствена резистентност (multidrug resistance, MDR).

Използваните до момента полимерни наноформулации включват полимерни мицели, полимерни твърди наночастици, нанокапсули и наносфери.

Полимерни мицели

Полимерните мицели са наноструктури, изготвени от амфифилни кополимери, като всяка структура (унимер) се състои от хидрофобна и хидрофилна субединица. Унимерите се свързват и образуват структури с хидрофобна сърцевина ​​и хидрофилна обвивка – т.нар. мицели. В хидрофобната сърцевина могат да бъдат поети и транспортирани лекарства с лоша водоразтворимост, а хидрофилната обвивка е отговорна за транспортирането и насоченото освобождаване на лекарството. Като липофилни полимери на сърцевината могат да се използват полиестери, поликапролактон, полиаминокиселини и др. Основният компонент на хидрофилната обвивка е полиетиленгликолът, върху която могат да се въведат различни модификации в зависимост от желания ефект – напр. добавяне на остатъци от сиалова киселина. Сиализация на външната хидрофилна обвивка на наномицели беше използвана в едно проучване, в което се изследваха възможностите за предотвратяване на инфекция с грипния вирус. По-точно, сиализираните наномицели бяха предназначени за свързване на хемаглутинина на грипния вирус, за да се предотврати навлизането на вируса в клетката [1]. Засега това и подобните му проучвания са на ниво изследователска дейност.

Полимерни наночастици

Полимерните наночастици могат да бъдат произведени от различни естествени или синтетични полимери. Типични представители са т. нар. нанокапсули, които подобно на мицелите улавят и задържат лекарството в сърцевината си. Възможен е и друг вариант – лекарството се адсорбира върху повърхността или е вградено в матрицата на наночастицата. Тогава структурата се нарича наносфера. Полимерни наночастици са използвани за разработване на иновативни формулации на рутинно използвани анти-HIV лекарства – напр. ефавиренц, лопинавир, ритонавир и други.

Полимерни лекарствени конюгати

Полимерните лекарствени конюгати съдържат полимер и ковалентно свързано с него лекарство. Лекарството обикновено е с малка молекула, но може да бъде и по-голяма молекула, напр. белтък. Повечето приложения на полимерни лекарствени конюгати в момента са в клиничната онкология (даунорубицин, доксорубицин, метотрексат, мелфалан и др.) и офталмологията (даунорубицин) [62, 20]. Полимерни конюгати се прилагат и в антивирусната терапия. Например, конюгираните с ПЕГ (ПЕГилирани) интерферони бяха доста време единственото високоефективно лечение за HCV [17]. Конюгатите на зидовудина имат по-дълъг плазмен полуживот от конвенционалния препарат [38]. През 2018 г. Andersen et al. използваха кополимер на N-(2-хидроксипропил)метакриламид и албумин за подобряване на доставката на комбинация от анти-HIV лекарства до първични човешки Т клетки. Резултатите от това проучване бяха много обещаващи, и в момента този и подобните му кополимери се изследват активно с цел насочена доставка на други лекарства.

Нанокапсули

Както описаните по-горе структури, нанокапсулата също се състои от сърцевина ​​(съдържаща лекарството) и обвивка. Нанокапсулите, обаче, могат да бъдат заредени със значително по-големи количества лекарство, отколкото липозомите, което може да се насочва към желаната тъкан и да се освобождава контролирано. За целите на анти-HIV терапията са проектирани нанокапсули с полиизо-бутилцианоакрилатна сърцевина, съдържащи зидовудин и обвивка от полиетиленимин.

Наносфери

Наносферите са сферични структури, в които лекарството не е затворено в сърцевината, а се намира в обвивката или е диспергирано в липидния матрикс. Наносферите имат по-малък размер от нанокапсулите, съответно съдържат по-малко количество от лекарството и могат да бъдат бързо елиминирани от циркулацията. Разработени са формулации за локално приложение на ацикловир в наносфери от хитозан за лечение на инфекции, причинени от вируса на херпес симплекс.

Липид-полимерни хибридни наноформулации

Нерядко, при лечението на вирусни инфекция едно лекарство не е достатъчно и се налага да се приложи комбинирана терапия. От друга страна, рискът пациентът да не взима предписаните му лекарства нараства, когато му се налага да приема повече от два препарата. Това налага повече от едно лекарство (често с различни физикохимични свойства) да бъдат доставени в една и съща лекарствена форма. Едновременна доставка на повече от едно лекарство може да се постигне с помощта на липидно-полимерни хибридни наночастици. Разработени са няколко различни типа хибридни липид-полимерни системи – наночастици с полимерна сърцевина и липидна обвивка, наночастици с обвивка от липиди и полимер и куха сърцевина, полимерни наночастици с двуслойно покритие от липиди, наночастици с полимерна клетка и др. Най-общо казано, хибридните липидно-полимерни наноформулации се състоят от полимерна сърцевина, обградена от един или повече външни слоеве, изградени от липиди или от липид и друг полимер. Наночастиците с полимерна клетка са малко по-различни, тъй като те включват и липозоми, чиято повърхност е модифицирана чрез кръстосано свързване с полимери. Липид-полимерните хибридни наноформулации се характеризират с много висок капацитет за поемане на лекарства.

Биомиметичните липид-полимерни хибридни наноформулации са вариант на липид-полимерните. При тях повърхността на наночастиците е модифицирана така, че да наподобява белтъци от клетъчната повърхност. В тази категория се включват вирусоподобните частици (virus-like particles (VLP) и вирозомите виж по-долу).

Тригерираните (стимул-асоциирани) липид-полимерни хибридни наночастици са способни да освобождават капсулираното лекарство в отговор на различни стимули като промени в рН на средата, температура, магнитно поле и пр., като по този начин лекарството се доставя на желаното място и в желаното време. През 2012 г. бяха докладвани резултати от използване на естер на стеариновата киселина с метилцелулоза като термочувствителен вехикулум за бавно интравагинално освобождаване на антиретровирусното лекарство тенофовир [38]. По подобна технология по-късно беше разработен хибриден термочувствителен хидрогел за едновременно доставяне на теафлавин (хидрофилен антиоксидант) и нифевирок (хидрофобен антивирусен агент) за интравагинално приложение като пре-експозиционна профилактика на ХИВ. Термочувствителните хидрогелове се проучват и във връзка с потенциала им за интраназално доставяне на антивирусни лекарства.

Наночастиците могат да имат различни размери (в нанодиапазона) и различна форма. Съществуват един специфичен тип липид-полимерни хибридни наноформулации, при които се използва експериментално установеният факт, че формата на частица с наноразмери може да има значително влияние върху междуклетъчните взаимодействия и, съответно, върху биоразпределението на лекарството, с което е натоварена [8]. Например, установено е, че натоварените с цитостатици наночастици с форма, различна от сферичната осигуряват по-висока терапевтична ефикасност в сравнение със сферичните частици [74]. Това налага изследване на различни варианти, за да се подобрят фармакокинетичните свойства на конкретното лекарство.

3.1.3. Дендримери

Дендримерите са синтетични, силно разклонени триизмерни наноструктури с диаметър 2–10 nm. Те се състоят от сърцевина, вътрешна обвивка и външна обвивка, която може да носи върху себе си различни модификации [83]. Дендримерите се синтезират чрез последователно добавяне на субединици към инициираща молекула. Схема на един относително просто изграден полиетилениминов дендример е представена на фиг. 4.

Външната обвивка на дендримера може да бъде ковалентно модифицирана (напр. естерифицирана, гликозилирана и т.н.) или конюгирана с протеини, пептиди и т.н. Дендримерите имат дълго време на циркулация in vivo, добра стабилност, водоразтворимост и поради функционалните групи на повърхността си могат да взаимодействат със специфични прицелни молекули. В сърцевината на дендримера могат да се поместят различни субстанции.
Към момента основната изследователска и развойна дейност се извършва с дендримери, направени от полиамидоамини, полипропиленимин и поли-L-лизин. Дендримери с добавена странична тиолова група, използвани като топикално средство, осигуряват удължено освобождаване на ацикловир за защита срещу първично заразяване със вируса на Herpes simplex или срещу ерупция на характерния обрив при индивиди, които са носители на вируса [83]. Полианионни карбосиланови дендримери бяха използвани като вехикулум в топикално средство за локална защита срещу проникване на вирусите на HIV. Оказа се, че самият полимер притежава свойството да инхибира интернализацията на HIV-1 в епителните клетки и навлизането му в мононуклеарните клетки на периферната кръв [83].

Фиг. 4. Дендример от полиетиленимин

3.1.4. Въглеродни наноформулации

Въглерод-базираните наноформулации включват въглеродни нанотръбички, наночастици от графенов оксид и фулерени.

Графен

Графенът е алотропна форма на въглерода, в която атомите са подредени така, че да образуват двумерна структура от правилно подредени, свързани помежду си клетки – т.нар. листове. Материалите на основа графен, предназначени за изследователски или клинични цели, често биват модифицирани чрез прибавяне на различни функционални групи с цел за подобряване на биосъвместимостта и намаляване на потенциалната токсичност. Функционалните групи формират места за прикрепване на различни биологични молекули. Графен-базираните наноструктури могат да поемат както хидрофилни, така и липофилни лекарства.

