Резюме

Вирусите са високо подредени супермолекулни комплекси, които се възпроизвеждат чрез използване на механизмите на клетката – гостоприемник. Вирусите са изключително разнообразни и се разпространяват в клетките на организми от всички царства на живота. Въпреки това, те споделят много общи функции и свойства. За да могат да се използват вирусите и вирусоподобните частици като вектори за доставка на лекарства или като градивни елементи в електрониката е изключително важно първо да се разберат техните основни свойства и характеристики. В този учебен модул са представени свойствата на вируса и подходите, насочени за използване на вирусните частици.

Ключови думи/фрази : Corona вируси, функционални частици, наночастици на основата на вируси (VNPs)

1. Вируси и тяхното значение

1.1. Повсеместно разпространение на вирусите

Вирусите или молекулярните наномашини заразяват всички клетъчни форми на живот, включително еукариоти (гръбначни, безгръбначни, растения и гъби) и прокариоти (бактерии и Achaea). Наличието на вируси е видимо в гостоприемници, които проявяват симптоми на заболяване. От друга страна, много здрави организми са гостоприемници на непатогенни вирусни инфекции, някои от които са активни, докато други са латентни. Съща така е установено, че фрагменти от древни вирусни геноми отдавна са се интегрирали в геномите на гостоприемника. Вирусите могат да бъдат намерени в почвата, въздуха и водата и могат да заразят видове, които живеят в тези местообитания, в допълнение към техните естествени гостоприемници [10].

В литературата все още има спор за това дали вирусите са живи или неживи. Отговорът се определя от начина на дефиниране на живота. Вирусите имат гени, които се реплицират, когато заразяват клетките, което в този смисъл прави вирусите живи. Въпреки това, те не са същите като клетъчните форми на живот. Когато вирусите са извън своите гостоприемни клетки, те съществуват като вирусни частици (вириони), които са неживи и не се размножават. [10].

Вирусите се различават от живите клетките по това, че се размножават по различен начин. Новата клетка (прокариотна или еукариотна) винаги се генерира от по-рано образувана клетка, но нов вирион никога не се образува от по-рано образуван вирус. Процесът на репликация, който протича вътре в клетката гостоприемник, включва синтеза на градивни компоненти и тяхното сглобяване във вириони, което води до произвеждане на нови вируси. В резултат на това вирусите са по-скоро паразити, които разчитат на своите гостоприемници за по-голямата част от своите нужди, като например аминокиселини, нуклеозиди, клетъчни структури за биосинтеза на протеини (рибозоми) и енергия като аденозин трифосфат.

За да подобри ефективността на процеса на възпроизвеждане, вирусът променя вътреклетъчната среда на гостоприемника. Производството на нови мембранни структури, намалената експресия на клетъчни гени или усилването на клетъчен процес са примери за такива модификации. Някои огромни фаги кодират протеини, които увеличават фотосинтезата в клетките на техните фотосинтезиращи бактериални гостоприемници, като по този начин увеличават производството на вируси.

1.2 Причини за изследване на вирусите

1.2.1. Вирусите могат да причинят заболяване

Вирусите играят съществена роля в широк спектър от човешките заболявания, от леки (напр. обикновени настинки) до смъртоносни (напр. бяс). Пет пандемични респираторни инфекции, причинени от различни подтипове на грипния вирус, са атакували света през миналия век, като свинете са били значителни резервоари за тези грипни вируси. H1N1 (испански грип) от 1918 г. убива около 50 милиона души по света, H2N2 (азиатски грип) от 1957 г. поразява около 4 милиона души по света, H3N2 (хонконгски грип) от 1968 г. отнема живота на 1 милион души по света, H5N1 (птичи грип) от 2005 г. убива повече птици и хора, а H1N1 (свински грип) от 2009 г. погуби 18 000 души по света и обхваща над 100 страни, заразявайки хора, свине и птици [40].

В последните десетилетия се появи още една пандемия, предизвикана от семейството на коронавирусите. Тежкият остър респираторен синдром (SARS) и Близкоизточният респираторен синдром (MERS) са две регионални епидемии. SARS отне живота на 774 души през 2003 г., докато MERS погуби 858 души между 2012 и 2019 г. (Центрове за контрол и превенция на заболяванията, 2005 г.; Световна здравна организация, 2019 г.). През 2019 г. в Китай беше открит нов вирус, причиняващ новата коронавирусна болест 2019 (SARS-CoV-2 или COVID-19), която бързо се разпространи в 216 нации в Европа, Северна Америка, Азия, Близкия изток, Африка, и Латинска Америка. Световната здравна организация обяви COVID-19 за пандемична болест на 11 март 2020 г. [27].

1.2.2. Някои вируси могат да бъдат полезни

Редица вируси се изследват, защото имат настоящи или бъдещи приложения, които могат да бъдат от полза [10].

• Фагово типизиране на бактерии При възникване на огнища на болести, причинени от бактерии, идентифицирането на фаговите типове бактериални изолати може да предостави значителна епидемиологична информация.
• Източници на ензими Вирусните ензими намират различни приложения в молекулярната биология (например обратна транскриптаза от ретровируси и РНК полимерази от фаги).
• Пестициди Бакуловирусите се използват за контрол на някои насекоми вредители, а миксома вирусът вече е използван за контрол на зайци.
• Антибактериални средства Човешките фаги са били използвани за лечение на различни бактериални инфекции в средата на двадесети век.
• Противоракови агенти Проучва се използването на генетично модифицирани вирусни щамове за лечение на рак. Тези щамове са били манипулирани, за да им позволят да заразят и унищожат специфични туморни клетки, като същевременно изключват нормалните клетки.
• Генни вектори за производство на протеини Вирусите се използват като вектори за въвеждане на гени в култивирани животински клетки.
• Генни вектори за лечение на генетични заболявания Ретровирусите са използвани като вектори за прехвърляне на немутантно копие на мутиралия ген, отговорен за болестта, в стволовите клетки на деца с тежка комбинирана имунна недостатъчност.
• Базирани на вируси наноматериали и наноструктури в енергийните и биомедицински приложения Разработените биомиметични материали на базата на вируси се използват за създаване на биосензори и наноносители [40]

1.3. Класификация на вирусите

Понастоящем вирусите са класифицирани в осем групи от Международния комитет по таксономия на вируси (ICTV) [61]. Първата категория включва химерни вируси с двойноверижна ДНК и едноверижна ДНК, като плеоморфен вирус 1 на Нaloarcula hispanica. Двойноверижните ДНК вируси, като поксвируси, херпесвируси и аденовируси, се намират във втората категория. Едноверижният ДНК вирус, като парвовирусите, е включен в третата, а двойноверижният РНК вирус, като реовирусите, е в четвъртата група. Вирусите с положителни едноверижни РНК геноми, като текущата епидемия от SARS-CoV-2, ентеровируси, вирус на хепатит А, полиовирус, риновируси, вирус на шапа (HFM), вирус на SARS, вирус на жълта треска , вирус на хепатит С (HCV) и вирус на рубеола се обединяват в петата група. Шестата група включва вируси с отрицателни едноверижни РНК геноми, като смъртоносните вируси Марбург и Ебола, както и морбили, грипен вирус и паротит; седмата група включва вируси с едноверижни РНК геноми, които се репликират чрез ДНК междинен продукт, като HIV; и осмата група включва вируси с двойноверижни ДНК геноми и репликация на обратна транскриптаза, като вируса на хепатит B (HBV).

1.3.1. Таксономия на Coronaviruses

Коронавирусите (CoV) са значителна група вируси, принадлежащи към разред Nidovirales, подразред Cornidovirineae и семейство Coronaviridae. Letovirinae и Orthocoronavirinae са две подсемейства от семейство Coronaviridae. Родът Alphaletovirus принадлежи към семейство Letovirinae, докато семейството Orthocoronaviridae е разделено на четири рода въз основа на филогенетичен анализ и структура на генома: Alphacoronavirus (CoV), Betacoronavirus (CoV), Gammacoronavirus (CoV) и Deltacoronavirus (CoV), които съдържат 17 , съответно 12, 2 и 7 различни вида. „Corona“ е латинска дума, която означава „корона“ и вирусът получи името си от наличието на шипове в своята обвивка, които му придават подобна на корона форма под електронен микроскоп. Способността на вирусите в този ред е да създават набор от субгеномна иРНК, който се нарича нидо [3].

В резултат на това коронавирусите (CoV) са категоризирани в четири поколения: α-, β-, γ-, и δ-CoV [15]. α- и β-CoVs заразяват само бозайници, докато γ- и δ-CoVs може да заразят птици и някои бозайници. Най-новата класификация на Coronaviridae е показана на Фиг. 1.

Фигура 1. Таксономия на SARS-CoV-2 и неговите близкородствени таксони [3].

Към днешна дата е известно, че седем CoV причиняват инфекции при хора, включително CoV-OC43, CoV-229E, HCoV-OC43, CoV-HKU1, CoVNL63, близкоизточно респираторно заболяване (MERS)-CoV и тежък остър респираторен синдром (SARS)-CoV and SARS-CoV-2 or COVID-19 [51, 63].

SARS-CoV-2, член на семейство Coronaviridae, принадлежи към рода -CoV и се смята, че е таксономично и генетично идентичен на SARS-CoV, MERS-CoV и други човешки коронавируси [3].

SARS-CoV-2 показва отделна линия в подрода Sarbecovirus (преди това линия 2b на CoV), според Chan et al. [14]. Тъй като има много ограничени данни за тази нововъзникнала заплаха и стратегиите за превенция, приети по време на предишни изследвания и вирусни епидемии, играят важна роля в разработването на нови подходи срещу SARS-CoV-2, трябва да е полезно за учените да вземат тези „роднини ‘ на SARS-CoV-2 под внимание.

Други коронавируси обаче са довели до пандемични инфекции при домашни и диви бозайници и птици, което води до високи нива на смъртност и значителни икономически загуби. Кокоши IBV, коронавирус SW1 на белуга кит (BWCoV-SW1), коронавируси на прилепи CDPHE15 и HKU10 (ICTV 2018), вирус на епидемична диария по свинете (PEDV), TGEV и синдром на внезапна остра диария са сред идентифицираните вируси (SADS-CoV ) [3].

1.4. Природа на вирусите

1.4.1. Вирусите са малки частици

Повечето вирусни вириони са твърде малки, за да се видят със светлинен микроскоп и могат да се наблюдават само с електронен микроскоп. Те се срещат в широка гама от размери, форми и форми. Някои са огромни, докато други са малки; някои са сферични, а други приличат на пръчици. Много от тези вируси имат силно симетрична структура. Стандартната мерна единица за вириони е нанометър (1 nm = 10−9 m). Парвовирусите с размери от приблизително 20 nm са сред най-малките, докато вирусът, имитиращ микроби (мимивирус), изолиран от амеба, е сред най-големите. Коронавирусните вириони (CoV) имат диаметър от 60-140 nm и обикновено са сферични до плеоморфни затворени частици [1].
Вирусите са макромолекулни съвкупности, които са метастабилни. С изключение на аренавирусните вириони, които имат клетъчни рибозоми, опаковани при производството на вирионите, те не са клетки и не съдържат органели [10].

1.4.2. Вирусите имат генетичен материал

Геномът на вируса се съдържа във вириона. Вирусните геноми могат да бъдат съставено от двойноверижна ДНК, едноверижна ДНК, двойноверижна РНК или едноверижна РНК, докато клетъчните геноми могат да бъдат изградени само от двойноверижна ДНК.
Коронавирусите (SARS-CoV-2) имат един от най-големите монокомпонентни геноми сред РНК вирусите, представен от едноверижна положителна РНК [(+) ssRNA] [11]. Геномът на коронавируса е дълъг 29903 нуклеотида и включва две нетранслирани области (UTR) в 5′ и 3′ краищата, както и 11 отворени рамки за четене (ORFs) [14].
Капсидът е протеиновата обвивка, която обгражда генома. Вирионът се състои от геном, капсид и допълнителни компоненти. Основните функции на вириона са да защитава генома и да го транспортира до клетка, където може да се размножава. Други протеини, известни като неструктурни протеини, са кодирани от вирусния геном в допълнение към протеините, които изграждат капсида. Те не са част от организацията на крайния капсид. Тези неструктурни протеини са необходими, за да се осъществи вирусната репликация в клетката гостоприемник [60].
Размерът на вируса често е пропорционален на размера на генома. Вирусният геном, от друга страна, допринася значително по-малко за общата маса на вириона, отколкото капсидните протеини. В резултат на това многобройни копия на капсидния протеин трябва да бъдат свързани заедно, за да направят капсида(ите). Количеството генетична информация, необходимо в такова сглобяване с повтарящи се субединици, е значително намалено. При някои вируси единичен генен продукт участва в развитието на капсида, но при по-сложните вируси участват множество генни продукти [60].
Четири структурни протеина, нуклеокапсиден (N) протеин, мембранен (M) протеин, шипчест (S) протеин и обвиващ (E) протеин, са кодирани от генома на коронавируса, както и няколко неструктурни протеина (25 nsp) (Фиг. 2). Капсидът съдържа N-протеин, който е прикрепен към единичната положителна верига на РНК на вируса и му позволява да заразява човешки клетки и да ги превръща във вирусни фабрики. N протеинът покрива генома на вирусната РНК и е необходим за репликация и транскрипция. Вирусната репликация и транскрипция се обработват от N-края на N протеина, който се свързва с геномни и субгеномни РНК [5].

Фигура 2. Вирусни повърхностни протеини (шип, обвивка и мембрана), вградени в липиден двоен слой [3].

М-протеинът е най-разпространен на вирусната повърхност и се смята, че е основният организатор на коронавируса. S-протеинът е включен в повърхността на вируса и улеснява навлизането на вируса в клетката – гостоприемник. Този белтък медиира както прикрепването на вируса към повърхностните рецептори на клетката гостоприемник, така и мембранното сливане между мембраните на вируса и клетката гостоприемник [29]. Е-протеинът е малък мембранен протеин с 76-109 аминокиселини, който е второстепенен компонент на вирусната частица. Той участва в сглобяването на вируса, контролира пропускливостта на мембраната на клетката гостоприемник при контакта вирус-клетка гостоприемник. [25]. При някои вируси външно е разположена липидна обвивка. Такъв двоен липиден слой заобикаля шипа, обвивката и мембраната на коронавирусните вирусни повърхностни протеини. Също така, на повърхността на вируса е открит димерен белтък – хемаглутинин-естераза (HE). Този протеин може да има роля при навлизането на вируса; не е от съществено значение за репликацията на вируса, но изглежда, че е важен за естествената инфекция на клетката гостоприемник [35]. Първичните антигенни епитопи, по-специално тези, идентифицирани от неутрализиращи антитела, се носят от гликопротеините на обвивката, които са отговорни за прикрепването към клетката гостоприемник. Пълната структура на шиповия (S) протеин в затворено и отворено (префузионно) състояние е определена чрез крио-ЕМ изследвания. [62] [68]. Този гликопротеин се състои от три идентични вериги, всяка с 1273 аминокиселини. Също така са установени две добре дефинирани области: S1 и S2 субединици, които участват съответно в клетъчното разпознаване и сливането на мембраната. Последният процес възниква в резултат на няколко протеинови структурни промени, които понастоящем са неизвестни.

