Nanotechnologie in Diagnoseverfahren für SARS-CoV-2

Zusammenfassung

Die Fortschritte der Nanotechnologie sind für die Diagnose von COVID-19 von erheblicher Bedeutung. Schutz und Diagnose sind unerlässlich, um die Ausbreitung von Infektionen einzudämmen. Die Nanotechnologie bietet neuartige Techniken für die schnelle Diagnose, die Erkennung von Infektionen im Frühstadium und die Identifizierung von COVID-19. Aufgrund ihrer geringeren Größe und größeren Oberfläche können Produkte der Nanotechnologie die Krankheit mit hoher Präzision erkennen. Da die Symptome von COVID-19 denen anderer Atemwegserkrankungen sehr ähnlich sind, ist es unerlässlich, über präzise, sensitive und schnelle Diagnoseinstrumente zu verfügen, um die Infektion frühzeitig zu erkennen.

Schlüsselwörte/Phrasen: Nanotechnologie, COVID-19, Diagnose

1. Einführung

Die durch das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) verursachte Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) ist ein globales Gesundheitsproblem, das die WHO als Pandemie ausgerufen hat. COVID-19 hat zu einem weltweiten Lockdown geführt und die Weltwirtschaft gefährdet. SARS-CoV-2 hat sich weltweit schnell verbreitet und eine globale Pandemie in Überzahl erzeugt. Dieses Virus kann über Tröpfchen und engen Kontakt von Mensch zu Mensch übertragen werden, und Menschen jeden Alters sind diesem Virus ausgesetzt. Der Ausbruch von COVID-19 übte internationalen Druck auf moderne Gesellschaften aus, insbesondere auf die mit der Gesundheitsversorgung verbundene Infrastruktur. Daher sind diagnostische Tests speziell für diese Krankheit dringend erforderlich, um positive Fälle sicherzustellen, Patienten zu untersuchen und eine Virusüberwachung durchzuführen. Die Diagnose kann eine einflussreiche Rolle bei der Prävention von COVID-19 spielen, indem sie eine schnelle Durchführung von Managementmaßnahmen ermöglicht, die die Ausbreitung durch das Erkennen und Isolieren von Fällen und durch Kontaktverfolgung begrenzen. Folglich steht die Welt vor einer neuen Herausforderung: ultraschnelle, ultraempfindliche Geräte und Analysewerkzeuge im Nanomaßstab oder Sensorsysteme (z. B. Nanobiosensoren) zu entwickeln, die beim Nachweis des 2019 neuartigen Coronavirus (COVID-19) oder schweres akutes respiratorisches Syndrom (SARS) aufgetaucht waren.[3, 10, 17].

Mit den Fortschritten in der Nanotechnologie können ihre außergewöhnlichen Eigenschaften, einschließlich ihrer Fähigkeit zur Signalverstärkung, für die Entwicklung von Nanobiosensoren und Nanobildgebungsverfahren eingesetzt werden, die zusammen mit anderen diagnostischen Werkzeugen für die Erkennung im Frühstadium verwendet werden können. Die Nanotechnologie wird gründlich auf ihre Aussichten für die Entwicklung von Krebs, Diagnosetechniken, Therapeutika, Impfstoffen und Strategien zur Entlastung des Gesundheitswesens untersucht [10].

2. Aktuelle Labormethoden zur Diagnose von SARS-CoV-2

Die Diagnose von COVID-19 beruht auf der Analyse der Reaktion des Patienten aufgrund der Krankheit oder der Untersuchung von Virusinhalten, z. B. RNA oder deren Protein. Die Temperatur des Patienten (erhöhte Temperatur), Erschöpfungsgefühl und Atembeschwerden deuten auf eine Infektion hin. Dennoch sind diese Symptome unspezifisch und können aufgrund der Infektion mit anderen Krankheitserregern beobachtet werden. Die pathologischen Veränderungen des Patienten in Organen wie der Brust können mittels Computertomographie (CT) beobachtet werden. Ein CT-Scan kann ein zuverlässiger Test zum Screening von SARS-COV-2-Fällen wie anderen Arten von Lungenentzündung sein. Die Analyse erforderte jedoch eine spezielle Ausrüstung und erfüllte eine beträchtliche Skala von Anforderungen nicht. COVID-19 kann über Labormessungen diagnostiziert werden. Diese Methoden werden normalerweise für die Untersuchung von Patienten verwendet. Sie können nicht verwendet werden, um kontaminierte Proben wie Oberflächen und Luft zu analysieren [1].

Abbildung 1. Diagnosemethoden für COVID-19.

Für die Diagnose von COVID-19 wurden mehrere Methoden entwickelt. Die Haupttests für die Diagnose können in drei Hauptkategorien eingeteilt werden [1]:

1. Gentests (virale Nukleinsäuretests):Analyse des viralen Genoms unter Verwendung von Methoden wie Echtzeit-Quantitative Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR), isothermale Amplifikation (z. B. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP), nukleinsäuresequenzbasierte Amplifikation (NASBA), Transkription -vermittelte Amplifikation (TMA), Rolling-Circle-Amplifikation (RCA), Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)) und Nanopore Targeted Sequencing (NTS).
2. Antigen-Tests: Analyse der viralen Proteine (membrangebundene Spike-Proteine oder Nucleocapsid-Proteine) mit Techniken wie Kolorimetrie, Feldeffekttransistor (FET), Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) und Massenspektrometrie (MS)
3. Serologische Tests: Analyse der Antikörper (Immunglobulin M (IgM) und Immunglobulin G (IgG)) gegen das Virus [18, 19]. Die Untersuchung der Antikörper des Patienten kann mit Methoden wie elektrischen (EC) Biosensoren, lokalisierter Oberflächenplasmonenresonanz (LSPR), oberflächenverstärkter Raman-Streuung (SERS), Quarzkristall-Mikrowaage (QCM), fluoreszenzbasiertem Biosensor, Kolorimetrie durchgeführt werden oder mit Gold-Immunchromatographie, ELISA, Chemilumineszenz-Immunoassay und piezoelektrische Microcantilever-Sensoren (PEMS).