Въглеродни нанотръбички (carbon nanotubes, CNT)
Въглеродните нанотръбички са кухи цилиндрични наноструктури със стени, направени от един или повече графенови листа. Отворите на цилиндъра могат да бъдат „запушени“ с друга структура (напр. фулерен) откъм единия или откъм двата края. Въглеродните нанотръбички имат отличен потенциал за поемане на лекарства и контролираното им освобождаване. Засега, обаче, техните приложения в медицината са ограничени поради високата им липофилност и доказаната им белодробна токсичност. Разработват се по-нови, подобрени видове въглеродни нанотръбички с по-ниска токсичност и по-висока биоразградимост.

Фулерени

Фулерените са тримерни въглеродни структури, образуващи кухи клетки с размери в нанодиапазона. Установено е, че някои фулерени инхибират репликацията на HIV, HCV и грипния вирус чрез пространствено пречене, а също така инхибират и експресията на вирусни белтъци.

3.1.5. Неорганични наноформулации

Квантови точки (Quantum dots, QT)
Квантовите точки са нанокристали с полупроводникови свойства. Те се състоят от неорганична сърцевина, отговорна за електропроводимостта ​​(силиций, кадмиев селенид, кадмиев сулфид, индиев арсенид и др.), хидрофилна обвивка и различни лиганди. Квантовите точки намират своите приложения за медицински цели предимно в образната диагностика, тъй като могат да абсорбират и излъчват светлина при предварително зададени дължини на вълната. Като лекарствени вехикулуми, модифицираните квантови точки имат потенциал за приложение при лечението на HIV [42].

Метали и наночастици от метални оксиди

Някои метали и метални оксиди имат вътрешно присъща микробицидна и антивирусна активност. Такива са сребърните, златните, медните, титановите, цериевите оксиди и др. Към тях могат да бъдат конюгирани различни биологично активни субстанции. Повърхността на металните наночастици може да бъде функционализирана чрез ковалентно свързане с различни функционални групи с цел подобряване на междумолекулните взаимодействия, бионаличността на лекарството и освобождаването му. Напмример, малки интерфериращи РНК са били конюгирани със златни наночастици и получената наноформулация е показала висока активност за инхибиране на репликацията на вируса на денга, както на и освобождаването на новосглобени вирусни частици. Установено е, че сребърните наночастици инхибират хемаглутинацията и индуцираната от H1N1-грипен вирус апоптоза в клетъчни култури. Сребърни наночастици, конюгирани с танинова киселина подтискат инфекцията с HSV-2 както in vitro, така и in vivo [43]. В миши модели на вагинални инфекции с HSV-2 използването на наночастици от цинков оксид показва обещаващи резултати по отношение на потискането на вирусната активност.

Използването на неорганични наночастици е до голяма степен ограничено поради опасения за токсичност [43]. Разработват се по-нови формулации с по-ниска токсичност, но клиничните изпитания при хора все още са силно ограничени.

3.1.6. Нанотехнологии, базирани на използване на нуклеинови киселини

Аптамери

Аптамерите са къси фрагменти от нуклеинови киселини (олигонуклеотиди) или от белтъчни последователности (пептиди), които могат специфично да се свързват с други нуклеинови киселини и белтъци [34]. Х-аптамерите са специфична отделна категория. Те представляват комбинация от естествени и изкуствено създадени или химически модифицирани ДНК или РНК олигонуклеотиди. Вместо характерния за естествените нуклеинови киселини пентозофосфатен скелет, аптамерите могат да имат тиофосфатен скелет, който се отличава с повишена резистентност към нуклеазни активности и по-висок афинитет на свързване [45].

Терапевтичният потенциал на аптамерите е известен от над 20 години. Препарат от ПЕГилирани аптамери се използва и в момента за насочено подтискане на пролиферацията на съдовия ендотел в окото. Полученият препарат (пегаптаниб, Macugen на Bausch & Lomb) е одобрен за употреба като интравитреална инжекция при дегенерация на макулата [85]. Аптамери, насочени към ключови молекули от коагулационната каскада като напр. Фактор IXa, тромбин и фактор на фон Вилебранд в момента се изпитват за приложение като потенциални антикоагуланти при разстройства на кръвосъсирването [57].

Онкологията е благодатна област за разработване на аптамери с терапевтично приложение. Аптамери, насочени срещу нуклеолин, простатно-специфичен мембранен антиген (prostate-specific membrane antigen, PSMA), карциноембрионален антиген (carcinoembryonic antigen, CEA), муцин 1 (MUC1), ErbB-2 (молекулярен таргет на моноклоналното тяло trastuzumab (Herceptin), използвано при лечение на карцином на млечната жлеза) и други белтъци, играещи роля в хода на карциногенезата са били последователно обект на изпитване като антиракови средства [72, 43, 22, 86]. Към момента все още няма одобрено онкологично лекарство, базирана на аптамери.

Установено е, че аптамерите инхибират различни етапи на HIV инфекцията чрез свързване с обратната транскриптаза и интегразата на вируса [19, 71]. Разработени са аптамери срещу хемаглутинина на грипния вирус [53]. Базирани на аптамери биосензори бяха създадени за целите на детекция на SARS-CoV и, впоследствие, на SARS-CoV-2 [16, 70; 63]. През 2021 г. аптамери бяха използвани от Sun et al. за предотвратяване на свързването на шиповия протеин на вируса към мембранно-свързаната форма на ангиотензин-конвертиращия ензим тип 2 (т.нар. АСЕ рецептор) на клетката-гостоприемник, която е основната входна врата на вируса в белодробния епител и други тъкани [82].

Антисенс олигонуклеотиди (antisense oligonucleotides, ASO)

Антисенс олигонуклеотидите са изкуствени къси едноверижни нуклеинови киселини, които са проектирани специално да свързват и инхибират иРНК. ASO, предназначени за използване при борбата с вирусни заболявания таргетират тези иРНК, които кодират ключово важни за инфекцията белтъци на вируса. Първият официално одобрен за употреба ASO беше фомивирсен (Vitravene на Novartis). Той представлява олигодеоксирибонуклеотид с дължина 21 нуклеотида, комплементарен на последователността, кодираща ранните белтъци на цитомегаловируса. Vitravene беше изтеглен „по търговски причини“от пазара през 2002 г. [Public Statement on Vitravene (fomivirsen) (europa.eu)].Подробно обяснение на причината за изтеглянето не беше дадена.

До момента са описани три поколения ASO, които се различават по своите химични характеристики, фармакокинетика, ефикасност и токсичност. ASO от първо поколение имат тиофосфатен скелет, което води до повишена устойчивост на хидролиза. Фомивирсен беше ASO от първо поколение. ASO от второ поколение са модифицирани на позиция 2 в пентозния остатък, което им позволява да създават стерично пречене при междумолекулните взаимодействия. Един от по-известните ASO от второ поколение, мипомирсен (Kynamro, от Genzyme) беше забранен за употреба от Европейската агенция по лекарствата скоро след излизането му на пазара поради тежки нежелани ефекти [http://www.fiercebiotech.com/regulatory/ema-committee-shoots-down-sanofi-s-cholesterol-drug-mipomersen]. ASO от трето поколение имат много висока нуклеазна резистентност, повишен афинитет към прицелните молекули и подобрена фармакокинетика в сравнение с предишните поколения. Такъв е, напр. напр. Етерлипсен – предлаган на пазара като препарата ExonDys на AVI BioPharma International за лечение на мускулна дистрофия на Дюшен)

През 2004 г., малко след началото на първата епидемия от човешки бета-коронавирус, беше съобщено за разработването на няколко ASO от второ поколение срещу причинителя на SARS-CoV [56]. Те таргетират, най-общо казано, отворената рамка за четене на основния полипротеин на вируса (ORF1) и неговата 5′-нетранслирана регулаторна последователност. In vitro те демонстрираха значителна антивирусна активност. След това бяха проектирани ASO, насочени към мястото за иницииране на транслацията на ORF1 и мястото, където се извършва изместването на рамката за четене, за да може от една последователност да се транскрибира повече от един полипротеин (т.нар. „псевдовъзел“) [1]. По-късно AVI Biopharma разработи ASO, насочени към 3’-нетранслираната последователност на вирусната РНК [AVI BioPharma’s NeuGene antisense drugs inhibit SARS coronavirus (pharmabiz.com)]. През 2020 г. беше съобщено за разработването на бърза и високочувствителна система за откриване на наличието на РНК на SARS-CoV-2 [51]. Тя е базирана на ASO, конюгирани със златни наночастици. Детекцията се извършва чрез колориметричен анализ. Тези ASO са от първо поколение и са специфични за гена, кодиращ нуклеокапсидния фосфопротеин на SARS-CoV-2. Според авторите на цитираното проучване, тяхната методология позволява чрез цветна реакция, неизискваща специална апаратура, да бъдат открити много ниски количества на РНК на SARS-CoV-2 (няколко копия на вирусния геном).

Малки интерфериращи РНК (small interfering RNAs, siRNA)

Малките интерфериращи РНК са изкуствено създадени къси двуверижни РНК молекули, които имат свойството да подтискат експресията на специфични гени. Някои от тях се използват (сравнително отскоро) в клиничната медицина. По-важни техни представители са патисиран и живосиран, които в момента намират приложение в специфичното лечение на генетични заболявания. И двете имат статут на „първо по рода си“ лекарство [9]. Според дефиницията на FDA, „първо по рода си“е лекарство, което действа чрез „нов и уникален механизъм на действие“за лечение на определено заболяване или състояние [FDA approves first-of-its kind targeted RNA-based therapy to treat a rare disease | FDA].