1.4.3. Механизъм на действие на вирусите

Вирусите се възпроизвеждат в клетките гостоприемници и процесът се състои от шест стъпки: прикрепване, проникване, премахване на обвивката, репликация, сглобяване и освобождаване [41]. Вирусите се прикрепят към специфично рецепторно място от мембраната на клетката гостоприемник, използвайки протеините на прикрепване в капсида или гликопротеини, вградени във вирусната обвивка. Клетките гостоприемници, които могат да бъдат заразени от определен вирус, се определят от тази специфичност на взаимодействието. По принцип само нуклеиновата киселина на бактериофагите прониква в клетката гостоприемник, оставяйки капсида отвън. Животинските и растителните вируси могат да проникнат в клетките чрез ендоцитоза, при която вирусът е напълно обвит и абсорбиран от клетъчните мембрани. Вирусите с обвивка ще навлязат в клетките-гостоприемници, когато вирусната обвивка се слее директно с клетъчните мембрани. Вирусният капсид се разрушава в клетките на гостоприемника, освобождавайки вирусната нуклеинова киселина, която след това е достъпна за възпроизвеждане и транскрипция. Вирусният геном определя механизма на репликация. ДНК вирусите обикновено използват ензимите и белтъците на клетката гостоприемник, за да произведат повече ДНК, която след това се транскрибира в информационна РНК (mRNA) и се използва за директен протеинов синтез. Ядрената РНК обикновено се използва от РНК-овите вируси като матрица за синтеза на вирусна геномна РНК и иРНК. Освобождаването на нови вириони, създадени в клетките- гостоприемници, е последният етап от вирусната репликация, което позволява инфекцията на съседни клетки и продължаване на циклите на самовъзпроизвеждане. Цикълът на вирусна репликация може да накара клетките гостоприемници да претърпят значителни структурни и метаболитни промени, както и да им навредят [70].

Фигура 3 изобразява механизма на навлизане на SARS-CoV-2, репликация и опаковане на РНК в човешката клетка. Шиповият (S) протеин на коронавируса се свързва с рецепторите на ангиотензин конвертиращия ензим 2 (ACE2) на повърхността на множество човешки клетки, включително и тези в белите дробове, улеснявайки навлизането на вируса. Протеазите на гостоприемника (трипсин и фурин) разцепват коронавирусния S протеин на две места на границата между двете субединицата S1/S2 (сайт S1/S2). Активният пептид, участващ в мембранното сливане, се освобождава, след като S2 домейнът (S2′ място) се разцепи. В резултат на това събитие се активира механизма за сливане с мембраната. Ендоцитозата е процесът, чрез който човешката клетка поглъща вируса. Предполага се, че SARS-CoV-2 използва уникален тристепенен метод за мембранно сливане, след като навлезе в цитоплазмата, включващ рецепторно свързване и индуцирани конформационни промени в Spike (S) гликопротеина, последван от протеолиза на катепсин L от вътреклетъчни протеази и по-нататъшно активиране на механизма на мембранно сливане в ендозоми [53]. След това ендозомата се отваря, освобождавайки вируса в цитоплазмата. Вирусният нуклеокапсид (N) е съблича от протеазоми, които могат да хидролизират ендогенни протеини, но могат също така да разграждат външни протеини като нуклеокапсидния протеин на SARS [64]. Предложен е нов двуетапен механизъм, при който вирионът се прикрепя към рецептор на повърхността на целевата клетка-гостоприемник чрез своята S1 субединица, шипът се разцепва от протеази на гостоприемника и след това се очаква вирусната и целевата мембрана на гостоприемника да се слеят при ниско pH чрез субединицата S2 [26, 34]. Накрая, вирусният генетичен материал, който е едноверижна РНК, се освобождава в цитоплазмата в своята цялост. Протичат процесите на репликация и транскрипция, които се медиират от комплекса за репликация/транскрипция (RTC). Този комплекс е изграден от неструктурни протеини и е кодиран във вирусния геном (nsp). Предполага се, че RTC е произвел двойномембранни структури в цитоплазмата на заразената клетка [59]. След това отворената рамка на четене 1a/b (ORF 1a/b) от положителния РНК геном, се транслира, за да генерира репликазни протеини. Тези протеини използват генома като шаблон за генериране на отрицателни РНК-и в пълна дължина, които след това се използват за генериране на допълнителни геноми. M, S и E структурните вирусни протеини се синтезират в цитоплазмата, вмъкват се в ендоплазмения ретикулум (ER) и се прехвърлят в междинното отделение на ендоплазмен ретикулум – апарат на Голджи (Фигура 3). (ERGIC) [38]. В допълнение, нуклеокапсидите се образуват в цитоплазмата чрез капсулиране на репликираните геноми от N протеин и в резултат на това те се сливат в ERGIC мембраната, за да се сглобят в нови вириони. Най-накрая новите вириони се изнасят от заразените клетки чрез транспортирането им до клетъчната мембрана във везикули с гладки стени и след това ги секретират чрез процес, известен като екзоцитоза, за да заразят други клетки. Междувременно стресът от вирусното производство върху ендоплазмения ретикулум води до клетъчна смърт.

Фигура 3. Схематична диаграма на механизма на навлизане на SARS-CoV-2, репликация и опаковане на вирусна РНК в човешката клетка[5].

2. Функционални наночастици

2.1. Какво представляват наночастиците?

Наночастицата, според Международната организация по стандартизация (ISO), е частица с размер между 1 и 100 нанометра [6]. Наночастиците, които са невидими за човешкото око, могат да имат коренно различни физични и химични свойства от техните по-големи материални двойници. Когато размерът на веществото се доближи до атомния мащаб, неговите свойства се променят. Това се дължи на увеличаване на съотношението повърхностност/обем, което кара повърхностните атоми да доминират в работата на материала. В сравнение с насипни материали като прахове, плочи и листове, наночастиците имат относително голямо съотношение повърхност/обем поради изключително малкия си размер. Когато наночастиците са достатъчно малки, за да ограничат своите електрони и да предизвикат квантови ефекти, те могат да имат неочаквани оптични, физически и химични способности. Металните наночастици се различават от насипните метали по отношение на своите физични и химични свойства (напр. по-ниски температури на топене, големи специфични повърхностни площи, специфични оптични свойства, механични якости и намагнитвания), които могат да бъдат полезни в различни промишлени приложения. Медта, например, се счита за мек материал, тъй като нейните атоми се групират в скала от 50 nm, което води до огъване на насипната мед. В резултат на това медните наночастици, по-малки от 50 nm, се класифицират като много твърд материал, със значително различна ковкост и пластичност от насипната мед. Златните наночастици се топят при значително по-ниски температури (300 °C за размер от 2,5 nm) от насипното злато (1064 °C).

През последните три десетилетия дейността по темата за нанотехнологиите се е увеличила с експоненциална скорост, превръщайки я в основна интердисциплинарна изследователска тема. Интегрирането на нанотехнологиите в областта на медицинската наука доведе до този възход до голяма степен, тъй като наноструктурираните материали имат различни биологични ефекти.

Наноматериалите се използват по различни начини в здравната индустрия, един от които е доставянето на лекарства.

Фигура 4. Биомедицински приложения на наночастиците [21].

Един пример за тази техника е разработването на наночастици за подпомагане доставянето на химиотерапевтични лечения директно към ракови образувания, както и за доставяне на лекарства до увредени области на артериите за борба със сърдечно-съдовите заболявания. Въглеродните нанотръби също се разработват за приложение в процеси за създаване на бактериални сензори чрез добавяне на антитела към нанотръбите.

Наночастиците се очертаха като интересни кандидати за оптимизирана терапия при персонализираната медицина поради техните уникални качества, като огромна повърхност, структурни свойства и удължена продължителност на циркулацията в кръвта в сравнение с малките молекули. Способността да се преобразуват неблагоприятните физикохимични свойства на биоактивни молекули в желани биофармакологични профили, да се подобри доставката на терапевтични агенти през биологични бариери и отделения, да се контролира освобождаването на биоактивни агенти, да се подобри терапевтичната ефикасност чрез селективно доставяне на лекарства към биологични мишени и да се изпълняват целеви терапевтични функции чрез комбиниране на мултимодални йонни канали са потенциални предимства на конструираните терапевтични наночастици [57].

Редица наноматериали и наночастици в момента се проучват в клинични изпитвания или вече са одобрени за употреба при хора от Американската администрация по храните и лекарствата (FDA). Много проучвания за доказване на концепцията на наночастиците в клетъчни култури и модели на малки животни за медицински приложения, също са в ход.

Разработването на антивирусни лекарства е от решаващо значение за ограничаване на разпространението на болести и минимизиране на загубите. Наскоро беше установено, че много функционални наночастици, като квантови точки, златни и сребърни наночастици, графенов оксид, нанокластери, силициеви материали, въглеродни точки, полимери и дендримери, имат впечатляващи антивирусни свойства. Тези функционални материали, базирани на наночастици, предлагат уникални качества като възможни антивирусни кандидати, като се имат предвид техните различия в антивирусния механизъм и инхибиторната ефикасност. SARS-CoV-2 е вирус, обвит в шипов протеин с диаметър 60–140 nm, който е със свойства подобни на частици. Поради структурните си прилики, синтетичните наночастици могат много да наподобяват вируса и да взаимодействат агресивно с неговите патогенни протеини. Антивирусните наноматериали, като наночастиците от цинков оксид, имат форма на тетрапод, която имитира клетъчната повърхност, когато се захващат с вирусния капсид. Благодарение на фотокаталитична реакция, той инхибира вирусните протеини, когато е изложен на UV радиация [57].

2.2. Функционални наночастици като антивирусни средства

Всички направления на вирусните изследвания са повлияни от нанотехнологиите. Нанотехнологията демонстрира мощен потенциал за решаване на този проблем наред с други антивирусни техники и се съобщава, че разработването на наночастици има изключителна ефективност срещу вирусната инфекция и възпроизвеждането на вируси. Първо, сонди, базирани на нанотехнологии, са широко използвани при откриването на вируси, което води до разработването на различни биосензори и биоелектроника, базирани на уникални функционални наночастици [12, 16]. Второ, създадени са няколко наноматериали, използващи вириони и вирусоподобни частици като шаблони, подчертавайки значението на биосъвместимостта и биосинтетичните методи в съвременните биохимични изследвания [31, 35]. Трето, значителни усилия са положени в производството на флуоресцентни нанопроби и тяхното използване при изучаване на молекулярните механизми на клетки, заразени с вирус [42, 74]. И накрая, нарастващ брой функционализирани наночастици са идентифицирани като високоефективни инхибитори на вирусния растеж [67].

2.3. Антивирусната активност на функционалните наночастици

Прикрепването, проникването, репликацията и размножаването са основните стъпки в инфекциозния процес на вируса и антивирусните функционални наночастици са предназначени да инхибират вирусите чрез инхибиране или намаляване на някои от тези стъпки. В този раздел ще класифицираме различните механизми на наночастиците въз основа на тяхната антивирусна ефикасност. Инактивирането на вирусите е най-прекият начин за тяхното инхибиране и някои наноструктури могат да взаимодействат с вирусите, да променят структурата на капсидния им протеин и впоследствие драстично да намалят вирулентността, което може да бъде свързано както с физически, така и с химични механизми за намаляване на активната вирусна популация. Повечето вирусни инфекции започват с прикрепването на клетките гостоприемници, което обикновено се постига чрез свързване към целевия акцепторен протеин. Клетките гостоприемници ще бъдат свободни от инфекция, ако наночастиците могат ефективно да предотвратят адхезията. Екипът на Stellacci е разработил серия от антивирусни наночастици с дълги и гъвкави линкери, които имитират хепаран сулфат протеогликани, които са консервативна таргетна цел за вирусните прикрепващи лиганди (VAL). Тези лиганди могат да постигнат ефективна вирусна превенция посредством свързване с вирусите [8]. Тези частици не са цитотоксични и имат наномоларна необратима активност срещу вируса на херпес симплекс, човешкия папиломен вирус, респираторния синцитиален вирус и денга вируса in vitro. В резултат на това функционалните наночастици могат да се използват като широкоспектърно антивирусно лекарство за предотвратяване на прикрепването на вируса, първата стъпка в процеса на инфекция. Вторият метод за потискане на вируса е да се предотврати проникването и навлизането на вирусите в клетките на гостоприемника чрез промяна на клетъчната мембрана и белтъчната архитектура. Haag и неговите колеги създават редица водоразтворими фулерен-полиглицерол сулфати (FPS) с различни тегловни съотношения на фулерен и полимери, които представляват различно разклонен полиглицерол сулфат [19].

Таблица 1. Характерни антивирусни механизми на действие на наноматериалите [16].