Leider haben viele herkömmliche Nachweisverfahren für Atemwegsviren, wie RT-PCN, viele Nachteile. Diese sind zeitaufwändig, kostenintensiv, nicht immer bestimmbar oder reproduzierbar und erfordern qualifiziertes Personal und andere technische Einrichtungen [3].

Abbildung 2. Nachteile traditioneller Methoden .

3. Nanotechnologie

Die Nanotechnologie bietet neue Techniken für die schnelle Diagnose, die Erkennung von Infektionen im Frühstadium und die Identifizierung von virulenten Krankheitserregern, die die Pandemie verursachen, insbesondere durch die Verbesserung der Effizienz und Qualität des Erkennungsprozesses durch den Einsatz von Nanobiosensoren. Darüber hinaus zeigen neue Nanostrukturen und Nanosensoren Eigenschaften und Leistungen, die auf makroskopischer Ebene nicht sichtbar sind, was für die Erkennung und Erfassung von Ereignissen auf Nanoebene von Bedeutung ist [3].

Nanotechnologie kann die Diagnose von COVID-19 verbessern und eine hochmoderne Diagnosemethode basierend auf einer Point- of – Care (POC)-Sensortechnologie vorschlagen. Darüber hinaus kann es mit Techniken der künstlichen Intelligenz (KI) und in das Internet of Medical Things (IoMT) integrierten Biosensoren zum Studium der praktischen Informatik über Datenspeicherung, -freigabe und -analyse verbunden werden. Außerdem können sie traditionelle Verfahren wie geringe Empfindlichkeit, geringe Selektivität, hohe Kosten und verlängerte Diagnosezeit umgehen. Neue Methoden können für eine schmerzfreie Probenanalyse verwendet werden, wie z. B. die Analyse des Speichels des Patienten mit einer Sonde mit Graphenoxid (GO)/Au/Faser-Bragg-Gitter (FBG). Die Nanotechnologie kann Technologien wie markierungsfreie Biosensoren, Papier-Lateral-Flow-Assays, optische Technologien und digitale Technologien vorantreiben [1].

3.1. Nanobiosensoren

Das höhere Überwiegen von Virusausbrüchen kann auf die ungeeigneten Erkennungsinstrumente zurückgeführt werden, die zum Nachweis der ansteckenden Erreger verwendet werden. Folglich erfordert dies ein Detektions- oder Diagnosewerkzeug, das in seinen biosensorischen Eigenschaften kräftig, schnell, anspruchsvoll und präzise ist. Die Biosensoren können als analytische Instrumente charakterisiert werden, die geringe Konzentrationen eines Analyten in biologischen Proben (wie menschliches Serum, Blut, Tränen, Speichel usw.) bestimmen können. Im Vergleich zu herkömmlichen qualitativen und quantitativen Testkits sind diese Biosensoren vorteilhaft präzise und empfindlich gegenüber dem gerichteten Ziel [15].

Abbildung 3. Klassifizierung und Anwendungen verschiedener Biosensoren.

Der Bedarf an Genauigkeit und Schnelligkeit bei der Diagnose von COVID-19 wird durch die traditionellen Methoden der serologiebasierten Tests und der reversen Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) nicht erfüllt, die routinemäßig zum Nachweis und zur Diagnose von COVID -19 eingesetzt werden. Diese Bedingung kann durch den Einsatz ultraempfindlicher Nanobiosensoren erfüllt werden, die eine wichtige Rolle beim Nachweis des neuartigen Coronavirus spielen. Nanobiosensoren bieten eine schnelle, kostengünstige, präzise und miniaturisierte Plattform zum Nachweis von SARS-CoV-2 [10] . Biosensoren umfassen typischerweise ein biologisches Erkennungsmolekül, das auf der Oberfläche eines Signalwandlers immobilisiert ist, und können zur Analyse, Diagnose, zum Schutz, zur Sicherheit und zum Testen größerer Populationen verwendet werden [3].

Nanobiosensoren bieten mehrere Vorteile, die eine effektive Erkennung bewirken, wie z. B. [3]:

• Kosteneffizient;
• Langes Selbstleben;
• Einfach zu verwenden;
• Autonom;
• Präzision;
• Portabilität;
• Schnelle Antwort;
• Hohe Empfindlichkeit;
• Multiplexing-Fähigkeiten;
• Lebensfähiger Prozess.

Nanobiosensoren sind Geräte, bei denen der Wandler so verändert wird, dass er die Zielkomponente einfängt, die biologische Antwort in elektrische Signale umwandelt und sie schnell und mit hoher Präzision erkennt. Die physikalischen Reaktionen können berechnet werden, indem die geeigneten Biorezeptoren wie Nukleinsäuren, Antigene, DNA-Sonden, Peptide, ganze Zellen, Mikroorganismen und Gewebe bestimmt werden. Diese Rezeptoren sind leicht erkennbar, hochempfindlich und detektieren spezifische Bioanalyten. Verschiedene Arten von Biorezeptoren wurden untersucht, um die Viren zu fangen, wie Nukleinsäuren (NA), Immunaffinität und Protein in mehreren Nanobiosensoren basierend auf Elektrochemie, Impedanz, Quarzkristallmikrobalance und optischer und Oberflächenplasmonresonanz. Das Zielmolekül bindet an den Biorezeptor, um durch eine ungewöhnliche Reaktion ein biologisches Molekül einzufangen. Dann gibt der Wandler mit integriertem Molekül eine bestimmte Antwort durch. Anschließend wandelt der Transducer mit integrierten Nanostrukturen die Detektion in ein vom Detektor definiertes elektrisches Signal um (Abb. 4) [3].