Патисиран (Onpattro на Alnylam) е одобрен за лечение на полиневропатия при пациенти с наследствена транстиретинова амилоидоза (причинена от мутации в транстиретиновия (TTR) ген при човека) [Onpattro | European Medicines Agency (europa.eu)]. Лекарството таргетира специфично иРНК на мутантната форма на hTTR гена. Мутантният алел кодира белтък, който се конформира неправилно, поради което се метаболизира неправилно и продуктите от неговото разграждане се отлагат в много тъкани и органи. Лекарство за лечение на транстиретинова амилоидоза от същия клас, но от по-ново поколение, е ревусиран, който се произвежда от същата компания. Живосиран (Givlaari на Alnylam) е друго siRNA лекарство, използвано при лечението на остра чернодробна порфирия (генетично заболяване, причинено от мутации в гена ALAS1). Установено е, че живосиран намалява честотата на пристъпите на остра порфирия при пациентите-носители на мутации в този ген и намалява хроничната болка, която е основният симптом при това заболяване [Balwani et al., 2020].

И трите лекарства на Alnylam, съдържащи малки интерфериращи РНК, се основават на нанотехнологии. Патисиран се доставя насочено до черния дроб (където се експресира прицелният ген), опакован в липидни наночастици. По този начин се повишава резистентността на препарата към разграждане от нуклеази. РНК в живосиран и ревусиран също е опакована в липидни наночастици и е ковалентно свързана с лиганд, съдържащ остатъци от сиалова киселина, което осигурява по-добро свързване с прицелните клетки в черния дроб. Проникването на малките интерфериращи РНК в клетката се извършва чрез трансфекция и се осигурява от полимерни или липидни нановехикулуми (липозоми или липидни наночастици).

Една от по-ранните ваксини срещу инфекции с вируса Ебола (TKM-Ebola на Arbutus Biopharma Corporation) се основаваше на siRNA, капсулирана в липидни наночастици. Тази ваксина, обаче, не стигна до по-напреднали фази на клинични изпитания поради повишен риск от алергични реакции при пациентите.
Към момента, данните от експерименти върху животински модели показват, че, малки интерфериращи РНК, специфични за висококонсервативните участъци на генома на SARS-CoV-2 и опаковани в твърди липидни наночастици, могат да бъдат много ефикасни [4, 33]. Наноформулацията позволява фармацевтичният продукт да се достави преференциално в белия дроб, който е основно място за репликация на SARS-CoV-2. Авторите на цитираните проучвания, обаче, показаха експериментално, че натоварените с лекарство наночастици могат, с неголеми модификации, да се насочат и към други таргетни органи – черен дроб, слезка, и, вероятно и на други места. Това е изключително ценно при COVID-19, който е мултисистемно заболяване и може да увреди практически всяка тъкан и орган, а не само белите дробове. Към януари 2022 г.в базата данни за малките интерфериращи РНК, насочени към SARS-CoV-2, се съдържаха над 100 000 siRNA с дължина от18 до 21 нуклеотида [47] и броят им непрекъснато нараства. Очаква се това да допринесе за ускоряване на процеса на създаване на нови базирани на siRNA лекарства срещу COVID-19.

3.2. Наноформулации, разработени специално с цел доставка на антивирусни лекарства

Съвременните антивирусни лекарства имат висока ефикасност, но имат и своите ограничения. При немалка част от пациентите се налага прием на повече от едно лекарство, но антивирусните лекарства могат да взаимодействат помежду си, както и с други лекарства. Антивирусните лекарства често имат ниска бионаличност и кратък полуживот, което води до необходимост от многократно дозиране и, съответно, рискът пациентът да не взима лекарствата точно както е предписано се повишава. Прилагането на по-високи дози от лекарствата в опит да се компенсира ниската бионаличност може да доведе до токсични ефекти, особено при пациенти с генетично обусловени особености на метаболизма. Много вируси могат да проникнат в места, които са недостъпни за повечето лекарства (т.нар. „вирусни убежища“ – такива са, например, централната нервна система, лимфната система и синовиалната течност. При някои пациенти се налага продължително лечение. COVID-19 е сред инфекциозните заболявания, които могат да имат дълго протичане (честотата на синдрома на продължителен COVID достига 40-50% в някои проучвания) [54]. Развитието на лекарствена резистентност е често срещано при пациенти, които се нуждаят от лечение, което продължава повече от няколко дни или седмици. Накрая (но не по важност) е фактът, че тъй като вирусът използва клетъчния апарат на гостоприемника за синтез на своите белтъци и нуклеинови киселини, селективността на антивирусните агенти спрямо вируса и целевите клетки може да бъде критично важна. Новите платформи за доставка на лекарства, базирани на нанотехнологии могат да помогнат при намирането на решения на много от тези проблеми.

Допреди появата на SARS-CoV-2, най-честите заболявания при човека, причинени от РНК-съдържащи вируси бяха грип, хепатит С и HIV-свързаните състояния. Поради това, по-голямата част от информацията в тази връзка касае лечението на тези заболявания. Много лекарства, използвани успешно за лечение на инфекции с HIV и HCV, са изпитани или са в момента в изпитания за активност срещу SARS-CoV-2, като няколко от тях вече си използват успешно при лечението на COVID-19.

Поради това за целите на изложението може да се използва стандартната класификация на антивирусните средства, одобрени за лечение на HCV и HIV. Най-общо казано, по място на действие и патогенетичен механизъм тези лекарства могат да бъдат:

1. Интерферони;
2. Лекарства, инхибиращи навлизането на вируса в клетката (entry blockers);
3. Нуклеозидни/нуклеотидни аналози, инхибиращи репликацията на вируса (nucleoside reverse transcriptase inhibitors, NRTI);
4. Лекарства, инхибиращи репликацията, които не са нуклеозиди (non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors, NNRTI);
5. Лекарства, инхибиращи хидролизата на полипротеините на вируса (протеазни инхибитори, protease inhibitors, PI);
6. Лекарства, инхибиращи интеграцията на копия от вирусния геном в генома на клетката – гостоприемник (интегразни инхибитори, integrase inhibitors, II);
7. Антисенс нуклеотиди (ASO);
8. Малки интерфериращи РНК;
9. Други.

Антисенс нуклеотидите и малките интерфериращи РНК с активност при COVID-19 вече бяха разгледани по-горе.

Последната група, „Други“, се състои от различни лекарства, които обикновено се използват в клиничната медицина при други заболявания, като антималарици (напр. хидроксихлорохин), антихелминтни агенти (левамизол, ивермектин), антидепресанти (флувоксамин) и др. Тяхната активност при COVID-19 се дължи на това, че действат на принципа на действие на лекарствата от някоя от описаните по-горе групи (инхибитори на репликацията, протеазни инхибитори и др.). Някои от тях, като ивермектин, имат документирана антивирусна активност in vitro, но резултатите in vivo все още не са налице или не са обнадеждаващи [39]. Други (като бромхексин хидрохлорид, за който се предполага, че има протеазно-инхибиторна активност) са показали в експериментални условия известна активност in vivo по отношение на предотвратяване на симптоматично заболяване, но ефектите не са били достатъчно значими, за да оправдаят повече изследвания в областта или клиничните изпитвания в ранната фаза още не са приключили [48]. Експериментално е демонстрирано, че хлорохинът подтиска навлизането на вируса по ендозомния механизъм в клетката при SARS-CoV, инхибира гликозилирането на ACE2 рецепторите [93, 94] и има противовъзпалително действие поради инхибиране на активността на фосфолипаза А2 и блокиране на производството и освобождаването на цитокини [2]. Засега, обаче, при изпитанията при болни със SARS-CoV-2, значителни антивирусни ефекти не са наблюдавани. Флувоксаминът е антидепресант от групата на селективните инхибитори на обратния захват на серотонин (SSRI), който първоначално беше считан за обещаващо лечение при пациенти с COVID-19. Засега, обаче, данните от клиничните изпитания не са обнадеждаващи, макар че теоретически е възможно да са необходими по-обширни проучвания, за да се изясни дали приложението на флувоксамин има ефект върху тежестта на заболяването [91]. През 2019 г. беше докладвано за разработване на нова наноформулация на флувоксамин, основана на твърди липидни наночастици, която осигурява ефикасно насочено освобождаване на лекарството [35]. Все още, обаче, на пазара няма флувоксамин- съдържащ препарат с тези свойства.

Повсеместното разпространение на COVID-19 доведе до значително повишаване на нивата на стрес за всички – засегнатите от вируса, техните близки, хората с висок риск от развитие на усложнения при евентуално заразяване, както и напълно здрави хора с нисък риск, които се опасяват от потенциалните последствия на една инфекция. Както е типично в подобни ситуации, още от самото начало на пандемията се появиха „чудотворни лекарства“, широко рекламирани от медиите. Повечето от тях не показаха никакви значителни ползи за тези, които ги приемаха. Вместо това, при много пациенти се развиха потенциално предотвратими усложнения поради факта, че са пропуснали момента да потърсят подходящо лечение. Хидроксихлорохин, ивермектин, бромхексин, както и други лекарства, имаха на своите кратки периоди на (все още) незаслужена слава. Нито едно от тях досега не е показало значителни клинични ползи. Приложението им при пациенти с COVID-19 не бива да се окуражава, поне докато добре организирани и проведени големи проучвания не докажат категорично, че употребата им намалява нивата на хоспитализация и смъртност. Засега проучванията не показват такива резултати.