Наноматериал	Вирус	Механизъм
Графенов оксид	Респираторен синцитиален вирус	Директно инактивира вируса и инхибира прикрепването
Наногел	PRRSV	Закрепва щита и контролира проникването
Сребърна наночастица	Херпес вирус	Повлияват прикрепването на вируса
Графенов оксид	Херпес вирус	Инхибира прикрепването
Златни наночастици	Херпес вирус	Предотвратява прикрепването и проникването на вируси
Нано-въглерод	Херпес вирус	Възпрепятства навлизането на вируса на ранен етап
Силиконови наночастици	Инфлуенца A	Намалява количеството на потомството на вируса
Ag2S наноклъстери	Корона вирус	Блокира синтезата и размножаването на вирусна РНК
Gd2O3:Tb3+/Er3+ наночастициs	Зика вирус	Като антигенни микроносители за Zk2 пептид на зика вируса
Наночастици от меден оксид	Herpes simplex вирус тип 1	Окислява вирусни протеини и разгражда вирусен геном
NiO наноструктури	Вирус на краставичната мозайка	Увеличава експресията на гените pod, pr1 и pal1
Циркониеви наночастици	H5N1 инфлуенца вирус	Насърчава експресията на цитокини
Наночастици от цинков оксид	H1N1 инфлуенца вирус	Инхибира вируса само след навлизане на вируса в клетките гостоприемници

Фулерен-полиглицерол сулфатите (FPS), които съчетават полианионни разклонения с променливо разтворимо хидрофобно ядро, превъзхождат аналозите, които имат само едно от тези свойства при блокиране на гликопротеиновия контакт с обвивката на вируса на везикулозен стоматит в бъбречни клетки на хамстер. В резултат на това се настъпва блокиране на контакта между вирусите и клетките – гостоприемници, което е добър подход за предпазване от вирусни инфекции. В случай на навлизане на вирус в клетката, третата успешна техника за блокиране на вируса е да се унищожи неговата репликация, което обикновено се постига чрез намаляване на експресията на определени ензими, които преди това са подпомагали завършването на вирусната ДНК или РНК репликация. Крайната стратегия е да се инхибира размножаването на вируса и да се отдели от клетките гостоприемници. Потомството на вируса може да бъде по-вирулентно от неговата майка и ако функционални наночастици възпрепятстват размножаването на вируса и драстично ограничат броя на вирусите-потомци, вирулентността ще бъде значително намалена. Таблица 1 показва някои от най-често срещаните антивирусни механизми за функционални наночастици.

3. Наночастици на основата на вируси (VNPs)

Пресечната точка между вирусните частици и функционалните наноматериали е създаването нананочастици базираните на вируси (VNP). Сглобяването по шаблон на милиони идентични наночастици и създаването им в живите клетки е възможно с бионаноматериали, базирани на вируси. Вирусите, които заразяват бактерии, хора и растения са използвани за създаване на наночастици базирани на вируси (VNP). Вирусите са отлична матрица, тъй като те са еволюирали така че да разпределят нуклеиновите киселини по естествен път и по този начин могат да бъдат манипулирани, за да доставят други съединения като терапевтични средства и реагенти за образна диагностика. И накрая, вирусите имат висока скорост на репликация, което позволява масовото производство на VNPs на ниска цена.

VNPs са изградени от правилни масиви от белтъци на вирусната обвивка с добре дефинирана триизмерна структура, което ги прави по-добро инженерно скеле от произведените частици. Структурата на VNPs също може да бъде променена чрез модифициране на матрицата на нуклеинова киселина, която кодира вирусните протеини, преди да се синтезира, както и чрез химическо декориране чрез добавяне на конюгати към определени странични вериги на аминокиселините. VNPs са известни със своята биосъвместимост, биоразградимост, способност за преодоляване на биологичните бариери и ефективно разпределение на товара към целевите клетки, тъй като те са съставени предимно от белтъци. Вирусите са еволюирали в посока да се свързват със специфични клетъчни белтъци, да транспортират товара от нуклеинови киселини и да „отвличат“ вътреклетъчни машини, за да произвеждат потомствени вирусни компоненти. Тези характеристики са довели до разработването на VNPs на базата на вируси на бозайници за използване в генната терапия, но е трудно да се изключат вредни ефекти, произтичащи от нормалните взаимодействия между вирус и гостоприемник [24]. VNPs, базирани на бактериофаги и растителни вируси, от друга страна, се считат за безвредни, тъй като дори напълно функционални вируси не могат да заразят хората. В резултат на това по-голямата част от тази лекция ще бъде посветена на медицинските приложения на VNPs, получени от бактериофаги и растителни вируси.

Бактериофагите и растителните вируси са нуклеопротеинови съвкупности, при които нуклеиновите киселини са здраво обвити в капсид, съставен от много копия на едни и същи белтъци. Капсидите често са икосаедрични (приблизително сферични), твърди тръби или гъвкави нишки, като последните две категории имат високо съотношение. Растителните вируси и бактериофагите, за разлика от много вируси при бозайниците, обикновено не са обвити от крехка липидна мембрана, тъй като трябва да понасят по-тежки условия на околната среда, за да заразят успешно своите гостоприемници. Естествената функция на вирусния капсид е да защитава вирусната ДНК срещу нуклеази и други физически заплахи. По този начин белтъците на вирусната обвивка са химически и физически стабилни, което е благоприятно за развитието на VNPs, тъй като това означава, че те имат дълъг живот на съхранение и могат да издържат на химическите обработки, необходими за конюгиране с целеви лиганди или натоварване с полезни товари като лекарства, флуорофори или контрастни вещества [55].

3.1. Стратегии за модификации на VNPs

Генното инженерство, капсулирането, биоминерализацията, инжектирането и биоконюгацията са някои от подходите, които могат да се използват за проектиране и промяна на продукти, базирани на вируси. Фундаменталната структура на протеиновата обвивка може да бъде променена чрез генно инженерство посредством вмъкване, делеция или размяна на специфични аминокиселинни остатъци [43]. Такива модификации улесняват функционализирането или промяната на цялостните физикохимични характеристики на VNPs [20, 58]. Таговете за пречистване/имунооткриване, епитопните последователности (за да се направи VNP ваксина) и таргетните последователности (за да се направи VNP насочен към специфични рецептори), са примери за такива промени [71]. Използвайки сравними рекомбинантни експресионни технологии, също е възможно да се включат неестествени аминокиселини като уникални връзки за последващи химични реакции [56].

При физиологични условия белтъците на вирусната обвивка се самосглобяват около нуклеиновите киселини и това свойство (което споделят VNP) може да се използва за разглобяване на VNPs и повторното им сглобяване в по-желани конфигурации около други товарни молекули. Два основни принципа могат да се използват за задействане на капсулиране на товара: (а) повърхностен заряд и електростатични взаимодействия или (б) уникални свързващи взаимодействия, които възникват по време на самосглобяване [18]. Например, операторният белтък за транслационна репресия (TR) се намира в бактериофаг MS2 и се свързва с TR RNA стволовата верига. Химически модифицираните TR операторни белтъци могат да транспортират малки терапевтични молекули. Когато неповредените MS2 частици се комбинират с модифицирани TR оператори, последните дифундират във VNPs и се свързват с капсида по стабилен начин. Тези дизайнерски техники са използвани за успешно вмъкване на терапевтични съединения като например веригата на рицин А и 5-флуороуридин в MS2 частици. Транспортирането на полезен товар и успешното убиване на целевите клетки са демонстрирани in vitro клетъчни изследвания, използващи тази техника [7, 69].

Биоминерализацията е отлагане на минерали в и около клетките и тъканите на живи организми, но е свързано със способността на белтъците на вирусната обвивка да се образуват около минерално ядро или нуклеарна минерализация в условията на VNPs. Биоминерализацията на VNPs има различни приложения в енергийните изследвания, но има и примери в медицината, особено когато минералните товари се използват като контрастни вещества [44].

Някои материали могат да бъдат капсулирани чрез стимулиране на образуването на капсиди около товар, докато други могат да дифундират през вирусната частица и да бъдат „убедени“ да останат във вътрешната кухина чрез нековалентни взаимодействия с нуклеиновите киселини или с вътрешно проектирани странични вериги на аминокиселини , или биоконюгацията може да ги свърже трайно с лигандите. [65]. Този метод е използван за зареждане на флуоресцентни багрила за оптични изображения, Gd3+ йони за MRI и малки лекарствени съединения [46, 72].

Използването на методите на класическата химия за функционализиране на специфични странични вериги на аминокиселини, като карбоксилатните групи в остатъци от глутаминова и аспарагинова киселина, реактивните амини в лизинови остатъци, сулфхидрилните групи в цистеинови остатъци и фенолните групи в тирозинови остатъци, е един от най-мощните подходи. за модификация на VNPs. Тези групи могат да бъдат директно прикрепени към специфични молекули или променени, за да включват функционални групи за по-сложни процедури на конюгация.

3.2. Наночастици на базата на вируси в терапевтични интервенции

Бактериофагите и растителните вируси имат способността да проникват в клетките на бозайниците и да се реплицират без допълнително възпроизвеждане, което ги прави полезни терапевтични инструменти. Базираните на вируси наноматериали могат да бъдат проектирани да се насочват към специфични клетки, като раковите клетки и клетки на имунната система. Те могат да се използват за ваксинации, тъй като могат да изложат антигени на имунната система. Имунотерапията и имуно/химио комбинираните терапии могат да се възползват от взаимодействията на VNPs с имунната система, за разлика от образната диагностика и доставянето на лекарства. В резултат на това са измислени многобройни начини за защита на VNPs от имунната система, докато се насочват към специфични клетки-мишени. Клирънсът на VNP чрез мононуклеарната фагоцитна система може да бъде заобиколен чрез модифициране на повърхностния химичен състав или формата на частиците [54]. Повърхностното полиетиленгликиране, например, може да намали неспецифичните взаимодействия между VNP и макрофагите, което им позволява да циркулират по-дълго [31]. Генетичното или химическо добавяне на съединения, които се свързват с рецептори, силно експресирани върху специфични видове клетки, като ракови клетки, може да се използва за насочване към тях. Формата, размерът и аспектното съотношение на VNP също могат да повлияят на тъканната специфичност, така че това са допълнителни свойства, които трябва да се вземат предвид по време на етапа на проектиране. По-специално, тубулните или нишковидните VNPs могат да проявяват in vivo характеристики, по-добри от сферичните VNPs, като повишен поток и маргинализация към артериалната стена и намален клирънс от мононуклеарната фагоцитна система, което води до подобрено насочване към тумора и насочване към тромби [52, 66]. Структурите на VNP могат да се използват за изследване на въздействието на размера и формата на VNP върху ефективността на лекарства и изображения, тъй като те са монодиспергиращи и могат да бъдат модифицирани с фин и повтарящ се пространствен контрол.

3.3. Доставка на лекарства с VNPs

Разработването на VNPs, които са насочени към специфични типове клетки, позволи добавянето на токсични, но полезни товари чрез конюгация, инфузия и/или капсулиране, което води до смъртта на целевите клетки, позволявайки селективно елиминиране на ракови клетки или други болни клетки без изключване на целеви ефекти. Конюгацията, както накратко беше обсъдено по-горе, включва селективно ковалентно добавяне на молекули като полезен товар към специфични аминокиселинни остатъци на белтъците от обвивката. Инфузията се осъществява чрез инкубиране на непокътнатия VNP в разтвор, съдържащ товара, докато капсулирането налага сглобяването на вектора около полезния товар [9]. Вече са разработени технологии за доставяне на гени и къси интерфериращи РНК-и, фотоактивни молекули, които поддържат фотодинамична терапия, конвенционални лекарства с малка молекула и дори хетероложни вирусни геноми за генна терапия, като алфавирусен геном, капсулиран във VNP, базиран на CCMV [4, 17].

Токсичните товари могат да бъдат заредени преференциално в кухината на VNP, вместо да покриват външната повърхност, което ги предпазват от ензимно и химическо разграждане in vivo и така избягват взаимодействия с нецелеви клетки. Капацитетът и ефективността на зареждане на VNP обикновено се подобряват чрез изхвърляне на естествения вирусен геном, което може да се постигне чрез експресиране на белтъците от обвивката в плазмид (за VNP на бактериофаг) или трансген (за VNP на растения), така че вирусната нуклеинова киселина никога не присъства. Получената празна частица се нарича вирусоподобна частица (VLP). Вирусният геном може също да бъде отстранен чрез селективно химично или ензимно разграждане.

Ковалентното прикрепване на вредни товарни молекули към вътрешно експонирани странични вериги предотвратява ранното им освобождаване, докато нековалентните методи обикновено позволяват по-висока ефективност на натоварване, тъй като има повече пространство в рамките на VNP за повече товар, ако се използва цялата кухина, а не само вътрешната повърхност. Полимеризацията може да осигури най-доброто от двата подхода чрез образуване на разклонена мрежа от функционализирани групи за прикрепване на полезен товар, която се простира от външната повърхност на VNP или прониква във вътрешността му [28, 45]. Въпреки че повечето изследвания са фокусирани върху дизайна на VNP и in vitro токсичността, предклиничните тестове на VNP-базиран носител за доставяне на лекарства показаха in vivo ефикасността и намалена кардиотоксичността на вирусо-подобни частици, заредени с доксорубицин, особено получени от вируса на краставичната мозайка (CMV), модифициран с фолиева киселина [73].

VNP могат да са заредени с фотосенсибилизатори за приложения във фотодинамичната терапия, в допълнение към стандартната химиотерапия. VLP, базиран на бактериофаг Q, например, е зареден с производно на металопорфирин за фотодинамична терапия и места за свързване на гликан, насочени към клетки с CD22 рецептор [48]. Освен това, като първа демонстрация на тераностични VNPs, мултифункционален MRI контраст и фотодинамичен терапевтичен агент (хелатиран Gd3+ и Zn2+ фталоцианин) беше успешно капсулиран в CCMV [38]. Освен това са изследвани хибридни VNP-базирани материали, съдържащи метални наночастици за фототермична терапия [22].

3.4. Имунизация и имунотерапия, базирани на вирусни структури

Базираните на вируси наноматериали имат повтарящи се белтъчни структури, които предизвикват имунни отговори . Това ги прави полезни за разработването на ваксини и имуномодулатори. Базираните на вирусни частици ваксини се класифицират в четири типа: (а) химически инактивирани вирусни ваксини, (б) атенюирани вирусни ваксини с ниска вирулентност, (в) безгеномни и неинфекциозни VLPs и (г) химерни ваксини и ваксини с наночастици, където епитопите, получени от патогени, са представени върху неинфекциозен носител като растителен вирус, бактериофаг или химически синтезирана платформа [23]. Ваксините с частици, като VLP и други ваксини с наночастици, имат няколко предимства пред ДНК ваксините и субединичните ваксини [2, 30]. Базираният на вируса носител осигурява стабилност на антигена, транспортира множество копия на антигена (многовалентно представяне) и има способността да представя два или повече различни антигена. Формулировката насърчава пасивно или активно усвояване от антиген-представените клетки, което е последвано от активиране и зареждане на подходящите Т и В клетъчни отговори [33].

3.4.1. Ваксини за инфекциозни болести

VLP ваксините имат голям успех срещу вирусните заболявания, особено когато структурата на неинфекциозната формула на ваксината много наподобява тази на естествения вирус (те се наричат нативни VLPs) [47)]. Първият успешен пример е ваксината срещу вируса на хепатит B (HBV). Той е намалил значително HBV инфекциите сред имунизираните популации. Ваксините срещу човешкия папиломен вирус (HPV) предизвикват имунитет срещу вируса, който от своя страна предпазва от HPV-индуциран цервикален карцином и потенциално други HPV-индуцирани видове рак [49].