Abbildung 4. Das schematische Diagramm verschiedener Analyten, Biorezeptoren für Bioerkennungselemente, Transducer mit integrierten Nanostrukturen als Teile eines typischen Nanobiosensor- Designs für Atemwegsviren.

Nanobiosensoren zum Nachweis von SARS- oder MERS-Coronaviren verwendet werden , können basierend auf dem biologischen Molekül des viralen Ziels (Nukleinsäuren, Antigene oder Antikörper) in Nukleinsäure-basiert, Nukleinsäure-Biosensor, Antigen-basierter Biosensor und Antikörper-basiert kategorisiert werden Biosensor (Abb. 5) [3] .

Abbildung 5. Schematische Darstellung verschiedener Biosensorklassifikationen zum Nachweis von SARS- und MERS-Coronaviren

3.1.1. Elektrochemische Nanobiosensoren

Elektrochemische Biosensoren sind am weitesten verbreitet und am günstigsten bevorzugte Art von Messorten. Gemäß der Definition der International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) ist ein elektrochemischer Biosensor „ein in sich geschlossenes integriertes Gerät, das in der Lage ist, spezifische quantitative oder halbquantitative analytische Informationen unter Verwendung eines biologischen Erkennungselements (biochemischer Rezeptor) zu liefern, das erhalten bleibt in direktem räumlichen Kontakt mit einem elektrochemischen Transduktionselement.“ [8, 13].

Ein elektrochemischer Nanobiosensor ist ein molekulares Sensorgerät, das ein biologisches Erkennungsereignis mit einem Elektrodenwandler koppelt, um ein nutzbares elektrisches Signal zu erzeugen. Da elektrochemische Nanosensoren Elektroden enthalten, sind die Halbleitereigenschaften, die dielektrischen Eigenschaften und die Ladungsverteilung kritische Elemente [3].

Abbildung 6. Schema, das Designkomponenten von Biosensoren zeigt, die zum Erfassen von Zielanalytproben verwendet werden, mit besonderem Schwerpunkt auf der Verwendung einer elektrochemischen Bioerfassungsplattform, die biochemische Informationen in Strom- oder Spannungssignale auf einer elektrochemischen Wandleroberfläche umwandelt.

Die Hauptvorteile elektrochemischer Biosensoren sind [5, 11]:

• Einfache Entwicklung;
• Möglichkeit der Miniaturisierung;
• Hohe Empfindlichkeit ;
• Relativ niedrige Kosten.

Elektrochemische Sensoren sind eine attraktive Wahl für den Nachweis einer Vielzahl von Biomolekülen, da sie problemlos mit mehreren Modulen kombiniert werden können, a. kostengünstige mikroelektronische Schaltungen, b. miniaturisiertes Lab-on-a-Chip, c. Schnittstellen mit elektronischer Auslesung und d. eine Signalverarbeitungseinheit. Elektrochemische Biosensoren sind empfindlich, leicht zu miniaturisieren, erfordern geringe Analytvolumina, die überlegene Grenze des Analytnachweises und die Anzeige von Ergebnissen vor Ort werden in der medizinischen Diagnostik und vielen anderen Forschungsbereichen, einschließlich Lebensmittelsicherheit und Umweltüberwachung, am meisten bevorzugt [8].

Der elektrochemische Biosensor kann basierend auf den für Signalmessungen verwendeten Wandlermodi kategorisiert werden. Dazu gehören Transduktionsplattformen für Konduktometrie und Oberflächenladung, Amperometrie und Potentiometrie. Das allgemeine Prinzip der elektrochemischen Biosensorik (Bioelektrochemie) basiert auf der elektrochemischen Reaktion, die auf oder in der Nähe der Elektrode und/oder zwischen den Elektroden stattfindet, die zu führen; ( i ) ein messbares Stromsignal ( amperometrisch ), (ii) akkumulierte Ladung oder Potenzial (potentiometrisch) oder (iii) Änderungen in der Leitfähigkeit des Mediums ( konduktometrisch ). [8].

Abbildung 7. Klassifizierung der elektrochemischen Biosensoren nach Art des Wandlers und Signalmodi.

Elektrochemische Nanobiosensoren können auch verwendet werden, um virale Nukleinsäuren zu identifizieren. Ein zum Nachweis von SARS entwickelter elektrochemischer Genosensor wurde unter Verwendung einer Monoschicht aus thiolierten Oligonukleotiden entwickelt, die sich selbst auf mit Goldnanopartikeln beschichteten Kohlenstoffelektroden anordnen. Die Oligonukleotidsequenzen entsprechen genau dem Nukleokapsidprotein von SARS, und die virale Infektion wird durch enzymatische Amplifikation viraler DNA nachgewiesen. Der Nanobiosensor hilft beim sensitiven Nachweis von SARS. Ein elektrochemischer Nanobiosensor , der unter Verwendung von Goldnanopartikeln hergestellt wurde, die mit einer Kohlenstoffelektrode und rekombinantem Spike-Protein S1 als Biomarker verändert wurden, wurde entwickelt, um MERS -CoVs zu erkennen. Dieser Ansatz ist jedoch auch für den Nachweis von Coronaviren vielversprechend. Aufgrund seiner elektrischen Leitfähigkeit wurde der Biosensor mit einem fluordotierten Substrat und Gold-Nanopartikeln als Signalverstärker hergestellt. [10].