3.2.1. Интерферони

Интерфероните са сигнализационни белтъци, които се произвеждат от имунната система на заразения организъм-гостоприемник и пречат, т.е. интерферират (откъдето е и името им) на репликацията на вируса в клетката. Интерфероните бяха много използвани в близкото минало в терапията на вирусен хепатит, но тъй като рискът от нежелани ефекти беше висок, индикациите им бяха силно ограничени. Понастоящем интерферони се използват предимно при лечението на множествена склероза и различни видове тумори. Използваните в клиничната практика интерферони често се подлагат на ПЕГилиране с цел удължаване на времето на циркулация, за да може да се осигури време да се свържат с прицелните клетки и тъкани [89]. PegIntron (на Merck) беше търговски препарат на пегилиран интерферон алфа-2b, който се използваше в лечението на хепатит B и C до 2016 г., след което беше спрян от производство. Към настоящия момент, Pegasys (на Genentech) е единственият ПЕГилиран интерферон, одобрен за употреба от и от FDA, и EMA за лечение на хепатит В при възрастни [https://www.natap.org/2005/HBV/051605_02.htm; https://www.ema.europa.eu/en/documents/product-information/pegasys-epar-product-information_en.pdf]. PEG-интерферон алфа-2а (Roferone на Roche) е друго лекарство, което беше използвано при лечението на левкемия, злокачествен меланом, полицитемия вера, есенциална тромбоцитемия и др. и наскоро беше спряно поради тежки нежелани реакции и наличието на лекарства с по-добър профил на безопасност за тези заболявания [https://pharmac.govt.nz/medicine-funding-and-supply/medicine-notices/interferon-alfa-2a/]. Интерферон бета-1а (Rebif на Merck и Pfizer) понастоящем е одобрен за лечение на пациенти с множествена склероза с чести пристъпи [https://www.pfizer.com/news/press-release/press-release-detail/emd_serono_and_pfizer_announce_fda_approval_of_rebif_rebidose_interferon_beta_1a#:~:text=announced%20today%20that%20the%20U.S.,of%20multiple%20sclerosis%20(MS).].

Свързването на ПЕГ не е единственият нанотехнологичен подход, използван спрямо интерфероните. Златни наночастици бяха изследвани като потенциален вехикулум на интерферон алфа за лечение на инфекции с HCV [36]. Наноформулация с удължено освобождаване на интерферон бета-1а, основана на полимерни наночастици от кополимер на млечната и гликоловата киселина, беше разработена и тествана in vitro през 2020 г. [24]. По отношение на COVID-19 засега проучванията показват, че приложението на интерферон алфа при пациенти намалява отделянето на вируса в околната среда и потискат възпалението, докато приложението на интерферон бета е асоциирано с по-бързо очистване на организма от вируса [46]. В едно проучване беше показано, че приложението на пегилиран интерферон алфа 2b като допълнение към стандартната терапия за COVID-19 подобрява клиничния статус на пациента и води до по-бързо очистване на организма от вируса [12]. Проучванията на групата на Sodeifian върху животински модели, обаче, показват, че приложението на интерферони в ранната фаза на COVID-19 или при леко до умеренотежко протичащо заболяване може да има положителен ефект, но приложени по време на по-късни фази или при тежко заболяване могат да доведат до сериозни нежелани ефекти за пациента [80]. Резултатите от различните проучвания по отношение на ефекта на интерфероните при пациенти с COVID-19 засега изобщо са противоречиви. Едно рандомизирано контролирано проучване за употребата на интерферон бета при пациенти с тежка форма на COVID-19 съобщава за по-ниска смъртност в групата, получаваща интерферон. Самите автори, обаче, отбелязват, че пациентите, които са получили интерферон, са получавали в същата терапевтична схема и други лекарства, включително стандартни антивирусни средства (лопинавир/ритонавир или атазанавир/ритонавир) [44]. Друго проучване съобщава, че употребата на интерферон бета при пациенти с COVID-19 не води до значителна разлика в смъртността между изследваната за ефект на лекарството група и контролната група [21]. Противоречивите резултати от използването на интерферони при COVID-19 засега възпират изследователите и клиницистите от разгръщането на обширни клинични изпитания.

3.2.2.Нуклеозидни/нуклеотидни инхибитори на обратната транскриптаза (nucleoside reverse transcriptase inhibitors, NRTI)

Нуклеозидните инхибитори на обратната транскриптаза подтискат репликацията на вирусната нуклеинова киселина, като предоставят като градивен материал за синтез нуклеозиден аналог, който при добавяне към растящата полинуклеотидна верига би прекратил удължаването на веригата. Инхибиторите на обратната транскриптаза са подробно изследвани лекарства, тъй като са едни от основните лекарства за лечение на HIV-свързани състояния. Понастоящем, протоколите за антиретровирусна терапия (antiretroviral therapy (ART), доскоро наричана високо активна антиретровирусна терапия (highly active antiretroviral therapy, HAART)) предлагат анти-HIV терапията от първа линия да се състои от комбинация от няколко лекарства: два (или повече) NRTI, един представител на групата на ненуклеозидните инхибитори на обратната транскриптаза (NNRTI) и един протеазен или интегразен инхибитор. В зависимост от характеристиките на пациента към тази комбинация може да се добави и инхибитор на навлизането на вируса в клетката, но те не са подходящи за всеки пациент, повечето са доста скъпи, могат да имат сериозни неблагоприятни ефекти и често се налага да се прилагат повече от един път на ден, понякога парентерално. Това намалява обхвата на действие на тези лекарства и повишава риска пациентите да не вземат всичките предписани им лекарства.

Най-често използваните в момента лекарства от групата на NRTI са ламивудин, ставудин, зидовудин, емрицитабин, залцитабин, тенофовир, както и други.

NRTI (както и, впрочем, NNRTI) са много ефикасни лекарства. Разбира се, те имат и своите недостатъци – кратък полуживот, ефект на първо преминаване при орално приложение (бързо инактивиране на активната съставка при преминаването й през черния дроб), което води до ниска бионаличност; както и вариации в серумните нива, дължащи се на генетично обусловените индивидуални вариации на активността на CYP системата при различните хора. Поради тези причини, до настоящия момент за подобряване на доставката и стабилността на нуклеозидните аналози са изпитани много и различни технологии. Нанотехнологиите осигуряват набор от вехикулуми за ефикасно и насочено доставяне на лекарства за лечение на HIV инфекция – липозоми, дендримери, мицели, твърди липидни наночастици, наносуспензии и полимерни наночастици [73, 29].

Данните за използването на нанотехнологии за подобряване на доставката на антивирусни средства срещу COVID-19 в организма все още са оскъдни, но тази област се развива бързо. Повечето антивирусни лекарства, използвани при COVID-19 в момента, са от групата на NRTI. Такива са: фавипиравир (гуанозинов аналог); молнупиравир (аналог на пиримидиновите рибонуклеозиди) и ремдесивир (аденозинов аналог). По-голямата част от лекарствата от групата на NRTI са одобрени за пациенти с лека до умерена форма на COVID-19, при които има висок риск от усложнения. Поради тове тяхното приложение трябва да започне рано в хода на заболяването, преди развитието на усложненията. Само ремдесивирът беше одобрен за лечение на хоспитализирани пациенти с тежко заболяване и дихателна недостатъчност [https://www.covid19treatmentguidelines.nih.gov/management/clinical-management/hospitalized-adults–therapeutic-management/], въпреки че по-късно беше одобрен за използване и при селектирани групи амбулаторни пациенти [https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-takes-actions-expand-use-treatment-outpatients-mild-moderate-covid-19]. В едно проучване от 2020 г. беше показано, че HIV-позитивните пациенти, получаващи комбинацията тенофовир/емрицитабин, имат по-нисък риск да развият COVID-19 след заразяване със SARS-CoV-2 и да бъдат хоспитализирани за това в сравнение с тези, които получават други терапии [5]. Към настоящия момент, се провеждат изпитания на наноформулации, които доставят ремдесивир и други антиретровирусни лекарства директно до белодробния епител. Такива са: натоварени с ремдесивир полимерни нановезикули, наноемулсии на фавипиравир, заредени с фавипиравир твърди липидни частици, и други. Засега изпитанията се провеждат in vitro [68, 92, 87], а проучванията in vivo в областта тепърва предстоят.

3.2.3. Ненуклеозидни инхибитори на обратната транскриптаза (NNRTI)

Ненуклеозидните инхибитори на обратната транскриптаза се използват главно в терапията на HIV-свързани състояния. Те инхибират директно обратната транскриптаза на HIV-1 чрез свързване по обратим и неконкурентен начин с ензима. Понастоящем най-използваните NNRTI са невирапин (Viramune на Boehringer Ingelheim), делавирдин (Rescriptor на ViiV Healthcare) и ефавиренц (генеричен на Mylan и Sustiva на Bristol Myers Squibb). Проблемите с бионаличността са подобни на тези при NRTI. В опит да се подобри бионаличността и да се осигури контролирано освобождаване на лекарството, Manyarara et al. през 2018 разработиха наноемулсия на невирапин за приложение в педиатрията. Впоследствие беше разработена и самоемулсифицираща се система, натоварена с невирапин с цел повишаване на бионаличността на лекарството [60]. От проведените до момента изследвания чрез моделиране и in vitro, NNRTI засега не показват клинична ефикасност срещу SARS-CoV-2 [15, 25].