Химерните VLP експресират хетероложни антигени и могат да генерират антипатогенни и неутрализиращи антитела, което предполага, че имунизацията може да осигури защита срещу заразяване с патогени. Проведени са много изследвания върху химерни VLP, базирани на растителни вируси, бактериофаги, вируси на насекоми и животински полиомавируси и папиломавируси [49]. Химерите също са създадени върху естествени платформи на ваксина (напр. HBV и HPV) и тези платформи са разширени чрез показване на допълнителни хетероложни епитопи. Тези нативни химерни VLP използват основа на ваксина, която е одобрена от FDA.

Вирусът Flock House (FHV), който заразява насекоми, е използван за създаване на химерни VLP със сложни антигенни структури. Тази мултивалентна система е модифицирана за да включва фрагменти от рецептора на антраксния токсин (ANTXR2), който служи като скеле за показване на защитния антиген на Bacillus anthracis. В отсъствието на адювант комплексът вирус-антиген активира защитни имунни отговори след единична доза [37]. Допълнителни механизми за химично свързване на многовалентни антигени индуцират имунни отговори по подобен ефективен начин. Системата FHV има способността да приема белтъчни и пептидни вмъквания в различни места на повърхността на капсида, както и наличието на подробна структурна и генетична информация, която позволява прецизно поставяне и подреждане на антигенен домейн. Например, грипният хемаглутинин (НА) протеин е основен антиген за всички щамове на грип, но поради антигенна вариация е трудно да се развият широко неутрализиращи имунни отговори. Има някои силно консервативни области на протеина, но те са трудни за разглеждане в структурен контекст, което би позволило инициирането на специфични и неутрализиращи реакции на антитела. Индукцията на тези антитела се активира чрез показване на запазените региони на НА в тримерна подредба върху FHV. Полезността и обхватът на нативните и химерните VLPs приложения на ваксини се разширяват. Комбинацията от биоинженерни VLP ваксини и прилагането им в дихателните пътища, например, наскоро беше демонстрирана като основна стратегия за бъдещо разработване на ваксини и имунотерапия [50].

3.4.2. Ваксини против рак

Противотуморната ваксинация има няколко предимства пред химиотерапията, включително по-малко странични ефекти, избягване на лекарствена резистентност, подготовка на имунната система да елиминира остатъчните резистентни на лекарства клетки и индуциране на дългосрочна имунологична памет за защита срещу метастази и рецидив.

Оценени са няколко базирани на VNP стратегии за ваксина срещу рак, включително шаблонно показване на свързани с тумора въглехидрати или пептидни антигени. Tn-специфичните антитела се произвеждат с високи титри след конюгиране към базираното на вируса скеле и многовалентен дисплей. По подобен начин, антиген-специфични IgG и IgM отговори могат да бъдат предизвикани от Tn антиген, конюгиран с TMV. Представянето на ракови епитопи върху базирани на вируси скелета позволява тези собствени епитопи да бъдат представени в неприродна молекулярна среда, което е обещаваща стратегия за преодоляване на автотолерантността.

3.4.3. Ваксини за неврологични заболявания и зависимости

VLP са използвани като наноструктури за показване на амилоидния бета (A) протеин, който е свързан с прогресирането на болестта на Алцхаймер. В отсъствието на адювант папиломавирусът и Q VLPs, съдържащи А антигени, предизвикват анти-А антитела с ограничен Т-клетъчен отговор. Подкласовете на антителата се различават в зависимост от това дали се използва целият антиген или пептидните антигени [13].

Наскоро беше разработена потенциална ваксина срещу пристрастяване към никотина, като се използва 30-nm икосаедричен капсид на бактериофаг Q, който е химически модифициран, за да показва никотина по многовалентен начин. Мултивалентната природа на базираната на Q нановаксина стимулира производството на антиникотин неутрализиращи антитела, понижавайки нивата на никотин в кръвта и ограничавайки транспорта през кръвно-мозъчната бариера.

---

Тест LO 1.1

---

Литература

1. Alimardani V., Abolmaali S. and Tamaddon A. (2021). Recent Advances on Nanotechnology-Based Strategies for Prevention, Diagnosis, and Treatment of Coronavirus Infections. Hindawi J of Nanomaterials, Article ID 9495126, 1-20.
2. Awate S., Babiuk L and Mutwiri G. (2013). Mechanisms of action of adjuvants. Front Immunol, 4, 114.
3. Aydogdu M., Altun E., Chung E., Ren G., Homer-Vanniasinkam S., Chen B and Edirisinghe M. (2021). Surface interactions and viability of coronaviruses. J. R. Soc. Interface, 18, 20200798.
4. Azizgolshani O., Garmann R., Cadena-Nava R., Knobler C and Gelbart W. (2013). Reconstituted plant viral capsids can release genes to mammalian cells.Virology, 441, 12–17.
5. Boopathi, PomaA and Kolandaivel P. (2020). Novel 2019 coronavirus structure, mechanism of action, antiviral drug promises and rule out against its treatment. J Biomol Struct Dyn,39, 9, 1-10.
6. British Standards Institution. (2007). Terminology for Nanomaterials, Publicly Available Specification BS PAS 136, British Standards Institution, London.
7. Brown W., Mastico R., Wu M, Heal K and Adams C. (2002). RNA bacteriophage capsid-mediated drug delivery and epitope presentation. Intervirology, 45, 371–380.
8. Cagno V., Andreozzi P., Alicarnasso M., Silva P., Mueller M., Galloux M., Goffic R., et al. (2018). Broad-spectrum non-toxic antiviral nanoparticles with a virucidal inhibition mechanism. Nature Mater, 17, 195–205.
9. Cao J., Guenther R., Sit T., Opperman C., Lommel S and Willoughby J. (2014). Loading and release mechanism of Red clover necrotic mosaic virus derived plant viral nanoparticles for drug delivery of doxorubicin. Small, 10, 5126–5136.
10. Carter J. and Saunders.V. (2007). Virology. Principales and applications, John Wiley & Sons Ltd, The Atrium, Southern Gate, Chichester,West Sussex PO19 8SQ, England.
11. Cascella M., Rajnik M., Cuomo A., Dulebohn S abd Di Napoli R. (2021). Features, evaluation and treatment coronavirus (COVID-19),” in Statpearls, StatPearls Publishing.
12. Caygill R., Blair G and Millner P. (2010). A review on viral biosensors to detect human pathogens. Anal. Chim. Acta, 681, 8–15.
13. Chackerian B. (2010). Virus-like particle based vaccines for Alzheimer disease. Hum Vaccines, 6, 926–930.
14. Chan J., Kok K., Zhu Z., Chu H., To K., Yuan S and Yuen K. (2020) Genomic characterization of the 2019 novel human-pathogenic coronavirus isolated from a patient with atypical pneumonia after visiting Wuhan. Emerg Microbes Infect, 9(1), 221-236.
15. Chan J., To K., Tse H., Jin D and Yuen K. (2013). Interspecies transmission and emergence of novel viruses: lessons from bats and birds. Trends Microbiol, 21(10), 544-55.
16. Chen L., Zhang X., Zhou G., Xiang X., Ji X., Zheng Z., He Z. and Wang H. (2012). Simultaneous determination of human enterovirus 71 and coxsackievirus B3 by dual-color quantum dots and homogeneous immunoassay. Anal. Chem, 84, 3200–3207.
17. Choi K., Kim K., Kwon I., Kim I. and Ahn H. (2012). Systemic delivery of siRNA by chimeric capsid protein: tumor targeting and RNAi activity in vivo. Mol Pharm, 10, 18–25.
18. Daniel M., Tsvetkova I., Quinkert Z., Murali A. and De M, (2010). Role of surface charge density in nanoparticle-templated assembly of bromovirus protein cages. ACS Nano,3853–3860.
19. Donskyi L., Druke M., Silberreis K., Lauster D., Ludwig K., Kuhne C., Unger W., et al. (2018). Interactions of fullerene-polyglycerol sulfates at viral and cellular interfaces. Small, 14, 1800189.
20. Douglas T., Strable E and Willits D. (2002). Protein engineering of a viral cage for constrained material synthesis. Adv Mater, 14, 415–418.
21. Estelrich J., Quesada-Pérez M., Forcada J. and Callejas-Fernández J., (2014) Introductory Aspects of Soft Nanoparticles, in Soft Nanoparticles for Biomedical Applications, Nanosciences & Nanothechnology Series, Chapter 1, pp. 1-18.
22. Everts M., Saini V., Leddon J., Kok R and Stoff-Khalili M. (2006). Covalently linked Au nanoparticles to a viral vector: potential for combined photothermal and gene cancer therapy. Nano Lett, 6, 587–591.
23. Garcea R. and Gissmann L. (2004). Virus-like particles as vaccines and vessels for the delivery of small molecules. Curr Opin Biotechnol,15, 513–517.
24. Guenther C., Kuypers B., Lam M., Robinson T., Zhao J, and Suh J. (2014). Synthetic virology: engineering viruses for gene delivery. WIRES Nanomed Nanobiotechnol,6, 548–58.
25. Gupta M., Vemula S., Donde R., Gouda G., Behera L., and Vadde R. (2021). In silico approaches to detect inhibitors of the human severe acute respiratory syndrome coronavirus envelope protein ion channel. J Biomol Struct Dyn, 39 (7):2617-2627.
26. Hasan A., Paray B., Hussain A., Qadir F., Attar F., Aziz F., and Falahati M. (2020). A review on the cleavage priming of the spike protein on coronavirus by angiotensin-converting enzyme-2 and furin. J Biomol Struct Dyn, 1-13.
27. Helmy Y., Fawzy M., Elaswad A., Sobieh A., Scott P., Kenney S. and Awad A. (2020). The COVID-19 Pandemic: A Comprehensive Review of Taxonomy, Genetics, Epidemiology, Diagnosis, Treatment, and Control. J. Clin. Med, 9.
28. Hovlid M., Lau J., Breitenkamp K. Higginson C. and Laufer B. (2014). Encapsidated atom-transfer radical polymerization in Qβ virus-like nanoparticles. ACS Nano, 8, 8003–8014.
29. Kirchdoerfer R., Cottrell, C., Wang, N., Pallesen, J., Yassine, H., Turner, H., Corbett, et al. (2016). Pre-fusion structure of a human coronavirus spike protein. Nature, 531(7592), 118–121.
30. Klinman D., Takeno M., Ichino M., Gu M., Yamshchikov G. (1997). DNA vaccines: safety and efficacy issues. Springer Semin Immunopathol, 19, 245–256.
31. Kwon O., Kang E., Choi J., Kim S. and Yun C. (2013). Therapeutic targeting of chitosan-PEG-folate-complexed oncolytic adenovirus for active and systemic cancer gene therapy. J Control Release, 169, 257–265.
32. Lee S., Krishnamurthy S., Cho C. and Yun Y. (2016). Biosynthesis of gold nanoparticles using ocimum sanctum extracts by solvents with different polarity, ACS Sustain. Chem. Eng. 4, 2651–2659.
33. Leleux J. and Roy K. (2013). Micro and nanoparticle-based delivery systems for vaccine immunotherapy: an immunological and materials perspective. Adv Healthc Mater, 2, 72–94.
34. Li F. (2016). Structure, function, and evolution of coronavirus spike proteins. Ann. Rev. of Virol., 3 (1), 237–261.
35. Lissenberg A., Vrolijk M., van Vliet A., Langereis M., de Groot-Mijnes J., Rottier, P. and de Groot R. J. (2005). Luxury at a Cost? Recombinant mouse hepatitis viruses expressing the accessory hemagglutinin esterase protein display reduced fitness in vitro. J Virol, 79(24), 15054–15063.
36. Luo K., Jung S., Park K. and Kim Y. (2018). Microbial biosynthesis of silver nanoparticles in different culture media, J. Agric. Food Chem. 66, 957–962.
37. Manayani D., Thomas D., Dryden K., Reddy V. and Siladi M. (2007). A viral nanoparticle with dual function as an anthrax antitoxin and vaccine. PLOS Pathog, 3, 1422–1431.
38. Masters P. (2006). The molecular biology of coronaviruses. Adv. Virus Res., 65(06), 193–292.
39. Millán J., Brasch M., Anaya-Plaza E., de la Escosura A. and Velders A. (2014). Self-assembly triggered by self-assembly: optically active, paramagnetic micelles encapsulated in protein cage nanoparticles. J Inorg Biochem, 136, 140–146.
40. Oh J. and Han D. (2020). Virus-Based Nanomaterials and Nanostructures. Nanomaterials, 10, 567.
41. Oswald M., Geissler S. and Goepferich A. (2017). Targeting the central nervous system (CNS): a review of rabies virus-targeting strategies, Mol. Pharm. 14, 2177–2196.
42. Pan H., Zhang P., Gao D., Zhang Y., Li P., Liu L., Wang C., et al. (2014) Noninvasive visualization of respiratory viral infection using bioorthogonal conjugated near infrared-emitting quantum dots, ACS Nano 8, 5468–5477.
43. Peabody D. (2003). A viral platform for chemical modification and multivalent display. J Nanobiotechnol, 1,
44. Pokorski J., Breitenkamp K., Liepold L., Qazi S. and Finn M. (2011). Functional virus-based polymer-protein nanoparticles by atom transfer radical polymerization. J Am Chem Soc, 133, 9242–9245.
45. Pokorski J. and Steinmetz N. (2011). The art of engineering viral nanoparticles. Mol Pharm, 8, 29–43.
46. Prasuhn D., Jr, Yeh R., Obenaus A., Manchester M. and Finn M. (2007). Viral MRI contrast agents: coordination of Gd by native virions and attachment of Gd complexes by azide-alkyne cycloaddition. Chem Commun, 2007,1269–1271.
47. Pushko P. and Pumpens P. (2013). Grens E. Development of virus-like particle technology from small highly symmetric to large complex virus-like particle structures. Intervirology, 56, 141–165.
48. Rhee J., Baksh M., Nycholat C., Paulson J., Kitagishi H. and Finn M. (2012). Glycan-targeted virus-like nanoparticles for photodynamic therapy. Biomacromolecules, 13, 2333–2338.
49. Roldao A., Mellado M., Castilho L., Carrondo M. and Alves P. (2010). Virus-like particles in vaccine development. Expert Rev Vaccines, 9, 1149–1176.
50. Rynda-Apple A., Patterson D. and Douglas T. (2014). Virus-like particles as antigenic nanomaterials for inducing protective immune responses in the lung. Nanomedicine, 9, 1857–1868.
51. Shen K., Yang Y. and Wang T. (2020). Diagnosis, treatment, and prevention of 2019 novel coronavirus infection in children: experts’ consensus statement World J Pediatr, 16(3), 223-231.
52. Shukla S., Ablack A., Wen A., Lee K., Lewis J. and Steinmetz N. (2013). Increased tumor homing and tissue penetration of the filamentous plant viral nanoparticle Potato virus X. Mol Pharm, 10, 33–42.
53. Simmons G., Gosalia D., Rennekamp A., Reeves J., Diamond S. and Bates P. (2005). Inhibitors of cathepsin L prevent severe acute respiratory syndrome coronavirus entry. PNAS, 102(33), 11876–11881.
54. Singh P., Prasuhn D., Yeh R., Destito G. and Rae C. (2007). Bio-distribution, toxicity and pathology of cowpea mosaic virus nanoparticles in vivo. J Control Release, 120, 41–50.
55. Steinmetz N. (2010). Viral nanoparticles as platforms for next-generation therapeutics and imaging devices. Nanomedicine, 6:634–641.
56. Strable E, Prasuhn D. Jr, Udit A., Brown S. and Link A. (2008). Unnatural amino acid incorporation into virus-like particles. Bioconjug Chem,19, 866–875.
57. Tharayil A., Rajakumari R., Kumar A., Choudhary M., Palit P. and Thomas S. (2021). New insights into application of nanoparticles in the diagnosis and screening of novel coronavirus (SARS-CoV-2). Emergent Materials, 4,101–117.
58. Udit A., Brown S., Baksh M. and Finn M. (2008). Immobilization of bacteriophage Qβ on metal-derivatized surfaces via polyvalent display of hexahistidine tags. J Inorg Biochem,102, 2142–2146.
59. Van Hemert M., Van Den Worm, S., Knoops K., Mommaas A., Gorbalenya A. and Snijder E. (2008). SARS-coronavirus replication/transcription complexes are membrane-protected and need a host factor for activity in vitro. PLoS Pathogens, 4(5).
60. Venkataram P. and Schmid M. (2012). Principles of Virus Structural Organization. Viral Molecular Machines,726, 17–47.
61. Virus taxonomy: the classification and comenclature of viruses, ICTV reports are freely available online: https://talk.ictvonline.org/ictv-reports/ictv_online_report/.
62. Walls A., Park Y., Tortorici M., Wall A., McGuire A. and Veesler D. (2020). Structure, function, and antigenicity of the SARS-CoV-2 Spike glycoprotein. Cell, 181(2), 281–212.
63. Wang,WangY., Ye D, and Liu Q. (2020). A review of the 2019 Novel Coronavirus (COVID-19) based on current evidence. Int J Antimicrob Agents, 55(6), 105948.
64. Wang Q., Li C., Zhang Q., Wang T., Li J., Guan W., Yu J., Liang M.and Li D. (2020). Interactions of SARS Coronavirus Nucleocapsid Protein with the host cell proteasome subunit p42. Virology J, 7(1), 99–98.
65. Wen A., Shukla S, Saxena P, Aljabali A. and Yildiz I. (2012). Interior engineering of a viral nanoparticle and its tumor homing properties. Biomacromol,13, 3990–4001.
66. Wen A., Wang Y., Jiang K., Hsu G. and Gao H. (2015). Shaping bio-inspired nanotechnologies to target thrombosis for dual optical-magnetic resonance imaging. J Mater Chem B, 3, 6037–6045.
67. White K., Jr P., Wang H., Jesus P., Manicassamy B., García-Sastre A., Chanda S., et al. (2018). Broad spectrum inhibitor of influenza A and B viruses targeting the viral nucleoprotein, ACS Infect. Dis, 4,146–
68. Wrapp D., Wang N., Corbett K., Goldsmith J., Hsieh C., Abiona O., Graham B. and McLellan J. (2020). Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science, 367(6483), 1260–1263.
69. Wu M., Brown W. and Stockley P. (1995). Cell-specific delivery of bacteriophage-encapsidated ricin A chain. Bioconjug Chem, 6, 587–595.
70. Yang M., Sunderland K. and Mao C. (2017). Virus-derived peptides for clinical applications. Chem. Rev, 117, 10377–10402.
71. Yildiz I., Shukla S. and Steinmetz N. (2011). Applications of viral nanoparticles in medicine. Curr Opin Biotechnol, 22, 901– 908.
72. Yildiz I., Lee K., Chen K., Shukla S. and Steinmetz N. (2013). Infusion of imaging and therapeutic molecules into the plant virus-based carrier cowpea mosaic virus: cargo-loading and delivery. J Control Release, 172, 568–578.
73. Zeng Q., Wen H., Wen Q., Chen X. and Wang Y. (2013). Cucumber mosaic virus as drug delivery vehicle for doxorubicin. Biomaterials, 34, 4632–4642.
74. Zhang Y., Ke X., Zheng Z., Zhang C., Zhang Z., Zhang F., Hu Q., et al. (2013). Encapsulating quantum dots into enveloped virus in living cells for tracking virus infection, ACS Nano, 7, 3896–3904.