Die Modifizierung elektrochemischer Sensorgrenzflächen mit Goldnanopartikeln (AuNPs) zeigt verbesserte Anwendungen und kann zum Nachweis von MERS- CoV verwendet werden. AuNPs fungieren als Arbeitsgrenzflächen mit elektrokatalytischen Eigenschaften und ermöglichen eine Verstärkung der elektrischen Reaktion (Abbildung 8). Ein Immunsensor wurde zum Nachweis des MERS – CoV -Virus entwickelt, der die Aussicht auf elektrochemische Sensoren und Goldnanopartikel verbindet. Der Nanobiosensor wird mit einem Bündel von mit Kohlenstoffelektroden beschichteten Goldnanopartikeln entwickelt.

Abbildung 8. Betriebsschritte für die elektrochemische COVID-19-Sensorplattform: (A) Probenentnahme über den Nasenabstrich oder Speichel, (B) RNA-Extraktion, (C) Immobilisierung des RNA-Extrakts auf der Oberseite der graphenessDNA-AuNP-Plattform, (D) Inkubation von 5 min und (E) Aufzeichnung der digitalen elektrochemischen Ausgabe.

Es wurde beobachtet, dass das rekombinante Spike (S1)-Protein an Gold-Nanopartikeln immobilisiert wird und mit den Viruspartikeln um die Bindung an den Antikörper konkurriert. Wenn keine Virusinfektion vorliegt, heftet es sich an das immobilisierte Spike-Protein. Da diese Nanobiosensor- Methode über eine Gruppe von Elektroden verfügt, kann sie zum Nachweis verschiedener Coronaviren verwendet werden [5, 10].

 Graphen-gekoppelter elektrochemischer Nachweis von SARS-CoV-2

Elektrochemische Transduktionsplattformen können Viren oder alle lebenden mikrobiellen Krankheitserreger mithilfe ihrer spezifischen Bioerkennungselemente erkennen. Es gibt mehrere alternative Wege für den elektrochemischen Nachweis von krankheitsverursachenden Mechanismen. Der Nachweis genetischer Marker mit elektrochemischen Sensorplattformen ist jedoch aufgrund ihrer nicht nachweisbaren Virustiter nicht für Virusnachweise geeignet, insbesondere zu Beginn von Virusinfektionen [8, 14].

In den letzten Jahren wurden mehrere Versuche unternommen, Strategien anzuwenden, die elektrochemischen Glukometern ähneln, um Viren oder Virusinfektionen nachzuweisen. Torrente-Rodríguez et al. entwickelten einen kostengünstigen tragbaren elektrochemischen Biosensor mit integriertem Graphen für die schnelle Diagnose und biochemische Überwachung von Markern in Serum- und Speichelproben für COVID-19 [8, 14].

Die elektrochemischen Sensorelektroden waren Graphen, das auf einem flexiblen Polyimid (PI)-Polymersubstrat für den Multiplex-Nachweis von Virusinfektions-Biomarkern (Antigene und Antikörper) eingeschrieben war. Torrente-Rodríguez et al. demonstrierten den quantitativen Nachweis spezifischer Biomarker von COVID-19, wie z. B. SARS-CoV-2-Spike-Protein (S1), Nukleokapsidprotein von SARS, CRP, ein Protein-Biomarker für Entzündungen innerhalb physiologisch relevanter Bereiche sowohl im Blut als auch im Speichel und spezifische Immunglobuline ( Igs ) wie S1-IgM und S1-IgG. Dieser Ort verwendet Antigene und Antikörper auf Graphen-Elektroden mit erhöhter Empfindlichkeit und Multiplexing-Kapazität zur Erkennung mehrerer SARS-Co-V2-Marker, während die resultierenden Reaktionsdaten drahtlos an ein tragbares mobiles Gerät übertragen werden. Diese Art von miniaturisierter elektrochemischer Plattform ist ein großes Versprechen für die zukünftigen elektrochemischen PoC- und personalisierten Gesundheitsgeräte [8, 14].

3.1.2. Optische Nanobiosensoren

Aufgrund der außergewöhnlichen Eigenschaften optischer Biosensoren, wie z. B. hohe Empfindlichkeit, Markierungsfreiheit, Robustheit, Immunität gegenüber elektromagnetischen Störungen, berechenbare optische Ausgänge, Miniaturisierbarkeit , Integrationsfähigkeit, Portabilität, Multiplexing-Kapazität und gleichzeitige Erkennung verschiedener Ziele werden optische Biosensoren als diagnostische Werkzeuge für respiratorische Virusinfektionen eingesetzt. Damit kommen optische Biosensoren für den Point-of-Care-Bereich in Frage [9, 10].