3.2.4. Инхибитори на навлизането на вируса в клетката

Инхибиторите на навлизане предотвратяват навлизането на вируса в клетката, като намаляват пропускливостта на обичайното входно място на вируса, напр. предпочитаният от него за свързване и проникване повърхностен рецептор. Инхибиторите на навлизането в клетката като маравирок (Celzentry на GlaxoSmithKline), енфивуртид (Fuzeon на Genentech), булевиртид (Hepcludex на Gilead Sciences) и др. се използват при лечението на инфекции с HIV и хепатит D. През 2015 г. наночастици от железен оксид, покрити с амфифилен полимер бяха използвани за доставяне на енфивуртид до „вирусни убежища“ при миши модели на HIV [23]. През 2020 г. полимерно-липидни хибридни наночастици, натоварени с комбинация от енфивуртид и ненуклеозиден инхибитор на обратната транскриптаза (ефавиренц) бяха използвани за доставяне на лекарствата до Т-клетки и макрофаги, изолирани във вирусни убежища. Експериментите по отношение на насочена доставка на лекарства от този клас при COVID-19 предстоят.

3.2.5. Протеазни инхибитори

Протеазните инхибитори подтискат активността на протеазата, която хидролизира вирусния полипротеин, за да се образуват отделните вирусни белтъци. Протеазните инхибитори, подобно на описаните по-горе нуклеозидни аналози, са много добре проучени поради честата им употреба в лечението на HIV. Също както нуклеозидните аналози, протеазните инхибитори, приети през устата, са обект на метаболизъм при първо преминаване и са субстрати на CYP. Това води до значителна вариация на нивата на едно и също лекарство, приемано в една и съща доза при различните индивиди. Това се преодолява отчасти чрез съвместното им прилагане с лекарства, които инхибират активността на CYP3A и по този начин водят до повишаване на серумното ниво на протеазните инхибитори. Такива лекарства са, например, ритонавир и кобицистат. Разработени са нанотехнологични подходи с цел подобряване на бионаличността на най-често използаните протеазни инхибитори. Такива са, например, твърди липидни наночастици и наночастици на полимерна основа, натоварени с лопинавир, наноемулсии и наносуспензии на атаназавир, липидни наночастици, натоварени с дарунавир, полимерни наночастици, натоварени с нелфинавир, и други [55, 66, 88, 28, 79, 7, 18]. Установено е, че бионаличността на саквинавир във вирусни убежища се повишава значително чрез използване на квантови точки [42].

Протеазните инхибитори са един от заменимите компоненти на антиретровирусната терапия за HIV, тъй като към задължителните в протокола ART инхибитори на обратната транскриптаза може да се добави или протеазен, или интегразен инхибитор, в зависимост от особеностите на пациента и опита на лекаря. При COVID-19, обаче, протеазните инхибитори имат потенциал (поне засега) да се окажат специфично и незаменимо лекарство. През 2020 г. групата на Beck използва математически модел за предсказване на взаимодействие между лекарството и прицелните молекули, за да оцени потенциалната активност при COVID-19 на група лекарства от различни класове, които рутинно се използват за лечение на HIV и други инфекции с РНК вируси – ремдесивир, ефавиренц, ритонавир и долутегравир [10] ]. Резултатите им показаха, че атазанавирът има много висок афинитет към вирусната протеаза на SARS-CoV-2. Това потенциално действие на атаназавир се изследва в момента с цел клинични приложения при пациенти с COVID-19. Paxlovid на Merck е ново лекарство за перорално приложение при пациенти с COVID-19 и риск от тежки усложнения, което съдържа като активна съставка протеазен инхибитор. То беше одобрено за употреба през декември 2020 г. Съдържа протеазния инхибитор нирматрелвир и споменатия по-горе ритонавир като инхибитор на CYP3A [59]. След като бъдат събрани достатъчно данни за ефикасността на пероралния препарат, вероятно ще бъдат разработени и наноформулации на същото лекарство.

3.2.6. Интегразни инхибитори

Интегразните инхибитори подтискат инсертирането на ДНК копие на РНК на вируса в генома на клетката гостоприемник. Интегразните инхибитори, напр. долутегравир (Tivicay на ViiV Healthcare), елвитегравир (част от фиксираната комбинация Stribild на Gilead Sciences) или ралтегравир (Isentress на Merck) са ключови компоненти в ART за HIV инфекции. Както повечето антиретровирусни лекарства, и интегразните инхибитори имат като недостатък слаба водоразтворимост и ниска бионаличност. Разработват се различни наноформулации на интегразни инхибитори с цел да се увеличи тяхната разтворимост и за контрол на доставката до таргетните клетки и тъкани. Още през 2006 г. беше постигнато значимо удължаване на времето на полуживот на долутегравир чрез миристоилиране и беше пусната на пазара форма с удължено действие [90]. През 2015 г. въз основа на наблюдението, че златните наночастици лесно се интернализират от лимфоцити и макрофаги беше разработен конюгат на ралтегравир със златни наночастици, който може да инхибира репликацията на HIV в периферните мононуклеарни клетки [26]. През 2020 г. беше установено, че долутегравирът има значим ефект за подтискане на активността на вирусната протеаза на SARS-CoV-2 [10]. Проучванията в областта продължават.

4. Изкуствени вирусоподобни частици, използвани за доставка на лекарства

Вирусоподобните частици (virus-like particles, VLP) са самосглобяващи се частици, които се образуват при смесване на вирусни протеини от капсида или вирусната обвивка с различни естествени белтъци като феритин или бактериалния белтък енкапсулин. От тази смес спонтанно се сглобяват структури, съдържащи както вирусните, така и невирус белтъци. Белтъците обикновено се произвеждат в хетероложни системи. Белтъците в състава на вирусоподобните частици могат да бъдат модифицирани или конюгирани с пептиди, токсини, химиотерапевтици, малки интерфериращи РНК, квантови точки и т.н., за да се постигне насочване към специфично прицелно място и/или да се контролира по време освобождаването на активната съставка.

VLP имат потенциал да се използват в широк спектър от приложения, включително разработване на лекарства, имунотерапии, ваксини, генни терапии, в образната диагностика, и др. Вирозомите са VLP, които имат допълнителен фосфолипиден двоен слой, който включва и гликопротеините на вирусната обвивка (напр. хемаглутинин). Схематично това е представено на фиг. 5.

Естествените вирусни частици имат свойството под действието на фактори от околната среда (промени в рН или в температурата на средата и пр.) да се саморазглобяват с освобождаване на вирусния геном или да отделят от обвивката си субединици от капсида или части от липидната обвивка, в които не присъства вирусна нуклеинова киселина. В разглобено състояние вирусните частици могат да се самосглобят отново във вирусоподобни частици при специфични условия [58]. Вирусоподобните частици наподобяват по своята морфология естествените вирусни частици и проявяват същия тропизъм към прицелните клетки, но не включват нуклеиновата киселина на вируса. На практика те са еквиваленти на вируси, но без геном. Когато бъдат натоварени с някакво активно вещество (лекарства, антитела, флуоресцентни багрила, контрастни вещества и пр.), то може да бъде доставено до специфични целеви клетки, използвайки взаимодействията вирус-клетка, характерни за естествения вирус. Свайствата на VLP се изучават активно и се използват за разработване на нови биоматериали с каталитична активност, биомиметични молекули или агенти за целите на образната диагностика със селективна насоченост [14, 58].

Фиг. 5. Схематично представяне на вирусоподобна частица (без фосфолипидната обвивка).

VLP се използват за проектиране на ваксини срещу човешки заболявания сравнително отскоро – по-точно от 2017 г., когато групата на Kanekiyo създаде фузионен белтък хемаглутинин-феритин, способен на спонтанно самосглобяване с образуване на наночастици, експониращи хемаглутининови тримери на повърхността си. На подобен принцип по-късно, през 2020 г. беше разработена ваксина срещу човешкия респираторно-синцитиален вирус (RSV), при която върху вирусоподобни частици е представен F-антигенът на RSV [30]. Тази ваксина (на компанията Novavax, която разработи и наскоро пусна на пазара ваксината Nuvaxovid срещу инфекция със SARS-CoV-2) все още е в период на клинични изпитания.

Вирусоподобните частици имат голям потенциал за подобряване на безопасността и ефективността на лекарствата. Използването на VLP засега се оказва с профил на безопасност, подобен на другите методологии, базирани на използване на вирусни компоненти, и по-добър от този на вирусните вектори. Един сериозен недостатък на VLP е тяхната висока потенциална имуногенност поради съдържанието на вирусни белтъци в тях. Все още не е напълно изяснено магнитудът на този проблем, тъй като вирусните белтъци се произвеждат в хетероложни системи (обикновено – бактериални) и съответно тяхната експресия не включва пост-транслационна обработка (напр. гликозилиране, което е един от основните източници на имуногенни епитопи) [3,58]. Тази особеност реално може да намали риска от имунен отговор от страна на гостоприемника, но са необходими много допълнителни изследвания в тази връзка, за да се оцени надеждно профилът на безопасност на вирусоподобните частици.