Резюме

Вирусът, причиняващ COVID19 може да бъде разпространен от човек на човек чрез малки водни частици, наречени аерозоли. Тези аерозоли се образуват при дихателните процеси и още повече при говор, крещене или пеене. Аерозолите са различни от големите капки, разпространяващи COVID 19. Големите капки падат на земята по-бързо. Те стигат на разстояние от три до шест метра от човека който ги образува. Аерозолите могат да присъстват във въздуха с часове и да се разпространяват на дълги разстояния. Аерозолите съдържат по-малко вирусни частици от по-големите капки. Поради тази причина, за да се осъществи инфекция, трябва да бъдат вдишани повече аерозоли. Аерозолите могат да се натрупат ако въздуха не циркулира правилно. Предаването на вируси по въздушно-капков път зачестява през зимните месеци, тъй като хората прекарват повече време в затворени пространства и често е твърде студено, за да се държат отворени прозорците. През зимата въздуха е по-сух, особено в отопляеми пространства. Сухия въздух уврежда лигавицата на респираторния тракт и улеснява навлизането на вируса в дихателните пътища. Това означава и че по-малки аерозоли могат да присъстват за по-дълго във въздуха. По този начин разпространението на COVID-19 по въздушно-капков път е очаквано да бъде по-често срещано по време на зимните месеци. При непълна ваксинация носенето на маски и потдържане на разстояние на поне един метър от останалите хора, както и добрата въздушна циркулация (вентилация) в сградите, училищата и домовете, както и системите за пречистване на въздуха могат да намалят разпространението на COVID-19.

Ключови думи/фрази:  филтрационни системи за пречистване на въздуха, нанотехнологии, COVID-19

1. Въведение

COVID-19 накара човешката популация да преосмисли начина си на живот. Заплахата, породена от потенциалното разпространение на вируса по въздушно-капков път чрез вентилационни системи в сгради и затворени пространства, дава повод за притеснение. За да намалят тази заплаха, изследователите откриха различни технологии и методики за елиминиране или намаляване на концентрацията на вируса във вентилационни системи и закрити пространства. Въпреки, че вече са проучени много технологии и методи, някои вече комерсиално достъпни, тяхната ефикасност и безопасност все още не е напълно изследвана. Тази статия съдържа кратък преглед на различни приложими технологии и методи за борба с вируси, предавани по въздушно-капков път във вентилационни системи и закрити пространства, с цел да бъде придобит по-широк поглед и обобщение върху настоящата научноизследователска и развойна дейност. Това включва ефикасна въздушна филтрация, йонизация на въздуха, контрол на средата, ултравиолетово гермицидно облъчване, нетермична плазма и реактивоспособни кислородни видове, филтърни покрития, химични дезинфектанти и топлинно инактивиране. Тази статия дава информация за системи за филтриране на въздуха, които предотвратяват разпространението на вируси.

COVID-19 принуди човешката популация да се адаптира бързо в следствие на новия и силно заразен вирус. Начините за трансмисия на вируса не са напълно ясни. Въпреки това е прието, че вируса може да бъде предаван чрез въздуха, чрез пряк контакт с друго лице или чрез изпаряващи се респираторни капки под формата на капкови ядра, които могат да останат разтворени за дълго време като аерозоли [23, 20, 7]. Тези арозоли могат да преминат през вентилационни системи в сгради и закрити пространства и да достигнат до други зони, далеч от инфектираните лица [6, 14]. Макар че има спор относно сериозността на заплахата, породена от тези въздушни капки, ясно е че начина на трансмисия в затворени пространства не може да бъде игнориран. Още повече, скорошно проучване дори допуска, че предаването по въздушно-капков път може да бъде основния начин за пренос на вируса (Фиг.1) [6].

Въпреки че COVID-19 не е напълно проучен, много уроци бяха научени от предишни вируси, предавани по въздушно-капков път. Такива са например туберкулозата и различни щамове на грипния вирус [14, 21]. От основни знания за това как се разпространяват вирусите следва, че в неинфектиран индивид трябва да навлезе определено количество вирус, за да се увеличи вирусния товар и това да доведе до нова инфекция. В епидемиологичната литература обикновено това се дефинира като квант- броя на инфекциозните въздушни частици, необходими за инфектирането на 63% от индивидите в определено закрито пространство [22]. Това е основен критерий за много модели, целящи да придадат количествена мярка на възможността за инфекция без досег до даден патоген. Този модел се базира на предположение за добре смесен състав на въздуха, което е подкрепено в литературата [19, 2, 26]. Това предполага, че частиците са равномерно разпределени в затворено пространство, вместо да образуват малък облак от аерозоли, разпръснати около инфектирания индивид. Разпространението и ефекта на инфекцията се определят от фактори като вирусен товар, дихателна честота, концентрация на капковия обем, отделен от инфектирания индивид, броя вирусни частици необходими за иницииране на инфекцията и обема на затвореното пространство.

Фигура 1. Риск от инфекция посредством въздушни капки.

Математически, квантовата емисионна скорост се определя от вирусния товар, дихателната честота, концентрацията на капковия обем, отделен от инфектирания индивид и броя вирусни частици необходими за иницииране на инфекцията. Ефектите за намаляване възможността от инфекция включват фактори като въздушен обмен, скорост на филтрация на въздуха, капково утаяване, скорост на капково утаяване, скорост на инактивиране и радиус на частиците.

Следователно, няколко ключови фактора могат да бъдат считани като възможни методи за премахване на вирусни частици от затворени пространства и по този начин да намалят възможността от инфекция. Те са (Фиг.2):

• Увеличаване на потока на свеж въздух и съответно намаляване на квантовата концентрация;
• Увеличаване на филтрационната скорост на HVAC системата;
• Увеличаване на скоростта на отлагане на вирусни частици върху повърхности;
• Увеличаване на вирусната инактивация.

Фигура 2. Подобряване на качеството на въздуха в затворени пространства с цел предотвратяване на разпространението на COVID-19.

 

Въпреки че са различни по дефиниция, увеличаването на скоростта на отлагане на вирусните частици може да се счита като сходна на увеличаване на скоростта на седиментация. Седиментацията представлява утаяване на частици върху земята или други повърхности благодарение на гравитационните сили. Въпреки това, частиците във въздуха могат да се натрупват върху стени и други повърхности поради механизми като например неестествена дифузия за седиментация на частици. Центровете за контрол и превенция на заболяванията (CDC) и Световната здравна организация (WHO) потвърждават възможността за премахване на вирусни частици чрез обмен на въздуха [8, 4]. Те препоръчват увеличаване на потока от свеж въздух като прост начин за намаляване на концентрацията на вирусни частици в затворено пространство. Йонизацията на въздуха също може да бъде използвана за увеличаване на скоростта на премахване на вирусни частици от затворено пространство, чрез увеличаване на филтрационната ефективност и отлагането на частици. За стерилизиране на въздуха и обезвреждане на вируса са достъпни различни методи. По този начин се увеличава скоростта на вирусната инактивация и се намалява необходимостта от премахване на частици от въздуха. В тази връзка може да бъде изброено следното:

• Ултравиолетово гермицидно облъчване (UVGI).Това е традиционно популярна технология за борба с вируси, предавани по въздушно-капков път (Фиг.3).
• Контрол на температура и относителна влажност на въздуха.. Счита се, че чрез директно контролиране на условията на средата може да бъде създадена неблагоприятна среда за вируси и по този начин да бъде увеличена естествената скорост на вирусна инактивация. Това включва контролиране на температурата и относителната влажност на въздуха, за да бъде поддържана неподходяща за вируса среда.
• Нетермична плазма и реактивоспособни кислородни видове.. Те предлагат други алтернативи за вирусна инактивация и са доказано ефективни срещу бактерии и други микроорганизми.
• Използване на филтърни покрития.. Друг възможен метод е използването на филтърни покрития, които улесняват вирусната инактивация чрез антимикробните си качества или чрез директно увреждане на вируса.
• Химични дезинфектанти.. Химичните дезинфектанти също са доказано ефективни в премахването на вируси от повърхности и могат да предоставят други решения за увеличаване на вирусната инактивация.
• Свръхтоплинна стерилизация.. Свръхтоплинната стерилизация може да предложи друго надеждно решение за инактивиране на вирусните частици, въпреки че традиционно се използва за стерилизиране на хирургично оборудване в по-малък мащаб.

Фигура 3: Подобряване на вентилацията и филтрирането на въздуха в жилищни и работни пространства за предотвратяване разпространението на COVID-19.