Abbildung 9. Eine drahtlose Graphen-basierte Telemedizinplattform (SARS-CoV-2 RapidPlex) für den elektrochemischen Schnell- und Multiplex-Nachweis von SARS-CoV-2 in Blut und Speichel (A) Schematische Darstellung der SARS-CoV-2 RapidPlex-Multisensor-Telemedizinplattform zum Nachweis von viralen SARS-CoV-2-Proteinen, Antikörpern (IgG und IgM) und dem entzündlichen Biomarker C-reaktives Protein (CRP). Daten können drahtlos an eine mobile Benutzerschnittstelle übertragen werden. WE, Arbeitselektrode; CE, Gegenelektrode; RE, Referenzelektrode. (B) Massenproduzierbare lasergravierte Graphen-Sensorarrays. (C) Foto eines Einweg- und flexiblen Graphen-Arrays. (D) Bild eines SARS-CoV-2 RapidPlex-Systems mit einem Graphen-Sensorarray, das zur Signalverarbeitung und drahtlosen Kommunikation mit einer Leiterplatte verbunden ist.

Kohlenstoffnanoröhren. Goldnanoinseln und Graphen werden hauptsächlich in optischen und elektrochemischen Biosensoren eingesetzt. Gold- Nanoinseln aus winzigen Gold-Nanostrukturen können mit künstlich synthetisierten DNA-Rezeptoren und komplementären RNA-Sequenzen von SARS-CoV-2 auf einem Glassubstrat konstruiert werden. Da es sich bei COVID-19 um ein einzelsträngiges RNA-Virus handelt, fungiert der Rezeptor des Nanobiosensors als komplementäre Nachfolge zur RNA-Sequenz des Coronavirus und weist das Virus nach. LSPR (lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanz) wurde verwendet, um die Bindung der RNA-Sequenz an den Sensor nachzuweisen. Nach Bindung der Moleküle auf der Oberfläche des Nanobiosensors ändert sich der lokale Infrarotindex, und ein optischer Nanobiosensor berechnet die Modifikationen und bestimmt das Vorhandensein von RNA-Strängen [9, 10].

Insbesondere wurde ein hochwirksamer, auf optischen Biosensoren basierender Nachweis von SARS-CoV-2 mit Oberflächenplasmonenresonanz und Fluoreszenz vorgestellt. Wenn ein optischer Biosensor mit dem Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Verfahren verbunden wird, ist das resultierende Verfahren für die schnelle Diagnose einer SARS-Infektion wertvoller als enzymgebundene Immunosorbent-Assays (ELISA). Ein faseroptikfähiger Biosensor, der auf lokalisierter Oberflächenplasmonen-assoziierter Fluoreszenz (LSPCF) basiert, kann das rekombinante N-Protein (SARS- CoV-N) unter Verwendung von AuNPs erkennen. Es wurde festgestellt, dass ein viraler Bestand von nur 106 Partikeln/ml mit einem faseroptikbasierten nanofähigen Biosensor innerhalb von 15 min nachgewiesen werden kann. Diese Umfragen weisen darauf hin, dass virale Atemwegsinfektionen durch die Verwendung von Nanomaterialien schnell und umgehend diagnostiziert werden können [9] .

Abbildung 10. Schematische Darstellung eines optischen Biosensors

3.1.3. Graphenbasierte Biosensoren

Ein graphembasiertes FET (Feldeffekttransistor)-Gerät wird eingesetzt, um die SARS-CoV-2-Viruslast in Nasen-Rachen-Abstrichen von COVID-19-Patienten zu bestimmen. Der graphenbasierte FET- Nanobiosensor besteht aus einer Graphenfolie als Erfassungsbereich, die auf ein SiO2/Si-Substrat verschoben wird, und einem SARS-CoV-2-Spike-Antikörper, der auf der Graphenfolie immobilisiert ist. Die Biosensoren helfen beim Nachweis von SARS-CoV-2-Antigenspitzen sogar bei einer Konzentration von 1 fg /ml in Phosphatpuffer [10].

Graphen-basierte Biosensoren sind wertvoll für die Prüfung und den hochmodernen Nachweis von [9]:

• Blutzucker;
• Atemfrequenz;
• Körpertemperatur in Echtzeit;
• Blutdruck;
• Virus;
• kleine Moleküle.

Aufgrund der Kosteneffizienz, der hohen Assoziation und der einfachen Herstellung sind Nanomaterialien auf Graphenbasis die attraktivsten Materialien für Biosensoren. Beispielsweise wurde erfolgreich ein transistorbasierter Biosensor zum Nachweis von SARS-CoV-2 (Spike-Protein) entwickelt. Der Biosensor wurde unter Verwendung von mit Feldeffekttransistoren (FET) beschichteten Graphenfolien mit einem spezifischen Antikörper hergestellt (Abbildung 9). Graphen und seine Derivate zeigen geeignete Integritäts-FET-basierte Biosensorgeräte zum Einfangen von Viren, da sie Vorteile gegenüber anderen derzeit verfügbaren Diagnosemethoden haben [9].

FET-basierte Biosensor-Geräte können empfindliche und sofortige Messungen durchführen, indem sie kleine Mengen von Analyten verwenden. Darüber hinaus sind Biosensoren auf FET-Basis wahrscheinlich und von Nutzen bei der klinischen Diagnose, der On-Sight-Erkennung und dem Point-of-Care-Testen. Es wurde eine unverstärkte und schnelle Nanosensor -Plattform geschaffen, um SARS-CoV-2-RNA in menschlichen Rachenabstrichproben nachzuweisen. Ein Graphen-Feldeffekttransistor (G-FET)-Sensor wurde entwickelt, um Gold-Nanopartikel (AuNP) zu veranschaulichen. Auf den Oberflächen von AuNPs wurden komplementäre Phosphordiamidat – Morpholino-Oligo(PMO)-Sonden immobilisiert. Dieser Sensor weist auf ein niedriges Hintergrundsignal hin, da das PMO sehr empfindlich auf SARS-CoV-2 RdRp reagiert. Wenn ein Graphen-Feldeffekttransistor mit einem CRISPR-Cas9-basierten Biosensor verbunden wird, ist er in der Lage, nicht amplifizierte Zielgene zu erkennen, und könnte somit auf virale Ziele wie die Nukleinsäuren von SARS-CoV-2 untersucht werden [9]:

3.1.4. Chirale Nanobiosensoren

Chirale Nanobiosensoren werden aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit und schnellen Reaktionszeit bald an der Spitze der Bionanotechnologie stehen. Sie werden maßgeblich an der SARS-CoV-2-Pandemie beteiligt sein. Die Popularität der Nanochiroptik ist aufgrund neuartiger Methoden zur Herstellung künstlicher metallischer Nanostrukturen mit einer abstimmbaren Oberflächenmorphologie und zur Vervollständigung ihrer Nanoanordnung explodiert. Dies bietet eine beispiellose Leistung über ihre elektronischen und optischen Eigenschaften. Der wichtigste Vorteil solcher Nanohybridstrukturen besteht darin, dass sie die chiroptische Reaktion verbessern, was für verschiedene Anwendungen im Zusammenhang mit der chiralen Biosensorik von erheblichem Interesse sein könnte und neue Forschungsgebiete erschließt. Im Vergleich zu natürlichen chiralen Molekülen führen chirale plasmonische Nanostrukturen nicht nur zu signifikanten chiroptischen Effekten, sondern präsentieren auch völlig einzigartige Ideen von superchiralem Licht in technologischen Anwendungen [2, 5].

Abbildung 11. Nachweis von SARS-CoV-2 mithilfe von FETs: Das Schema zeigt eine Sammlung biologischer Proben eines Patienten und ihre Anwendung auf dem graphenbasierten Erfassungsbereich eines FET-Biosensors. Bindungsereignisse im Zusammenhang mit dem SAR-CoV2-Virus können vom Sensor in Echtzeit erfasst werden.

Ahmed et al. entwickelten eine selbstorganisierte Technik für die Entwicklung eines chiralen Immunsensors unter Verwendung von Goldnanopartikeln und Quantenpunkten. Zirkonium-Quantenpunkte und magnetische Nanopartikel wurden mit Coronavirus-spezifischen Antikörpern konjugiert und gemischt. In Gegenwart eines viralen Targets heften sich sowohl die Quantenpunkte als auch die Nanopartikel an das virale Target und entwickeln magneto-plasmonisch fluoreszierende Nanohybride, die ein äußerer Magnet teilen kann. Die Analytkonzentration wurde dann durch Berechnen der Fluoreszenzdurchsetzungsfähigkeit der divergierten Nanohybride bestimmt. Dieses Sensing-Verfahren hat eine Nachweisgrenze von 79,15 EID/50 μl [2, 5, 10].

3.1.5. Aptamer-basierter Biosensor

Aufgrund der robusten Screening-Methode können Aptamere virale Gene, Proteine oder andere virale Infektionsmarker erkennen. Durch Anpassung der entwickelten Assays können Aptamer-basierte Sensoren zwischen infizierten und nicht infizierten Wirtszellen oder aktiven und inaktiven Virusformen unterscheiden. Aufgrund ihrer Eigenschaften hat der Aptamer-basierte Nachweis erhebliche Vorteile gegenüber Antikörpern, darunter eine hohe Widerstandsfähigkeit bei einer Vielzahl von Temperaturen und Situationen, eine unkomplizierte Synthese durch eine systematische Evolution von Liganden durch die Methode der exponentiellen Anreicherung (SELEX) und eine einfache Transformation je nach Bedarf des Assays [4].

Abbildung 12. Nachweis von SARS- CoV und SARS-CoV-2 mit Aptamer-basierten Biosensoren.

Biosensoren verwenden Antikörper- und Aptamer-basierte Nachweismechanismen. Aptamere sind haltbarer, günstiger und schneller zu synthetisieren als Antikörper. Aptamere, auch als „chemische Antikörper“ oder „künstliche Antikörper“ bekannt, werden aufgrund ihrer entscheidenden Besonderheit gegenüber ihren Zielen häufig mit Antikörpern verglichen. Einige Aptamere wurden in SARS-CoV-2 isoliert und in Aptasensing – Plattformen eingebaut [7].

Aptamere sind Oligonukleotidsequenzen, die so gestaltet werden können, dass sie verschiedene Biomoleküle spezifisch erkennen und daran binden:

• winzige Moleküle wie Aminosäuren, Nukleotide und Antibiotika;
• 67,68 Makromoleküle wie Nukleinsäuren und Proteine;
• 69 und sogar Oberflächenepitop tragende ganze Bakterien, Viren70 und andere Zellen.

Aptamere bilden einzigartige dreidimensionale (3D) Strukturen, während sie sich spezifisch an Analyten befestigen. Diese lassen sich schnell modellieren und stabil auf der Oberfläche von Biosensoren immobilisieren. Aptamer-basierte Biosensoren (Aptasensoren) können Zielanalyten quantitativ nachweisen, indem sie das aus den gekoppelten chemischen und/oder biochemischen Oberflächenwechselwirkungen entwickelte Signal berechnen. Aptamere gelten als vielversprechendes diagnostisches Werkzeug zum Nachweis von Viren [7].