Счита се, че лекарства, които имат висока токсичност (каквито са, например, цитостатиците), биха могли сравнително безопасно и ефикасно да бъдат доставени до таргетните клетки с помощта на VLP. Ashley et al. още през 2011 г. използваха VLP за доставяне на доксорубицин до клетки на човешкия хепатоцелуларен карцином (Hep3B), за които се знае, че използват т.нар. Pgр-помпен механизъм за изхвърляне на химиотерапевтици [6]. Резултатите засега показват, че използването на вирусоподобни частици, натоварени с доксорубицин, цисплатина и 5-флуороурацил може да доведе до подтискане на деленето на раковите клетки при значително по-ниски серумни нива на химиотерапевтика, и, съответно, при много по-слабо изразени нежелани ефекти за пациента.

Въвеждането на допълнителни модификации (функционализация, наричана понякога в специализираната литература и „декорация“) на белтъците в състава на VLP повишава техния афинитет към прицелните клетки и подобрява освобождаването на лекарството. През 2007 г. беше съобщено за „декориране“ на VLP с биотин, осигуряващо насочване към прицелните места чрез взаимодействие авидин-биотин [67].

През 2020 г. бяха проведени изпитания в миши модели на три кандидат-ваксини срещу SARS-CoV-2, базирани на VLP. Те съдържаха иРНК на шиповия, мембранния и капсидния белтък на вируса. Най-общо казано, принципът на създаването и действието на тези VLP e следният: експресираните белтъци се опаковат в липидни наночастици и се трансфектират в култивирани клетки, след което VLP се отделят от клетките в културалната среда. Началните резултати бяха обнадеждаващи, въпреки че автори докладваха, че нивата на антителата при ваксинираните мишки бележат бърз спад скоро след ваксинацията [41]. През 2022 г. Yilmaz et al. докладва първите резултати от предклинично изпитание на базирана на VLP ваксина срещу SARS-CoV-2, предходно изпитана в култивирани клетки и върху животински модели. Тези VLP експресират всичките 4 структурни белтъка на SARS-CoV-2. Засега резултатите показват, че ваксината предизвиква мощен Т-клетъчен отговор и значително намалява вирусния товар при ваксинираните животни [96].

Covifenz (на Medicago и GSK) е ваксина, базирана на VLP. Нейните изпитания от фаза III приключиха в началото на февруари 2022 г. Според производителите, Covifenz вече е одобрен за употреба в Канада от местната регулаторна агенция Health Canada [Medicago’s Canada-made COVID-19 vaccine approved by Health Canada | Globalnews.ca].

Към м. февруари 2022 г. все още нямаше одобрени от FDA и EMA лекарствени форми на основата на вирусоподобни частици за лечение на COVID-19. Необходими са допълнителни, по-обширни изследвания за евентуалните приложения на VLP при лечението на инфекции със SARS-CoV-2, преди да бъдат одобрени продукти на тази основа.