2. Филтрация на въздуха и SARS-CoV-2

Въздушната филтрация се превърна в критична интервенция при справяне с разпространението на коронавирусното заболяване от 2019г. (COVID-19). Въпреки това правилното поставяне на въздушни филтрационни системи е възпрепятствано от лошото разбиране на техните принципи. Тези погрешни разбирания водят до съмнителна ефикасност на въздушната филтрация при спирането на потенциални инфекциозни аерозолни частици. Правилното разбиране за начина на работа на въздушните филтрационни системи е критично при вземането на решения, свързани с предотвратяване на разпространението на COVID-19. Този проблем е значителен тъй като скорошни доказателства показват, че вируса SARS-CoV-2 може да остане във въздуха по-дълго време и да бъде пренасян по-далече, отколкото по-ранни очаквания, с намалени концентрации и жизнеспособност. SARS-CoV-2 вирионите са с големина около 60-140 nm в диаметър. Открито е, че вирионите могат да бъдат носени от по-големи респираторни капки и замърсители на въздуха (>1 µm). Премахването от въздуха на такива частици, носещи SARS-CoV-2, е възможно чрез въздушна филтрация, базирана на естествено или механично движение на въздуха. Сред различните типове въздушни филтри, препоръчителни за употреба са HEPA филтрите (високоефективни филтри за частично задържане). Други типове филтри могат да бъдат повече или по-малко ефективни и съответно да пречистват по-лесно или по-трудно въздуха. Използването на маски, респиратори, модули за въздушна филтрация и друго специално оборудване е една важна интервенция при справяне с разпространението на COVID-19. Разглеждането на въздушните филтрационни механизми и разбирането на това как аерозолните частици, съдържащи SARS-CoV-2 вириони, взаимодействат с филтърните материали е от критично значение. По този начин могат да бъдат идентифицирани най-добрите практики за филтриране на въздуха, за да бъде намалено разпространението на COVID-19.

Има все повече доказателства, че вирусът на тежкия остър респираторен синдром (SARS-CoV-2) може да остане във въздуха за дълги периоди от време. Някои от вирионите на SARS-CoV-2 могат да останат жизнеспособни за поне три часа след аерозилиране [31]. SARS-CoV-2 PCR положителни частици по-големи от 1 μm в диаметър са детектирани в стаи, обитавани от пациенти с COVID-19 [5]. В друго проучване, SARS-CoV-2 РНК е детектирана в аерозолна фаза на разстояние най-малко 3 метра от инфектирани хора в затворено помещение [15]. SARS-CoV-2 РНК е намерена също и в замърсители, циркулиращи във въздуха [24].

Диаметъра на SARS-CoV-2 вирионите е около 60-140 nm [39]. При издишване много респираторни капки, които могат да съдържат вириони, са значително по-големи от самите вириони. Изпаряването на капките намалява размера им [39], позволявайки потенциални инфекциозни частици да останат във въздуха за значително по-дълъг период от време. Наблюдава се, че сухи пръски с диаметър от около 4 μm формират получени при говор мокри такива от 12 μm до 21 μm поради изсушаване. За падането на тези сухи пръски в неподвижен въздух, на 30 cm разстояние отнема около 8 минути [35]. При ниска температура на околната среда, издишания въздух с висока влажност може да стане свръхнаситен. След това влагата кондензира върху частиците, отделени от човека, превръщайки ги в капки или по-големи ледени кристали. Вирионите на SARS-CoV-2 могат да оцелеят по-дълго време в такива капки или ледени кристали. Това е една важна хипотеза която трябва да бъде тествана в бъдещи проучвания. По този начин условията на околната среда и аерозолната динамика може да повлияват значително размера на вдишаните частици и жизнеспособността на SARS-CoV-2 вирионите в аерозолни частици, опосредстващи разпространението по въздушно-капков път в открити и затворени пространства. Огнищата на COVID-19 в кланици и ски курорти могат да се дължат, или поне от части, на аерозолната динамика на студения въздух.

Премахването на частици, които могат да носят SARS-CoV-2, от въздуха чрез специализирано оборудване за въздушна филтрация и маски или респиратори е една важна интервенция при справяне с разпространението на COVID-19. Въпреки това, лошото разбиране за това как работи въздушната филтрация и погрешни разбирания, свързани с концепцията за ефективна филтрация на аерозолни частици с различни размери, възпрепятстват ефективното внедряване на въздушната филтрация. За да бъдат идентифицирани най-добрите частици за целите на въздушната филтрация в справянето с проблема за разпространение на COVID-19, от изключителна важност е да бъдат разгледани механизмите за въздушна филтрация и да бъдат разбрани начините на взаимодействие на аерозолните частици, съдържащи SARS-CoV-2 вириони, и филтърните материали.

За въздушна филтрация, ефективните въздушни филтри (EPA), високо ефективните въздушни филтри (HEPA) (Фиг.4) и въздушни филтри за много фино пречистване (ULPA) се използват широко в различни отрасли и приложения от много години [25]. HEPA филтрите се препоръчват за инфекциозен контрол в болнични заведения [13, 10] поради баланса на по-високо ефективната филтрация и по-ниското съпротивление на въздушния поток в сравнение с ULPA филтрите. HEPA филтрите биват използвани често и в неболнични среди, където могат да присъстват инфекциозни агенти предавани по въздушно-капков път. Такива примери включват филтрация на рециркулиращ въздух в пътнически самолет и ламинарни боксове в лаборатории, включително такива в които се извършва работа със SARS-CoV-2 [37].

Обикновено абревиатурата HEPA се интерпретира като високоефективни филтри за частично задържане. И двете версии на този термин биват широко използвани и няма разлика между тях. Министерството на енергетиката на Съединените щати и Агенцията по опазване на околната среда на Съединените американски щати (EPA) определят HEPA въз основа на минимум 99.97% ефективност при тестване с аерозоли с диаметър 0.3 μm [36]. Агенцията по опазване на околната среда в САЩ определя диаметър от 0.3 μm като „размер на частиците с най-голяма проникваща способност“ (MPPS). Въпреки това, MPPS може да варира около 0.3 μm с абсолютна стойност зависеща от естеството на аерозолните частици, типа на филтърния материал и обема на преминаващия въздух [25]. Частици с по-голям или по-малък размер от MPPS се задържат с ефикасност по-голяма от 99.97% [32]. Концепцията за MPPS противоречи на общото погрешно схващане, че филтрационната ефективност намалява за частици по-малки от MPPS (например по-малки от 0.3 μm). Това погрешно разбиране допринесе за прилагането на по-ранни подходи, които бяха подведени от предположението, че SARS-CoV-2 вирионите са прекалено малки, за да бъдат ефективно филтрирани от въздуха.

Фигура 4. HEPA филтри.

Препоръчва се инсталиране на HEPA филтри в изходите на вентилационни системи в заведения за интензивна грижа на хора, заразени със SARS-CoV-2. Използването на фиксирани (вентилационни системи в сградите) и подвижни HEPA филтрационни системи със или без въздушна рециркулация (пречистватели на въздуха за закрити пространства) се препоръчват за употреба в болнични пространства от Американските центрове за контрол и профилактика на заболяванията и Световната здравна организация, включително и в места където пребивават пациенти заразени със SARS-CoV-2 [10]. Спецификациите за минимална филтрационна ефикасност на HEPA филтрите се регулират от национални и международни стандарти. Двата най-широко използвани стандарта са ISO 29463 стандарт и европейския EN1822 стандарт. Различията между двата стандарта могат да бъдат съгласувани. Например, HEPA филтър сертифициран по EN 1822, филтърен клас H14, трябва да задържа най-малко 99.995% от аерозолните частици с MPPS. EN 1822, филтърен клас H14, е сравним с ISO 45 H. Налични са многостъпални протоколи за тест на филтрите, за да бъде верифицирано съответствието им с изискванията на стандартите [12, 18]. Когато се появи механично въздушно движение между филтрите, от изключително значение е да бъде избегната появата на силни насочени въздушни потоци. Наскоро бяха изразени притеснения, че такива въздушни потоци могат да разпръснат нефилтриран въздух, съдържащ инфекциозни частици, и да ги отведат по-бързо и на по-голямо разстояние, отколкото те могат да дифундират в неподвижен въздух [11].

Към филтърните материали могат да бъдат добавени антивирусни свойства. Въпреки това, аерозолните частици веднъж събрани върху филтърните фибри, не напускат и преминават през филтъра по време или след правилна употреба [25]. По този начин антивирусните свойства на фибрите почти нямат ефект върху премахването на вириони на SARS-CoV-2. Частици акумулирани върху вече събрани от филтъра частици не контактуват с филтърния материал, елиминирайки каквито и да било антивирусни свойства. По този начин, предаването на антивирусни свойства на HEPA филтърните материали не допринася за по-голяма стойност на филтъра, с изключение когато хората влизат в пряк контакт с тези филтри по време или малко след тяхната употреба.

Механизмите на филтрация на аерозолни частици в газовата фаза- инерционен сблъсък, дифузия, задържане, електростатично отлагане и пресяване [25, 12, 18]- са изследвани задълбочено в продължение на десетилетия от научни разработки. Тези механизми имат различен принос към цялостната ефективност на задържане на частици, зависещ от аеродинамичния диаметър на частиците, други свойства на частиците и филтриращата среда. Комбинирания ефект на всички тези филтационни механизми в HEPA филтрите обясняват високата филтрационна ефективност и MPPS феномена сред целия спектър от аерозолни размери [25]. Различни типове аерозолни частици биват филтрувани с висока ефективност в съответствие със съответните стандарти, независимо от техния биогенен или небиогенен произход [12, 18].

Известно е (базирано на многобройни публикувани проучвания), че някои респираторни инфекции се появяват по-често при вдишване на по-замърсен въздух, както и че възстановителния процес и последици от някои респираторни инфекции биват неблагоприятно повлияни от замърсяването във въздуха. Вече беше демонстрирана връзката между продължителното замърсяване на въздуха с частици и по-високата смъртност от COVID-19 [39]. Вдишването на замърсен въздух е също строго асоциирано с неблагоприятни ефекти върху респираторните и кардиоваскуларни функции [17]. Интервенциите, базирани на въздушна филтрация с подходяща апаратура, трябва да бъдат широко прилагани както за намаляване на разпространението на SARS-CoV-2 през аерозолната фаза, така и за подобряване на здравния статус и последиците от инфекцията на контактните и заразени с COVID-19 индивиди.

3. Въздушни пречистватели и филтри

Изчислено е, че използването на въздушни филтри и пречистватели ще намали вирусния товар в околната среда. Пречистватели на въздуха могат да бъдат използвани в болничните стаи. Това може да намали вероятността за инфекция, предавана от здравните работници поради недостиг на лични предпазни средства. По този начин може да бъде намалена вероятността за повторна инфекция на пациенти поради предаване на вируси по въздушно-капков път. Този тип филтрационна система може да бъде използвана и в обществения транспорт, в болнични условия, в затворени превозни средства и у дома. Капките отделени при кашляне или кихане от заразен човек обикновено са с размери от 5 микрона или повече. Най-малката частица, която предизвиква безпокойство, е единичният вирион (не е прикрепен към капка) с диаметър около 0,12 микрона. Те могат да бъдат сравнително добре филтрирани от HEPA филтрите (високоефективни филтри за частично задържане) [3]. ULPA филтрите (въздушни филтри за много фино пречистване) са по-усъвършенствани в улавянето на почти 99,99% от частиците с големина 0,12 микрона и повече. Използването на нанотехнология допълнително увеличава капацитета за улавяне на вируси на такива въздушни пречистватели и филтри. На базата на никелова (Ni) пяна се произвежда ефикасен филтър който улавя и убива вируси и бактерии във въздуха, включително SARS-CoV-2 и Bacillus anthracis. Тъй като вирусът SARS-CoV-2 не може да оцелее при температури над 70 °C, въздушният филтър е проектиран да работи при 200 °C чрез нагряване на Ni-пяна. Твърди се, че ефективността на проектирания филтър е 99,8% за вируса SARS-CoV-2 и 99,9% за Bacillus anthracis [3].

Последните проучвания показват, че в допълнение към употребата в почистващи продукти и в лични предпазни средства, нанотехнология се използва и при разработването на пречистватели на въздуха за предотвратяване на разпространението на SARS-CoV-2 вируса по въздушно-капков път. В този контекст йонизаторът за въздух TeqAir 200, разработен от базираната във Франция компания TEQOYA, вече е на пазара (фиг. 5). Тъй като размерът на SARS-CoV-2 е близък до размерите на частиците, за които пречиствателите на въздуха TEQOYA са ефективни, се очаква те да намалят концентрацията на SARS-CoV-2 във въздуха.

Фигура 5. TeqAir 200 йонизатор на въздуха.

3.1. Нанофибърна технология

Mack Antonoff HVAC проектират системи за пречистване и филтриране на въздуха, използващи нанофибърна технология и UV лъчения [16]. Turnkey Environmental Consultants разработват система за филтриране на въздуха, базирана на плътна мрежа от нановлакна (IQAirHyperHEPA® филтрационна технология), която улавя частици от всякакъв размер. Твърди се, че улавя 99,5% от замърсителите, включително бактерии и вируси с размер приблизително 0,003 микрона [16].

3.2. Фото електрохимично окисление

Изследователи от Университета в Южна Флорида разработват устройство за пречистване на въздуха „Molekule“, за което се твърди, че ефективно унищожава замърсителите на въздуха, включително бактерии, спори на плесени и вируси [9]. Пречиствателят на въздуха използва фото електрохимично окисление (PECO), при което се използва UV-A лъчи за да бъде активиран катализатор във филтъра, с покритие от наночастици. Генерират се свободни радикали, които окисляват замърсителите на въздуха [9]. Тези базирани на PECO пречистватели на въздуха имат огромен потенциал да намалят разпространението на вируса, предимно в здравни заведения.