Aptasensoren sind Aptamer-basierte Biosensoren, die zur Erforschung und Quantifizierung von Zielanalyt-Biomolekülen über unterschiedliche biochemische Reaktionen im Zusammenhang mit einem quantifizierbaren Signalerzeugungsmechanismus entwickelt wurden. Der Austausch spezifischer Aptamere mit Zielbiomolekülen stellt die Bioerkennung und das Einfangen des Ereignisses dar, das zusätzlich in ein entsprechendes Signal umgewandelt wird. Aptasensoren, über die kürzlich zum Nachweis von SARS-CoV-2 berichtet wurde, können basierend auf der Art der Signalübertragung grob in zwei Kategorien eingeteilt werden: optische und elektrochemische Aptasensoren [7].

3.2. Point-of-Care-Tests

Point-of-Care-Tests, wie sie vom Centers for Disease Control and Prevention Center definiert werden, sind „diagnostische Tests, die an oder in der Nähe des Ortes durchgeführt werden, an dem eine Probe entnommen wird, und sie liefern Ergebnisse innerhalb von Minuten statt Stunden. Dies können Nucelic Acid Amplification Test (NAAT), Antigen- oder Antikörpertests sein.“ [18].

Der Markt für Point-of-Care-Tests (POCT) für Infektionskrankheiten stellt einen vielversprechenden und erheblichen Anstieg der globalen In-vitro-Diagnostika (IVD) der Branche dar. Die zunehmende Ausbreitung des Humanen Immundefizienzvirus (HIV), Tuberkulose (TB) und Malaria in Entwicklungsländern und die Gefahr neu auftretender und wiederauftretender ansteckender Krankheiten wie dem Nahost-Atemwegssyndrom (MERS), dem schweren akuten Atemwegssyndrom (SARS), ZIKA, verschiedene Influenza-Stämme und das West-Nil-Virus sind Faktoren, die den Bedarf für POCT erhöhen [6].

Ansteckende Krankheiten stellen eine erhebliche Bedrohung für die menschliche Gesundheit dar und führen weltweit zu mehr als der Hälfte der Todesfälle. Darüber hinaus haben weit verbreitete ansteckende Krankheiten die Sterblichkeitsraten in Entwicklungsländern kontinuierlich erhöht. Der effizienteste Weg zur Eindämmung der Epidemie ist eine frühzeitige Diagnose, die aufgrund teurer und umfangreicher Geräte, Spezialisten und langsamer Datenausgabe schwierig ist, gängige Ansätze anzuwenden. Daher sind schnelle POCT-Methoden unerlässlich, um diese Belastungen zu überwinden, indem die Gerätekosten miniaturisiert und gesenkt werden und zugängliche, schnelle und einfach zu handhabende diagnostische Tests ohne spezielle Schulung bereitgestellt werden [6].

POC-Tests ermöglichen die Diagnose infizierter Personen, ohne Patientenproben an Labore zu senden. Dies ist äußerst wichtig für Orte oder Einwohner, die keine geeignete Laborinfrastruktur für Probentests haben. Der wesentliche Teil des PoC-Tests ist der Biosensor, der verwendet wird , um einen biochemischen Assay zum Nachweis des Pathogens zu erreichen.

Die Vorteile der Verwendung von PoC-Tests sind [4]:

1. minimale Platzverhältnisse für Prüfung und Lagerung;
2. breit angelegte Analyse;

• Tests können an verschiedenen Orten durchgeführt werden;

1. anpassungsfähig bei der Erfüllung verschiedener medizinischer Bedürfnisse.

Abbildung 13. Schematische Darstellung der quantitativen Auswertung von SARS-CoV-2 mit dem SERS-basierten Aptasensor. (a) Nachdem SARS-CoV-2-Lysate die Ziel-Spike-Proteine freigesetzt haben, werden sie von den Aptamer-DNAs auf den Au-Nanopopcorn-Oberflächen erkannt. Die S-Protein-gebundenen Aptamere bewegen sich von den Au-Nanopopcorn-Oberflächen weg, was zu einer verringerten Raman-Peak-Intensität von Cy3-Reportern führt. (b) Cy3-markierte Aptamer-DNAs werden mit Einfang-DNAs auf dem Au-Nanopopcorn-Substrat hybridisiert. Die 4-MBAs des internen Standards werden zusammen mit Aptamer-DNAs auf dem Au-Nanopopcorn-Substrat immobilisiert. (c) Die Erkennung des SARS-CoV-2-S-Proteins induziert eine Konformationsänderung von Aptamer-DNAs, die es den Aptamer-DNAs ermöglicht, an die RBD auf dem Spike-Protein zu binden.

Einer der attraktivsten POCTs sind diejenigen, die auf kolometrischen Biosensoren basieren, da sie den Nachweis des Analyten durch einfache Farbänderungen ermöglichen, die mit bloßem Auge beobachtbar sind [5] .

Abbildung 14: Nanopartikelbasierter kolorimetrischer Virusnachweis. Diese Abbildung zeigt den Mechanismus, durch den das Virus die Aggregation von Nanopartikeln verursacht, was zu einer Farbänderung von rot nach violett führt.

Kimet al. erstellten einen kolorimetrischen Assay mit Goldnanopartikeln zum Nachweis des MERS – CoV -Virus. Sie schlugen einen kolorimetrischen Assay vor, der auf einer erweiterten Struktur von doppelsträngiger DNA (dsDNA) mit selbstorganisiertem, abgeschirmtem Gold basiert. Dieser Assay verwendet zwei Thiol-modifizierte Sonden und Citrat-bedeckte Gold-Nanopartikel (AuNPs) Nanopartikel (AuNPs) unter positivem Elektrolyt (z. B. 0,1 M MgCl2) [5, 6].