---

Тест LO 4.2

---

Литература

1. Ahn D., Lee W., Choi J.K., Kim S.J., Plant E.P., Almazán F., Taylor D.R., et al. (2011).  Interference of ribosomal frameshifting by antisense peptide nucleic acids suppresses SARS coronavirus replication. Antiviral Res, 91(1), 1-10.
2. Al-Bari M. (2015). Chloroquine analogues in drug discovery: new directions of uses, mechanisms of actions and toxic manifestations from malaria to multifarious diseases. J Antimicrob Chemother, 70, 1608–1621.
3. Aljabali A., Hassan S., Pabari R., Shahcheraghi S., Mishra V., Charbe N., Chellappan D., et al. (2021). The viral capsid as novel nanomaterials for drug delivery. Future Sci OA, 7(9), FSO744.
4. Ambike S., Cheng C., Feuerherd M., Velkov S., Baldassi D., Afridi S.Q., Porras-Gonzalez D., et al., (2022). Targeting genomic SARS-CoV-2 RNA with siRNAs allows efficient inhibition of viral replication and spread. Nucleic Acids Res, 50(1), 333-349.
5. Del Amo J., Polo R., Moreno S., Díaz A., Martínez E., Arribas J., Jarrín I., et al., and The Spanish HIV/COVID-19 Collaboration. (2020). Incidence and Severity of COVID-19 in HIV-Positive Persons Receiving Antiretroviral Therapy: A Cohort Study Ann Intern Med, 173(7), 536-541.
6. Ashley C., Carnes E., Phillips G., Durfee P., Buley M., Lino C., Padilla D., et al. (2011). Cell-specific delivery of diverse cargos by bacteriophage MS2 virus-like particles. ACS Nano, 5(7), 5729-45.
7. Augustine R., Ashkenazi D.L., Arzi R.S., Zlobin V., Shofti R. and Sosnik A. (2018). Nanoparticle-in-microparticle oral drug delivery system of a clinically relevant darunavir/ritonavir antiretroviral combination. Acta Biomater, 74, 344-359.
8. Auría-Soro C., Nesma T., Juanes-Velasco P., Landeira-Viñuela A., Fidalgo-Gomez H., Acebes-Fernandez V., Gongora R., et al. (2019). Interactions of Nanoparticles and Biosystems: Microenvironment of Nanoparticles and Biomolecules in Nanomedicine.Nanomaterials (Basel), 9(10), 1365.
9. Balwani M., Sardh E., Ventura P., Peiró P., Rees D., Stölzel U., Bissell D., et al., and ENVISION Investigators. (2020). Phase 3 Trial of RNAi Therapeutic Givosiran for Acute Intermittent Porphyria. Clinical Trial N Engl J Med, 382(24):2289-2301.
10. Beck B., Shin B., Choi Y., Park S. and Kang K. (2020). Predicting commercially available antiviral drugs that may act on the novel coronavirus (SARS-CoV-2) through a drug-target interaction deep learning mode. Comput Struct Biotechnol J, 18, 784-790.
11. Bigini P., Gobbi M., Bonati M., Clavenna A., Zucchetti M., Garattini S. and Pasut G. (2021). The role and impact of polyethylene glycol on anaphylactic reactions to COVID-19 nano-vaccines. Nature Nanotechnol, 16, 1169-1171.
12. Bhushan B., Wanve S., Koradia P., Bhomia V., Soni P., Chakraborty S., Khobragade A., et al., and Study Investigators Group. (2021). Efficacy and safety of pegylated interferon-α2b in moderate COVID-19: a phase 3, randomized, comparator-controlled, open-label study. Clinical Trial Int J Infect Dis, 111, 281-287.
13. Chakarov S., Petkova R., Russev G. (2008). Rapid and efficient method for production of T4 endonuclease V by heterologous expression in E. coli. Biotechnol Biotechnol Equip, 22(4), 1011-1012.
14. Chakravarty M. and Vora A. (2021). Nanotechnology-based antiviral therapeutics. Drug Deliv Transl Res, 11(3), 748-787.
15. Chang Y., Tung Y., Lee K., Chen T., Hsiao Y., Chang H., Hsieh T., et al. (2020). Potential Therapeutic Agents for COVID-19 Based on the Analysis of Protease and RNA Polymerase Docking. Preprint. February 2020, DOI:10.20944/preprints202002.0242.v1.
16. Cho S., Woo H., Kim K., Oh J. and Jeong Y. (2011). Novel system for detecting SARS coronavirus nucleocapsid protein using an ssDNA aptamer. J Biosci Bioeng, 112(6), 535-40.
17. Davoudi-Monfared E., Rahmani H., Khalili H., Hajiabdolbaghi M., Salehi M., Abbasian L., Kazemzadeh H. and Yekaninejad M. (2020). A Randomized Clinical Trial of the Efficacy and Safety of Interferon β-1a in Treatment of Severe COVID-19. Antimicrob Agents Chemother, 64(9), e01061-20.
18. Desai J. and Thakkar H. (2018). Darunavir-Loaded Lipid Nanoparticles for Targeting to HIV Reservoirs. AAPS PharmSciTech, 19(2), 648–660.
19. Ditzler M., Bose D., Shkriabai N., Marchand B., Sarafianos S., Kvaratskhelia M., Burke D. (2011). Broad-spectrum aptamer inhibitors of HIV reverse transcriptase closely mimic natural substrates. Nucleic Acids Res, 39(18), 8237-8247.
20. Duncan R., Vicent M., Greco F. and Nicholson R. (2005). Polymer–drug conjugates: towards a novel approach for the treatment of endrocine-related cancer. Endocr Relat Cancer, 12(Suppl. 1), S189–S199.
21. Estébanez M., Ramírez-Olivencia G., Mata T., Martí D., Gutierrez C., de Dios B., Herrero M., et al., and COVID 19 Central Defense Hospital “Gomez Ulla” Team. (2020). Clinical evaluation of IFN beta1b in COVID-19 pneumonia: a retrospective study. Preprint from medRxiv, 19 May 2020, DOI: 10.1101/2020.05.15.20084293.
22. Ferreira D., Barbosa J., Sousa D.A., Silva C., Melo L.D.R., Avci-Adali M., Wendel H.P., et al. (2021). Selection of aptamers against triple negative breast cancer cells using high throughput sequencing. Sci Rep, 11(1), 8614.
23. Fiandra L., Colombo M., Mazzucchelli S., Truffi M., Santini B., Allevi R., Nebuloni M., et al. (2015). Nanoformulation of antiretroviral drugs enhances their penetration across the blood brain barrier in mice. Nanomedicine, 11(6), 1387-1397.
24. Fodor-Kardos A., Kiss A., Monostory K. and Feczkó T. (2020). Sustained in vitro interferon-beta release and in vivo toxicity of PLGA and PEG-PLGA nanoparticles. RSC Adv, 10, 15893.
25. Frediansyah A., Tiwari R., Khan S., Dhama K. and Harapan H. (2021). Antivirals for COVID-19: A critical review. Clin Epidemiol Glob Health, 9, 90-98.
26. Garrido C., Simpson C., Dahl N., Bresee J., Whitehead D., Lindsey E., Harris T., et al. (2015). Gold nanoparticles to improve HIV drug delivery. Future Med Chem, 7(9): 1097–1107.
27. Giovannini G., Haick H. and Garoli D. (2021). Detecting COVID-19 from Breath: A Game Changer for a Big Challenge. ACS Sens, 6(4), 1408–1417.
28. Ghosh A., Osswald H., Prato G. (2016). Recent Progress in the Development of HIV-1 Protease Inhibitors for the Treatment of HIV/AIDS. J Med Chem, 59(11), 5172–5208.
29. Gong Y., Chowdhury P., Nagesh P., Cory T., Dezfuli C., Kodidela S., Singh A., et al. (2019). Nanotechnology approaches for the delivery of cytochrome P450 substrates in HIV treatment. Expert Opin Drug Deliv, 16(8), 869–882.
30. Ha B., Yang J., Chen X., Jadhao S., Wright E. and Anderson L. (2020). Two RSV Platforms for G, F, or G+F Proteins VLPs. Viruses, 12(9), 906.
31. Huang L., Luo Y., Sun X., Ju H., Tian J. and Yu B.Y. (2017). An artemisinin-mediated ROS evolving and dual protease light-up nanocapsule for real-time imaging of lysosomal tumor cell death. Biosens Bioelectron, 92, 724-732.
32. Hung I., Lung K., Tso E., Liu R., Chung T., Chu M., Ng Y., et al. (2020). Triple combination of interferon beta-1b, lopinavir-ritonavir, and ribavirin in the treatment of patients admitted to hospital with COVID-19: an open-label, randomised, phase 2 trial. Lancet, 395(10238), 1695-1704.
33. Idris A., Davis A., Supramaniam A., Acharya D., Kelly G., Tayyar Y., West N., et al. (2021). A SARS-CoV-2 targeted siRNA-nanoparticle therapy for COVID-19. Mol Ther, 29(7), 2219-2226.
34. Kinghorn A., Dirkzwager R., Liang S., Cheung Y., Fraser L., Shiu S., Tang M., Tanner J. (2016). Aptamer Affinity Maturation by Resampling and Microarray Selection. Anal Chem., 88(14), 6981-5.
35. Kumar A., Mancy S., Manjunath K., Kulkarni S. and Jagadeesh R. (2019). Formulation and Evaluation of Fluvoxamine Maleate Loaded Lipid Nanoparticle. Int J Pharm Sci Nanotechnol, 12(4), 4593-4600.
36. Lee M., Yang J., Jung H., Beack S., Choi J., Hur W., Koo H. et al. (2012).  Hyaluronic Acid–Gold Nanoparticle/Interferon α Complex for Targeted Treatment of Hepatitis C Virus Infection. ACS Nano, 6(11), 9522–9531.
37. Li H., Tatematsu K., Somiya M., Iijima M. and Kuroda S. (2018). Development of a macrophage-targeting and phagocytosis-inducing bio-nanocapsule-based nanocarrier for drug delivery. Acta Biomater, 73, 412-423.
38. Li W., Wu J., Zhan P., Chang Y., Pannecouque C., De Clercq E. and Liu X. (2012). Synthesis, drug release and anti-HIV activity of a series of PEGylated zidovudine conjugates. Int J Biol Macromol, 50(4), 974-980.
39. Lim S., Hor C., Tay K., Mat Jelani A., Tan W., Ker H., Chow T., et al., and I-TECH Study Group. (2022). Efficacy of Ivermectin Treatment on Disease Progression Among Adults With Mild to Moderate COVID-19 and Comorbidities: The I-TECH Randomized Clinical Trial. JAMA Intern Med, 2022 Feb 18. doi: 10.1001/jamainternmed.2022.0189. (online ahead of print).
40. Liu S., Wang Z., Xie H., Liu A., Lamb D. and Pang D. (2020). Single-Virus Tracking, From Imaging Methodologies to Virological Applications. Chem Rev, 120, 1936-1979.
41. Lu J., Lu G., Tan S., Xia J., Xiong H., Yu X., Qi Q., et al. (2020). A COVID-19 mRNA vaccine encoding SARS-CoV-2 virus-like particles induces a strong antiviral-like immune response in mice. Cell Res, 30(10), 936-939.
42. Mahajan S., Roy I., Xu G., Yong K.T., Ding H., Aalinkeel R., Reynolds J., et al. (2010). Enhancing the delivery of anti retroviral drug Saquinavir across the blood brain barrier using nanoparticles. Curr HIV Res, 8, 396–404.
43. Kawata Mahlknecht G., Sela M. and Yarden Y. (2015). Aptamer Targeting the ERBB2 Receptor Tyrosine Kinase for Applications in Tumor Therapy. Methods Mol Biol, 1317, 3-15.
44. Malhani A., Enani M., Saheb Sharif-Askari F., Alghareeb M., Bin-Brikan R., AlShahrani S., Halwani R., et al. (2021). Combination of (interferon beta-1b, lopinavir/ritonavir and ribavirin) versus favipiravir in hospitalized patients with non-critical COVID-19: A cohort study. PLoS One, 16(6), e0252984.
45. Mann A., Somasunderam A., Nieves-Alicea R., Li X., Hu A., Sood A., Ferrari M., et al. (2010). Identification of thioaptamer ligand against E-selectin: Potential application for inflamed vasculature targeting. PLoS ONE, 5, e13050.
46. Mary A., Hénaut L., Macq P.Y., Badoux L., Cappe A., Porée T., Eckes M., et al. (2020). Rationale for COVID-19 Treatment by Nebulized Interferon-β-1b–Literature Review and Personal Preliminary Experience. Front Pharmacol, 11, 592543.