---

Тест LO 2.1

---

Литература

1. Bazant, M. Z., & Bush, J. W. (2021). A guideline to limit indoor airborne transmission of COVID-19. Proceedings of the National Academy of Sciences, 118(17).
2. Buonanno, G., Stabile, L., & Morawska, L. (2020). Estimation of airborne viral emission: Quanta emission rate of SARS-CoV-2 for infection risk assessment. Environment international, 141, 105794.
3. Chaudhary, V., Royal, A., Chavali, M., & Yadav, S. K. (2021). Advancements in research and development to combat COVID-19 using nanotechnology. Nanotechnology for Environmental Engineering, 6(1), 1-15.
4. Centres for Disease Control and Prevention, Feb. 9, 2021. COVID-19 ventilation FAQs, pp. 1–8 [Online]. Available. https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov /community/ventilation.html. (Accessed 4 May 2021).
5. Chia, P. Y., Coleman, K. K., Tan, Y. K., Ong, S. W. X., Gum, M., Lau, S. K., … & Marimuthu, K. (2020). Detection of air and surface contamination by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in hospital rooms of infected patients. MedRxiv.
6. Correia, G., Rodrigues, L., Da Silva, M. G., & Gonçalves, T. (2020). Airborne route and bad use of ventilation systems as non-negligible factors in SARS-CoV-2 transmission. Medical hypotheses, 141, 109781.
7. Dancer, S. J., Tang, J. W., Marr, L. C., Miller, S., Morawska, L., & Jimenez, J. L. (2020). Putting a balance on the aerosolization debate around SARS-CoV-2. The Journal of Hospital Infection, 105(3), 569.
8. Ding, J., Yu, C. W., & Cao, S. J. (2020). HVAC systems for environmental control to minimize the COVID-19 infection. Indoor and Built Environment, 29(9), 1195-1201.
9. Elias, B., & Bar-Yam, Y. (2020). Could air filtration reduce COVID-19 severity and spread. New England Complex Systems Institute, 9.
10. EMW filtertechnik. ISO 29463: new test standard for HEPA filters [cited 2020 Jun 3]. Available from: https://www.emw.de/en/filter-campus/iso29463.html.
11. Ham, S. (2020). Prevention of exposure to and spread of COVID-19 using air purifiers: challenges and concerns. Epidemiology and Health, 42.
12. Hick, J. L., Hanfling, D., Wynia, M. K., & Pavia, A. T. (2020). National Academy of Medicine. Duty to Plan: Health Care, Crisis Standards of Care, and Novel Coronavirus SARS-CoV.
13. Hinds, W. C. (1999). Aerosol technology: properties, behavior, and measurement of airborne particles. John Wiley & Sons.
14. Li, Y., Leung, G. M., Tang, J. W., Yang, X., Chao, C. Y. H., Lin, J. Z., … & Qian, H. (2007). AC 587 Sleigh, H.-JJ Su, J. Sundell, TW Wong, PL Yuen, Role of ventilation in airborne transmission of 588 infectious agents in the built environment-a multidisciplinary systematic review. Indoor Air, 17(589), 2-18.
15. Liu, Y., Ning, Z., Chen, Y., Guo, M., Liu, Y., Gali, N. K., … & Lan, K. (2020). Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals. Nature, 582(7813), 557-560.
16. Look, M., Bandyopadhyay, A., Blum, J. S., & Fahmy, T. M. (2010). Application of nanotechnologies for improved immune response against infectious diseases in the developing world. Advanced drug delivery reviews, 62(4-5), 378-393.
17. Nadadur, S. S., & Hollingsworth, J. W. (Eds.). (2015). Air pollution and health effects. Springer.
18. Nazarenko, Y. (2020). Air filtration and SARS-CoV-2. Epidemiology and health, 42.
19. Nicas, M., & Miller, S. L. (1999). A multi-zone model evaluation of the efficacy of upper-room air ultraviolet germicidal irradiation. Applied Occupational and Environmental Hygiene, 14(5), 317-328.
20. Peters, A., Parneix, P., Otter, J., & Pittet, D. (2020). Putting some context to the aerosolization debate around SARS-CoV-2. The Journal of Hospital Infection, 105(2), 381.
21. Riley, R. L. (1982). Indoor airborne infection. Environment international, 8(1-6), 317-320.
22. Riley, E. C., Murphy, G., & Riley, R. L. (1978). Airborne spread of measles in a suburban elementary school. American journal of epidemiology, 107(5), 421-432.
23. Santos, A. F., Gaspar, P. D., Hamandosh, A., Aguiar, E. B. D., Guerra Filho, A. C., & Souza, H. J. L. D. (2020). Best practices on HVAC design to minimize the risk of COVID-19 infection within indoor environments. Brazilian Archives of Biology and Technology, 63.
24. Setti, L., Passarini, F., De Gennaro, G., Barbieri, P., Perrone, M. G., Borelli, M., … & Miani, A. (2020). SARS-Cov-2RNA found on particulate matter of Bergamo in Northern Italy: first evidence. Environmental research, 188, 109754.
25. Stadnytskyi, V., Bax, C. E., Bax, A., & Anfinrud, P. (2020). The airborne lifetime of small speech droplets and their potential importance in SARS-CoV-2 transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences, 117(22), 11875-11877.
26. Stilianakis, N. I., & Drossinos, Y. (2010). Dynamics of infectious disease transmission by inhalable respiratory droplets. Journal of the Royal Society Interface, 7(50), 1355-1366.
27. URL-1: https://aeramaxpro.com/covid19-1/
28. URL-2: https://www.usatoday.com/in-depth/graphics/2020/10/18/improving-indoor-air-quality-prevent-covid-19/3566978001/
29. URL-3:https://www.sentryair.com/blog/indoor-air-quality/improving-ventilation-and-air-filtration-to-help-prevent-covid-transmission-in-the-workplace/
30. URL-4: https://www.microcovid.org/blog/hepafilters
31. URL-5: https://product.statnano.com/product/11653/teqoya-teqair-200-air-ionizer
32. S. Department of Energy. DOE-STD-3020-2005, specification for HEPA filters used by DOE contractors; 2015 [cited 2020 Jul 15]. Available from: https://www.standards.doe.gov/standards-documents/3000/3020-astd-2005
33. Van Doremalen, N., Bushmaker, T., Morris, D. H., Holbrook, M. G., Gamble, A., Williamson, B. N., … & Munster, V. J. (2020). Aerosol and surface stability of SARS-CoV-2 as compared with SARS-CoV-1. New England journal of medicine, 382(16), 1564-1567.
34. Vejerano, E. P., & Marr, L. C. (2018). Physico-chemical characteristics of evaporating respiratory fluid droplets. Journal of The Royal Society Interface, 15(139), 20170939.
35. Wells, W. F. (1934). ON AIR-borne infection: study II. Droplets and droplet nuclei. American journal of Epidemiology, 20(3), 611-618.
36. World Health Organization. Laboratory biosafety guidance related to coronavirus disease 2019 (COVID-19): interim guidance, 12 February 2020 [cited 2020 Jun 3]. Available from: https://apps.who.int/iris/handle/10665/331138.
37. World Health Organization. (2020). Severe acute respiratory infections treatment centre: practical manual to set up and manage a SARI treatment centre and a SARI screening facility in health care facilities(No. WHO/2019-nCoV/SARI_treatment_center/2020.1). World Health Organization.
38. Wu, X., Nethery, R. C., Sabath, B. M., Braun, D., & Dominici, F. (2020). Exposure to air pollution and COVID-19 mortality in the United States: A nationwide cross-sectional study. medRxiv 2020.04. 05.20054502.
39. Zhu, N., Zhang, D., Wang, W., Li, X., Yang, B., Song, J., … & Tan, W. (2020). A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019. New England journal of medicine.

Резюме

Вирусните епидемии се развиват благодарение на появата на нови варианти инфекциозни вируси. Липсата на ефективни антивирусни лечения за нови вирусни инфекции, съчетано с бързото разпространение на инфекцията в общността, често води до огромни човешки и финансови загуби. Вирусна трансмисия може да се осъществи чрез близък контакт от човек на човек или чрез контакт с контаминирани повърхности. Следователно внимателната дезинфекция е от съществено значение за намаляване на разпространението на вируса. Има множество дезинфектанти/дезинфекциращи агенти/биоцидни агенти, които могат да инактивират вирусите. Тяхната ефективност зависи от много фактори като концентрация на веществото, време на действие, температура и органично натоварване. Напредъкът в нанотехнологиите е от голямо значение за инактивирането на вируси и за контрола на епидемията от COVID-19.

Ключови думи/фрази: дезинфекция, нанотехнология, COVID-19

1. Въведение

Вирусните инфекции и тяхното разпространение исторически са представлявали сериозна заплаха за човешкото здраве и благосъстояние и водели до големи социалноикономически проблеми. Преди век, през 1918 г., пандемията от „испански грип“ предизвика световна катастрофа с повече от 50 милиона смъртни случая и 500 милиона инфектирани [33]. При Либерия- една от страните, най-тежко засегнати от епидемията от Ебола в западна Африка през 2014 г., растежът на брутния вътрешен продукт (БВП) намаля от 8,7% през 2013 г. до 0,7% през 2014 г. [66]. Заплахата от глобална вирусна пандемия може да доведе до по-големи катастрофи от досега записаните в човешката история, тъй като вирусите могат да се разпространяват по целия свят с безпрецедентни темпове поради по-лесните глобални връзки и транспорт, както и поради лесната и интензивна човешка мобилност днес. Днес виждаме, че подобна пандемия несъмнено доведе до по-катастрофални резултати [7]. Новият коронавирус, който причинява заболяването COVID-19 (SARS-CoV-2 или по-рано HCoV-19), съобщен за първи път в Китай в края на 2019 г., доведе до повече от приблизително шест милиона смъртни случая към момента на написване на тази статия. Пандемията все още не е приключила и всеки ден се съобщава за нови заразени и нови смъртни случаи. Докато правителствата и държавите могат да повлияят на честотата и обхвата на огнищата [2], хората играят роля в ограничаване на разпространението на вируси в обществени и здравни заведения [47]. Предаването от човек на човек на обикновените грипни вируси и коронавирусите може да възникне чрез самоинокулиране на мукозни мембрани в носа, устата или очите чрез докосване на контаминирани сухи повърхности, както и с телесни течности съдържащи вируси [37]. В зависимост от вида на повърхността и условията на околната среда, вирусите могат да останат върху небиологични повърхности от 5 минути до повече от 28 дни [22]. Използването на дезинфектанти за лична хигиена и дезинфекцията на повърхности е от голямо значение за лимитиране на вирусната трансмисия чрез инактивиране на вирусите, преди те да имат шанса да влязат в човешкото тяло.

Тази глава предоставя информация за различните видове дезинфектанти, налични в търговската мрежа, с научно доказани вирицидни свойства, инактивиращи вируси в разтвори или върху повърхности. Предоставена е и информация относно използването на нанотехнологични материали за антивирусна дезинфекция- една от обещаващите нови разработки, за която е доказано, че инактивира вируси, но все още не е широко използвана на пазара.

2. Дезинфектанти с антивирусни свойства и основни принципи на действие

2.1. Вируси и инфекциозност

Вирусите обикновено са изградени от вирусен капсид, съдържащ нуклеинови киселини (Фиг.1). Нуклеиновата киселина играе роля на матрица за репликацията, докато капсида и асоциираните с него белтъци служат за предпазване на нуклеиновата киселина и за свързване към рецептори на клетката гостоприемник [29].

Фигура 1. Различни типове вируси.

Вирусите не могат да се размножават и увеличават броя си извън клетката гостоприемник. Въпреки това те могат да оцелеят дълго време в това състояние [67]. При среща с подходяща клетка гостоприемник, те я инфектират. Навлизат в клетката и използват клетъчните механизми за собствената си репликация (Фиг.2). Вирусите могат да инфектират клетки, включително бактериални, и могат да предизвикат редица заболявания. Тази ситуация се влошава при липса на ефективно лечение срещу много от вирусите.

Коронавирусите са едноверижни РНК вируси със суперкапсиди. Това означава, че техния генетичен материал се състои от една РНК верига и всяка вирусна частица е опакована в белтъчен суперкапсид (Фиг. 3). Всички вируси по същество следват един и същ път при заразяване на техните гостоприемници. Навлязъл в клетката, вирусът се самореплицира, използвайки някои от клетъчните компоненти. След това вирусните копия заразяват други клетки. РНК вирусите обаче имат една особеност. Тези вируси не могат да коригират грешки, възникващи по време на репликация на РНК, тъй като нямат механизмите за поправка на грешки, които клетките обикновено използват при реплициране на ДНК.

Фигура 2. Четирите етапа на вирусната инфекция в клетъчен модел.

Сред РНК вирусите, коронавирусите са групата вируси с най-дълъг геном- с 30 000 бази. При тези патогени, които нямат способността да коригират грешки по време на репликация, се увеличава вероятността за допускане на грешка, тъй като количеството азотни бази, което се реплицират, също се увеличава. Следователно всяка грешка води до нова мутация. Някои от тези мутации могат да придадат нови свойства на вируса, като например способността да заразява нови клетъчни типове или дори нови щамове. Коронавирусът се състои от четири структурни белтъка: нуклеокапсид, суперкапсид, мембрана и пръчковидни издатини (шипчета). Тъй като тези издатини се наричат „corona“, което на латински означава корона, тези вируси са наречени коронавируси. Нуклеокапсидът съдържа генетичния материал. Той е обграден от сферична структура, формирана от белтъци на суперкапсида и мембраната. Шипчестите издатини идентифицират клетките, които вирусът може да зарази. Чрез тях вирусът се прикрепят към клетъчните рецептори.

Повърхностите, включително нашите ръце, играят важна роля в разпространението на вируси. Вируси като полиовирусите и бактериофагите показват много по-висока преживяемост, когато биват пренесени чрез директен контакт върху повърхности, за разлика от вируси, съдържащи аерозолни капчици или прах. Само 5 секунди контакт с ръка и лице са достатъчни, за да бъде прехвърлена значителна част от вируса, след което вирусите могат да се разпространят чрез докосване на носната лигавица или конюнктивата на окото. Вероятността за разпространение е пряко свързана с времето за оцеляване на вируса върху повърхността, което се различава значително между различните вируси. Съвсем скорошно проучване съобщава, че Covid-19 коронавирусът (SARS-CoV-2) може да се задържи най-дълго върху пропиленови пластмасови повърхности и неръждаема стомана, а активни вируси присъстват до 72 часа след първоначалното приложение, макар и със силно намален вирусен титър [60].

Фигура 3: Илюстрация на SARS-CoV-2 вирус

2.2. Фактори, повлияващи дезинфектантната активност

Основна мярка за ефективността на дезинфектанта е намаляването на вирусната инфекциозност. Измерването на инфекциозността на вируса обикновено се извършва чрез анализи с вирусни носители и суспензионни анализи. Основните параметри, влияещи върху ефективността на дезинфектантите срещу вируси, включват време за контакт и концентрация на дезинфектанта и вируса.

Освен това ефективността на дезинфекцията може да бъде повлияна и от фактори на околната среда. Ако дезинфекцията изисква протичане на определена химична реакция, както например при формалдехида, скоростта на дезинфекция ще бъде по-висока при по-високи температури. В студено време някои дезинфектанти могат да бъдат неефективни, тъй като нивото на дезинфекция ще бъде изключително ниско. Влажността е друг фактор, който може да повлияе на проникването на дезинфектанта във вируса. За реакции като тези при алдехидните дезинфектанти, промяната в pH също може да повлияе ефективността на дезинфектанта.