Der auf Gold-Nanopartikeln basierende kolorimetrische Test stellt eine Gold-Nanopartikel-Lösung her, die das Virus sammelt und eine beobachtbare Farbänderung in der Flüssigkeit zeigt. Dies ergibt einen Schnelltest für COVID-19, indem die Farbe von Gold-Nanopartikeln geändert wird. Dieser kostengünstige Test wirkt viel besser als die anderen diagnostischen Techniken, ähnlich wie die Standard-PCR-Tests. Der Hauptvorteil dieses Tests besteht darin, dass Goldnanopartikel spezifische Farben zeigen, weil sie bestimmte Wellenlängen absorbieren. Zu den Gold-Nanopartikeln wird die Probe gezählt, die SARS-CoV-2 enthält, was zu einer Akkumulation des Virus führt und eine Veränderung der Absorptionshöhe hervorruft, die zu einer Farbänderung der Lösung führt. Diese Farbverschiebung ist mit bloßem Auge erkennbar, und der Nachteil ist, dass dies nur möglich ist, wenn die Viruslast sehr hoch ist [12].

Die Sonden sind über beträchtliche Au-S-Austausche an AuNPs konjugiert. In Abwesenheit eines Ziels führt die Gesamtheit der AuNPs (in einem positiven Elektrolyten) zu einer Farbänderung , die entweder mit bloßem Auge sichtbar ist oder durch lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanz (LSPR)-Verschiebung nachgewiesen wird. Nichtsdestotrotz verursacht die Existenz eines viralen Ziels eine umfassende Selbstorganisation von doppelsträngiger DNA, wodurch die Akkumulation von Goldnanopartikeln in der Existenz positiver Elektrolyte kontrolliert wird, wodurch eine Verschiebung der optischen Eigenschaften von AuNPs verhindert wird [5, 6].

Die potenzielle Nachweisgrenze dieses Assays beträgt 1 pmol μl−1, was den Nachweis geringerer Mengen des viralen Ziels ermöglicht. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung eines solchen kolorimetrischen Assays eine kostengünstige und schnelle Krankheitsdiagnose, ohne dass hochentwickelte Werkzeuge erforderlich sind [5].

3.3. Nanoporen-Target-Sequenzierung (NTS)

Die Nanoporen-Metagenom-Methode (NTS) hat gezeigt, dass sie bakterielle Atemwegsinfektionen und Viren sofort aus klinischen Proben erkennt. Darüber hinaus können Krankheitserreger und Antibiotika-Resistenzgene in mehreren Stunden erkannt werden, viel schneller als herkömmliche Kulturverfahren wie die Echtzeit-Datengenerierung von Nanoporen-Sequenzierern. Darüber hinaus wurde die Nanoporensequenzierung verwendet, um Sequenzen im Transkriptom von SARS-CoV-2 zu steuern. Das NTS-Verfahren weist innerhalb von nur 6–10 Stunden gleichzeitig SARS-CoV-2 und zehn weitere Atemwegsviren nach. Daher ist es für die aktuelle Diagnose von COVID-19 geeignet. Dennoch kann der Rahmen erweitert werden, um andere Viren und Krankheitserreger zu diagnostizieren. NTS basiert auf der Amplifikation von 11 virulenzbezogenen und außergewöhnlichen Genfragmenten von SARS-CoV-2 (z. B. orf1ab) unter Verwendung eines inneren primären Panels, gefolgt von der Sequenzierung des verstärkten Fragments auf einer Nanoporenplattform. Diese Aufgabe verwendet eine Nanoporenplattform für die Sequenzierung, um lange Nukleinsäurefragmente zu sequenzieren und gleichzeitig die Datenausgabe in Echtzeit zu analysieren. Dies ermöglicht die Verifizierung von SARS-CoV-2-Infektionen innerhalb von Minuten nach der Sequenzierung durch Zuordnung der Sequenz-Reads zum SARS-CoV-2-Genom und Analyse der Originalität, Gültigkeit und Read-Nummernsequenz der Ausgangssequenz [16, 17].

4. Herausforderungen und Grenzen der Nanotechnologie bei COVID-19

Auf Nanotechnologie basierende Systeme stoßen trotz ihrer Vorteile auf mehrere Hindernisse, bevor sie sicher auf dem Markt präsentiert werden können. Die häufigsten Probleme sind:

1. Skalierbarkeit und Produktionskosten,
2. Geistige und regulatorische Eigenschaften,
3. mögliche Toxizität und Auswirkungen auf die Umwelt.

Einige Probleme bei Anwendungen der Nanotechnologie müssen angegangen werden, bevor sie im Gesundheitssystem breite Anwendung finden. Primäre Aufgabe wird es sein, die Sicherheit von Nanomaterialien durch In-vitro-Untersuchungen ihrer Biokompatibilität zu gewährleisten. Das Schicksal von Nanomaterialien kann sich aufgrund der Proteinkoronabildung in den Körper übertragen, wenn sie durch Blut wandern. Daher müssen In-vivo-Studien sorgfältig durchgeführt werden, um die Toxizität von Nanopartikeln im Körper besser zu verstehen. Aufgrund von Einschränkungen wurden generische Protokolle für die Kategorisierung in einem frühen Stadium der Forschung und Entwicklung verwendet, die die Wahrscheinlichkeit von Fehlschlägen bei der klinischen Umsetzung einer auf Nanotechnologie basierenden Therapie falsch einschätzen. Eine engere Zusammenarbeit zwischen Zulassungsbehörden, Experten für Materialwissenschaften, Pharmakologie und Toxikologie ist erforderlich, um andere Einschränkungen zu überwinden [10].

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Test LO 3.2

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Referenzen

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