47. Medeiros I., Khayat A., Stransky B., Santos S., Assumpção P. and de Souza J. (2021). A small interfering RNA (siRNA) database for SARS-CoV-2. Nature Sci Rep, 11, 8849.
48. Mikhaylov E., Lyubimtseva T., Vakhrushev A., Stepanov D., Lebedev D., Vasilieva E., Konradi A., et al. (2022). Bromhexine Hydrochloride Prophylaxis of COVID-19 for Medical Personnel: A Randomized Open-Label Study. Interdiscip Perspect Infect Dis, 2022, 4693121.
49. Mishra S., Malhotra P., Gupta A.K., Singh P.K., Mishra A.K., Javed S. and Kumar R. (2014). Novel method for screening of radioprotective agents providing protection to DNA ligase against gamma radiation induced damage. Int J Radiat Biol, 90(2), 187-192.
50. Mohammed S. and Shaaban E. (2019). Efficacious nanomedicine track toward combating COVID-19. Randomized Controlled Trial. N Engl J Med, 381(24), 2293-2303.
51. Moitra P., Alafeef M., Dighe K., Frieman M. and Pan D. (2020). Selective Naked-Eye Detection of SARS-CoV-2 Mediated by N Gene Targeted Antisense Oligonucleotide Capped Plasmonic Nanoparticles. ACS Nano, 14, 7617-7627.
52. Monk P., Marsden R., Tear V., Brookes J., Batten T., Mankowski M., Gabbay F., et al., and Inhaled Interferon Beta COVID-19 Study Group. (2021). Collaborators, Safety and efficacy of inhaled nebulised interferon beta-1a (SNG001) for treatment of SARS-CoV-2 infection: a randomised, double-blind, placebo-controlled phase 2 trial. Clinical Trial Lancet Respir Med, 9(2), 196-206.
53. Musafia B., Oren-Banaroya R. and Noiman S. (2014). Designing anti-influenza aptamers: novel quantitative structure activity relationship approach gives insights into aptamer-virus interaction. PLoS One, 9(5), e97696.
54. Nasserie T., Hittle M. and Goodman S. (2021). Assessment of the Frequency and Variety of Persistent Symptoms Among Patients With COVID-19: A Systematic Review. JAMA Network Open, 4 (5), e2111417.
55. Negi J., Chattopadhyay P., Sharma A.K., and Ram V. (2013). Development of solid lipid nanoparticles (SLNs) of lopinavir using hot self nano-emulsification (SNE) technique. Eur J Pharm Sci, 48(1–2), 231-239.
56. Neuman B., Stein D., Kroeker A., Bestwick R., Iversen P., Moulton H., and Buchmeier M. (2006). Inhibition and Escape of SARS-CoV Treated with Antisense Morpholino Oligomers. In: The Nidoviruses, 581, 567–571.
57. Nimjee S., Povsic T., Sullenger B. and Becker R. (2016). Translation and Clinical Development of Antithrombotic Aptamers. Nucleic Acid Ther, 26(3), 147-155.
58. Nooraei S., Bahrulolum H., Hoseini Z., Katalani C., Hajizade A., Easton A. and Ahmadian G. (2021). Virus-like particles: preparation, immunogenicity and their roles as nanovaccines and drug nanocarriers. J Nanobiotechno, 19, 59.
59. Owen D., Allerton C., Anderson A., Aschenbrenner L., Avery M., Berritt S., Boras B., et al. (2021). An oral SARS-CoV-2 M(pro) inhibitor clinical candidate for the treatment of COVID-19. Science 374(6575), 1586-1593.
60. Panner Selvam R. and Kulkarni P. (2014). Design and Evaluation of Self Nanoemulsifying Systems for Poorly Water Soluble HIV Drug. J PharmaSciTech, 4(1).
61. Puri A., Loomis K., Smith B., Lee J-H., Yavlovich A., Heldman E. and Blumenthal R. (2009). Lipid-based nanoparticles as pharmaceutical drug carriers: from concepts to clinic. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 26, 523–580.
62. Rabowsky J., Dukes A., Lee D. and Leong K. (1996). The use of bioerodible polymers and daunorubicin in glaucoma filtration surgery. Clin Trial Ophthalmol, 103(5), 800-807.
63. Samson R., Navale G. and Dharne M.  (2020). Biosensors: frontiers in rapid detection of COVID-19. J Biotech, 10(9), 385.
64. Rahmani H., Davoudi-Monfared E., Nourian A., Khalili H., Hajizadeh N., Jalalabadi N., Fazeli M., et al (2020). Interferon beta-1b in treatment of severe COVID-19: A randomized clinical trial. Int Immunopharmacol, 88, 106903.
65. Rasmi Y., Saloua K., Nemati M., and Choi J. (2021). Recent Progress in Nanotechnology for COVID-19 Prevention, Diagnostics and Treatment.  Review Nanomaterials (Basel), 11(7), 1788.
66. Ravi P., Vats R., Dalal V., Nitin Gadekar N. (2015). Design, optimization and evaluation of poly-ɛ-caprolactone (PCL) based polymeric nanoparticles for oral delivery of lopinavir. Drug Dev Ind Pharm,41(1), 131–140.
67. Reches M. and Gazit E. (2007). Biological and chemical decoration of peptide nanostructures via biotin-avidin interactions.  J Nanosci Nanotechnol, 7(7), 2239-2245.
68. de M Ribeiro N. and Fonseca B. (2020). The role of pharmaceutical nanotechnology in the time of COVID-19 pandemic Review Future Microbiol, 15, 1571-1582.
69. Roberts D., Rossman J. and Jarić I. (2021). Dating first cases of COVID-19. PLOS Pathogens, June 24, 2021, https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009620.
70. Roh C. and Jo S. (2011). Quantitative and Sensitive Detection of SARS Coronavirus Nucleocapsid Protein Using Quantum Dots-Conjugated RNA Aptamer on Chip. J Chem Technol Biotechnol, 86, 1475-1479.
71. Rose K., Alves Ferreira-Bravo I., Li M., Craigie R., Ditzler M., Holliger P. and DeStefano J. (2019). Selection of 2′-Deoxy-2′-Fluoroarabino Nucleic Acid (FANA) Aptamers That Bind HIV-1 Integrase with Picomolar Affinity. ACS Chem Biol, 14(10), 2166-2175.
72. Rosenberg J., Bambury R., Van Allen E., Drabkin H., Lara P. Jr., Harzstark A., Wagle N., et al. (2014). A phase II trial of AS1411 (a novel nucleolin-targeted DNA aptamer) in metastatic renal cell carcinoma. Invest New Drugs, 32(1), 178-187.
73. Roy U., Rodríguez J., Barber P., das Neves J., Sarmento B. and Nair M. (2015). The potential of HIV-1 nanotherapeutics: from in vitro studies to clinical trials. Nanomedicine (London, England), 10(24), 3597–3609.
74. Sabourian P., Yazdani G., Ashraf S., Frounchi M., Mashayekhan S., Kiani S. and Kakkar A. (2020). Effect of Physico-Chemical Properties of Nanoparticles on Their Intracellular Uptake. Int J Mol Sci, 21(21), 8019.
75. Shan B., Broza Y.Y., Li W., Wang Y., Wu S., Liu Z., Wang J., et al. (2020). Multiplexed Nanomaterial-Based Sensor Array for Detection of COVID-19 in Exhaled Breath. ACS Nano, 14(9):12125-12132.
76. Seo G., Lee G., Kim M., Baek S., Choi M., Ku K., Lee C., et al. (2020). Rapid Detection of COVID-19 Causative Virus (SARS-CoV-2) in Human Nasopharyngeal Swab Specimens Using Field-Effect Transistor-Based Biosensor. ACS Nano, 14(4), 5135-5142.
77. Sercombe L., Veerati T., Moheimani F., Wu S.Y., Sood A.K. and Hua S. (2015). Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery. Front Pharmacol, 6, 286.
78. Shan B., Broza Y., Li W., Wang Y., Wu S., Liu Z., Wang J., et al. (2020). Multiplexed Nanomaterial-Based Sensor Array for Detection of COVID-19 in Exhaled Breath. ACS Nano, 14, 12125-12132.
79. Singh G. and Pai RS. (2016). Atazanavir-loaded Eudragit RL 100 nanoparticles to improve oral bioavailability: optimization and in vitro/in vivo appraisal. Drug delivery, 23(2), 532–539.
80. Sodeifian F., Nikfarjam M., Kian N., Mohamed K. and Rezaei N. (2022). The role of type I interferon in the treatment of COVID-19. J Med Virol, 94(1), 63-81.
81. Somvanshi S., Kharat B., Saraf S., Somwanshi S., Shejul S., and Jadhav K. (2020). Multifunctional Nano-Magnetic Particles Assisted Viral RNA-Extraction Protocol for Potential Detection of COVID-19. Mater Res Innov, 25, 169-174.
82. Sun M., Liu S., Wei X., Wan S., Huang M., Song T., Lu Y., et al. (2021). Aptamer Blocking Strategy Inhibits SARS-CoV-2 Virus Infection. Angew Chem Int Ed Engl, 60(18), 10266-10272.
83. Svenson S. and Tomalia DA. (2005). Dendrimers in biomedical applications-reflections on the field. Adv Drug Deliv Rev, 57(15), 2106-2129.
84. Tran S., DeGiovanni P-J., Piel B. and Rai P. (2017). Cancer nanomedicine: a review of recent success in drug delivery. Clin Transl Med, 6, 44.
85. Trujillo C., Nery A., Alves J., Martins A. and Ulrich H. (2007). Development of the anti-VEGF aptamer to a therapeutic agent for clinical ophthalmology. Clin Ophthalmol, 1(4), 393-402.
86. Tsogtbaatar K., Sousa D.A., Ferreira D., Tevlek A., Aydın H.M., Çelik E. and Rodrigues L. (2022). In vitro selection of DNA aptamers against human osteosarcoma. Invest New Drugs, 40(1), 172-181.
87. Tulbah A. and Lee W-H. (2021). Physicochemical Characteristics and In Vitro Toxicity/Anti-SARS-CoV-2 Activity of Favipiravir Solid Lipid Nanoparticles (SLNs). Pharmaceuticals (Basel), 14(10), 1059.
88. Venkatesh D., Baskaran M., Karri V., Mannemala S., Radhakrishna K. and Goti S. (2015). Fabrication and in vivo evaluation of Nelfinavir loaded PLGA nanoparticles for enhancing oral bioavailability and therapeutic effect. Saudi Pharm J, 23(6), 667–674.
89. Veronese F. and Mero A. (2008). The impact of PEGylation on biological therapies. BioDrugs, 22(5), 315-329.
90. Vyas T., Shah L and Amiji M. (2006). Nanoparticulate drug carriers for delivery of HIV/AIDS therapy to viral reservoir sites. Expert Opin Drug Deliv, 3(5), 613–628.
91. Wen W., Chen C., Tang J., Wang C., Zhou M., Cheng Y., Zhou X., et al. (2022). Efficacy and safety of three new oral antiviral treatment (molnupiravir, fluvoxamine and Paxlovid) for COVID-19：a meta-analysis. Ann Med, 54(1), 516-523.
92. Wu J., Wang H. and Li B. (2020). Structure-aided ACEI-capped remdesivir-loaded novel PLGA nanoparticles, toward a computational simulation design for anti-SARS-CoV-2 therapy. Phys Chem Chem Phys, 22, 28434-28439.
93. Vincent M., Bergeron E., Benjannet S., Erickson B., Rollin P., Ksiazek T., Seidah N., et al. (2005). Chloroquine is a potent inhibitor of SARS coronavirus infection and spread. Virol J, 2, 69.
94. Yang Z., Huang Y., Ganesh L., Leung K., Kong W., Schwartz O., Subbarao K., et al. (2004). pH-dependent entry of severe acute respiratory syndrome coronavirus is mediated by the spike glycoprotein and enhanced by dendritic cell transfer through DC-SIGN. J Virol, 78(11), 5642-5550.
95. Yarosh D. (2002). Enhanced DNA repair of cyclobutane pyrimidine dimers changes the biological response to UV-B radiation. Mutat Res, 509(1-2), 221-226.
96. Yilmaz I., Ipekoglu E., Bulbul A., Turay N., Yildirim M., Evcili I., Yilmaz N., et al. (2022). Development and preclinical evaluation of virus-like particle vaccine against COVID-19 infection. Allergy, 77(1), 258-270.
97. Zhao Z., Cui H., Song W., Ru X., Zhou W. and Yu X. (2020), A Simple Magnetic Nanoparticles-Based Viral RNA Extraction Method for Efficient Detection of SARS-CoV-2. bioRxiv, 2020, doi: 10.1101/2020.02.22.961268.