2.3. Фактори, повлияващи вирусната чувствителност

Вирусите, които биват инактивирани чрез процес на дезинфекция, имат определени уникални свойства. Разграничават се три основни типа вируси с различни структури. Те биват класифицирани по нарастваща трудност на химична инактивация: вируси със суперкапсид, големи вируси без суперкапсид и малки вируси без суперкапсид. Въпреки че има изключения, по-големите вируси обикновено са по-чувствителни към дезинфектанти [32]. Всички тествани дезинфекционни разтвори са ефективни срещу вирусите със суперкапсид- Herpes Simplex и вируса на човешката имунна недостатъчност (HIV) тип 1. Те биват по-малко ефективни срещу малкия вирус без суперкапсид- човешки коксаки вирус. Вирусите със суперкапсид съдържат липидна обвивка, която е от съществено значение за инфекцията. Ако тази обвивката бъде разрушена, това може потенциално да намали вирусното разпространение. За инактивиране на вируси със суперкапсид могат да бъдат използвани липофилни дезинфектанти. Обратно, вируси без суперкапсид използват белтъчна обвивка за осъществяване на инфекция и по този начин инактивирането често изисква денатуриране на вирусни капсидни белтъци или на есенциални репликативни белтъци [36]. Дезинфектанти, разграждащи белтъци, като глутаралдехид или натриев хипохлорит, са ефективни при инактивиране на вируси без суперкасид [32]. Проучвания на базата на електронна микроскопия показват значително структурно разрушаване на фага, включително натриев хипохлорит, инактивиращ бактериофаг PAO1 и увреждащ капсидните белтъци. Въпреки това, тъй като вируси като полиомиелитния вирус поддържат инфекциозност дори само с РНК, дезинфектантът трябва да навлезе, за да унищожи нуклеиновите киселини [32]. Докато грипният вирус със суперкапсид H1N1 може да бъде инактивиран от всички тествани дезинфектанти [16], малките норовируси без суперкасид са много по-трудни за инактивиране и някои често срещани дезинфектанти не могат да намалят потенциала им за осъществяване на инфекция [56].

Вирусите могат да бъдат устойчиви на дезинфекция и поради клетъчните компоненти, с които са свързани. Обикновено вирусите са зависими от клетките гостоприемници, за да се реплицират. Поради това, те често биват свързани с други компоненти като клетъчни остатъци, почва и аерозолни капки. Това са така наречените вирусни агрегационни защитни фактори и могат както да намалят възможността за навлизане на дезинфектанта във вируса, така и да намалят взаимодействието и активността на дезинфектантните съставки. Тези фактори имат голям ефект върху действието на дезинфектантите и поради това е необходима много по-висока концентрация на дезинфектанта за ефективна дезинфекция. Дезинфекцията е свързана и зависима от процесите на почистване, тъй като първичното отстраняване на органичната материя може да допринесе за осъществяване по-добър дезинфекционен процес [14]. В допълнение, вирусите могат да се натрупват в околната среда, което затруднява навлизането и достигането на дезинфектанти до вирусите [15].

Известно е, че COVID-19 е изключително заразно заболяване и може да има много начини за неговото разпространение. Скорошни проучвания показват, че SARS-CoV-2 се разпространява основно чрез микрокапки, разпространявани от човек на човек или чрез докосване на контаминирани повърхности (Фиг. 4) [58]. Известно е, че SARS-CoV-2 има способността да остане в аерозолна форма за повече от 3 часа. Установено е и, че в зависимост от повърхността, човешкия корона вирус може да персистира до 9 дни и при температури над 30 °C. В този контекст, използването на лични предпазни средства (ЛПС) и дезинфектанти е изключително важно. Световната Здравна Организация (СЗО) препоръчва употребата на физични и химични фактори за намаляване на контаминацията чрез дезинфекция на повърхности, особено на често докосвани повърхности като дръжки на врати, маси, столове, парапети и ключове, както и употребата на маски и грижа за личната хигиена. В литературата са описани различни дезинфекциращи агенти, като например натриев хипохлорит, водороден пероксид, алкохоли, сапуни/повърхностноактивни вещества и др. [31].

Фигура 4. Примери за разпространение на вируси чрез повърхности.

3. Комерсиално достъпни вируцидни дезинфекциращи агенти

3.1. Алкохоли

Алкохолите, и по-конкретно изопропиловия алкохол (също известен като изопропанол и пропан-2-ол) и етиловия алкохол (етанол), могат да инактивират широк спектър бактерии, гъби и вируси (Фиг. 5-6). Тези активни съставки играят важна роля в здравните заведения за кожна антисептка и дезинфекция на малки медицински инструменти. Въпреки, че са доказани като ефективни в унищожаването на инфекциозни микроорганизми, алкохолите нямат спороцидни свойства [44] и често биват комбинирани с други основни биоцидно активни вещества за повишаване на ефикасността на дезинфекцията.

Силните биоцидни агенти унищожават вируси и бактерии по различни механизми, например като унищожават клетъчната структура и коагулират и/или денатурират белтъците от които са изградени микроорганизмите. Въпреки, че не са осъществени много проучвания за пълното разбиране на биоцидната активност на алкохола, като цяло е прието, че алкохолите разрушават клетъчните мембрани и денатурират белтъците [4]. Вирусите и много други микроорганизми обикновено са чувствителни на този начин на действие на алкохолите. Проучвания показват, че инкорпорирането на вода в биоцидни системи увеличава ефективността на алкохола, тъй като водата улеснява по-бързото денатуриране на белтъците[44]. Още повече, добавянето на вода значително увеличава ефективността на алкохолите като забавя тяхното изпарение и по този начин увеличава влиянието на алкохолите към вируси и бактерии.

Въпреки това вируцидната активност на алкохола е силно зависима от концентрацията на активни вещества и типа на тест вирусите. Ефективността на алкохолите за инактивиране на вируси зависи от голяма степен от повърхностните свойства на микроорганизма. Общоизвестно е, че вирусите без суперкапсид са по-устойчиви на дезинфектанти, включително алкохоли, отколкото вирусите със суперкапсид.

Докато алкохолите показват ефективност при унищожаването на някои видове вируси, други дезинфектанти като четвъртични амониеви съединения (ЧАС), глутаралдехид и водороден пероксид надминават ефективността им [44]. Поради тази причина дезинфектанти, чиито основни активни съставки са алкохолите, обикновено не се използват за дезинфекция на оборудване, влизащо в контакт с васкуларната система или стерилни тъкани, както и за дезинфекция на околна среда която изисква пълна стерилност в здравните заведения [44]. Използването на изопропилов алкохол също е ограничено, тъй като той инактивира само липидните вируси. Това значително намалява възможностите за по-широко приложение на алкохола като дезинфектант. Тъй като алкохолите са запалими течности, големи количества алкохол увеличават риска и опасността за употреба на тези вещества като дезинфектанти. Точката на възпламеняване на алкохолен разтвор с по-висока концентрация е по-ниска от тази на алкохолен разтвор с по-ниската концентрация [4]. В допълнение, продължителната и повтаряща се употреба на алкохол компрометира целостта на материали като пластмаси и бои. Материалите, които са постоянно изложени на алкохол, могат да претърпят промяна в цвета, да се напукат и подуят поради въздействието на алкохола. Друго предизвикателство при употребата на алкохол е, че той се изпарява бързо при досег с въздуха. По този начин се намалява времето за контакт на алкохола с вируса. Максималната дезинфекция е трудна за постигане, освен ако инструментите не са били потопени във вана с алкохол за известно време.

Фигура 5. Фактори, повлияващи ефективността на дезинфектанти за ръце на алкохолна основа срещу SARS-CoV-2

Въпреки че възможностите на алкохолите са ограничени, те все още се използват широко в различни процедури за активна дезинфекция. Задължително е да се отбележи, че ролята на алкохола като дезинфектант наред с останалите му свойства е все още незаменима. Алкохолите често се използват в болници като ефективен дезинфектант за термометри, инструменти, които контактуват с интактна кожна повърхност и неинвазивни сонди [44]. Повърхностите на медицински инструменти за многократна употреба, които не изискват пълна стерилност, също се дезинфекцират със спирт. Друго предимство на използването на алкохола като дезинфектант е, че той е лесен за употреба. Алкохолните разтвори не оцветяват, изпаряват се бързо, имат ниска токсичност в сравнение с други дезинфектанти и имат мека, приемлива миризма. Тези функции са от решаващо значение в здравните заведения, тъй като те допринасят за ефективността и необходимата дезинфекция на системата.

Фигура 6. Антивирусен механизъм на действие на алкохоли срещу вируси със суперкапсид.

3.2. Сърфактанти

Сърфактантите са амфифилни съединения, които имат както хидрофилна, така и липофилна част. Те биват допълнително класифицирани като катионни, анионни, нейонни и цвитерйонни сърфактанти. Често се срещат като активни съставки в домакинските дезинфектанти и перилни препарати и доказано могат да инактивират вирусите. Вирусите със суперкапсид, като семейството на коронавирусите, което включва SARS-CoV-1, MERS и новия вирус SARS-CoV-2, са податливи на тези съединения. Въпреки това, някои сърфактанти не разчитат на разтварянето на вирусната липидна обвивка за инактивиране на вируса.

3.2.1. Катионни сърфактанти (Четвъртични амониеви съединения)

Четвъртичните амониеви съединения (ЧАС) формират по-голямата част от катионните сърфактанти. Те инактивират вирусите най-вече чрез разтваряне и разрушаване на техния липиден суперкапсид или мембрана. Разработки съобщават, че те запазват вируцидната си активност по-добре в твърда вода, както и в присъствието на анионни остатъци [38]. ЧАС са предпочитани за употреба, защото са относително нетоксични, безцветни и без мирис [19]. Те са добре известни с това, че инактивират вируси със суперкапсид, но тяхната вируцидна активност e зависима от концентрацията, времето на експозиция и температурата. Най-ефективна дезинфекция със сърфактанти, на основата на ЧАС, се постига в комбинация с топла вода и по-дълго време на действие на сърфактанта [30]. Едно от предимствата на дезинфектанти на основата на ЧАС е тяхната относително висока толерантност към наличието на странична органична контаминация. Това е така, защото способността им да инактивират вирусите обикновено не намалява от наличието на органична материя, както се наблюдава при други дезинфектанти като алкохола и хлорните дезинфектанти.

3.2.2. Анионни сърфактанти

Често срещани анионни сърфактанти, използвани в ежедневието, са продукти като сапуни, шампоани, паста за зъби и детергенти [49].

3.2.3. Нейонни и цвитерйонни сарфактанти

Нейонните сарфактанти са най-често използвани като емулгатори. Тези нейонни сарфактанти инактивират вирусите чрез разтваряне на вирусния суперкапсид и разрушаване на нуклеокапсида. Цвитерйонните сарфактанти са молекули, които носят както катионни, така и анионни заряди, но обикновено цялата молекула е неутрално заредена [63]. Механизмът на дезинфекция с цвитерйонен детергент се осъществява чрез вирусно разграждане, а не чрез разтваряне на повърхностните белтъци [8]. Чрез тази си способност те инактивират вирусите, но запазват биологичната активност на повърхностните антигени. Това позволява използването на цвитерйонни детергенти при разработването на ваксини.

3.3. Окислители

Дезинфектанти като натриев хипохлорит, водороден пероксид и пероцетна киселина използват окислителните си свойства, за инактивиране на вирусите. Силните окислители са сред най-ефективните дезинфектанти срещу трудните за инактивиране малки вируси без суперкапсид, като норовирусите [17].

3.3.1. Натриев хипохлорит

Натриевият хипохлорит, активната съставка в белината, е мощен окислител. Разтворена във вода, тя образува хипохлорна киселина, която се редуцирана до вода и хлориден анион [13]. Ефективността на дезинфекцията намалява с повишаване на pH, вероятно поради намаляване на количеството присъстваща хипохлорна киселина [3]. Натриевият хипохлорит действа бързо и е ефективен при ниски концентрации. Установено е, че ефектът му е пропорционален на концентрацията и времето на контакт. Натриевият хипохлорит може да се използва за трудни за инактивация вируси без суперкапсид, като норовирусите.

3.3.2. Натриев дихлороизоцианурат

В сравнение с натриевия хипохлорит, натриевият дихлороизоцианурат има по-дълготрайна дезинфекционна активност, по-толерантен е към присъствието на органична материя и има по-добра обща дезинфекционна ефективност.

3.3.3. Водороден пероксид

Водородният пероксид е мощно широкоспектърно инактивиращо сиединение. При разпадане образува вода, кислород и силно реактивоспособни хидроксилни свободни радикали, които могат да разградят или свържат голямо разнообразие от биомолекули, включително белтъци, нуклеинови киселини и липиди. Водородният пероксид също е ефективен срещу норовируси, въпреки че обикновено изисква по-висока концентрация от натриевия хипохлорит.

3.4. Пероцетна киселина

Пероцетната киселина се разпада по подобен на водородния пероксид начин, за да образува силно реактивоспособни свободни хидроксилни радикали, както и оцетна киселина и кислород [42]. Предлаганата на пазара пероцетна киселина е разработена с цел осигуряване на по-голяма молекулна стабилност и може да бъде разтворена на място, за да формира дезинфектантният разтвор.

3.5. Халогенирани съединения

3.5.1. Повидон-йод

Повидон-йод е широкоспектърно вируцидно средство. Използва се в клиничната практика като стерилизиращ агент, в хирургически тампони, за почистване на кожата на ръцете и предмишниците преди и след операция, както и в продукти за ежедневна употреба като антисептични продукти за измиване на ръце, вода за уста, както и вода за уста, съдържаща по-ниски концентрации на йодофор [12]. Не е подходящ за използване със силиконови продукти като например силиконови катетри, тъй като йодът може да причини по-бързо разграждане на материала. Въпреки че като цяло е по-безопасен и по-ефективен при инактивирането на вируси от много други антисептични средства, при продължителна употреба повидон-йодът може да причини дисфункция на щитовидната жлеза [27] и алергичен контактен дерматит, изискващи внимателен медицински мониторинг [61]. Механизмът на широката вируцидна активност на повидон йод все още не е напълно изяснен. Много вероятно е той да действа по повече от един механизъм. Това намалява вероятността за появата на резистентност, в следствие от случайни вирусни мутации. Има доказателства, че йодът може да блокира рецепторите на вируса, отговорни за свързването към повърхността на клетката гостоприемник [50]. Йодът може и да предотврати разпространението на вируса в други неинфектирани клетки чрез инхибиране на активността на вирусни ензими (напр. невраминидаза), необходими за освобождаването на вируса от клетките гостоприемници [12]. Предполага се, че при вирусите със суперкапсид вирусната мембрана може да бъде дестабилизирана от взаимодействието на йода с мембранни мастни киселини с ненаситени C=C връзки.

3.5.2. Хлорхексидин диглюконат

Хлорхексидинът е широкоспектърен катионен биоцид, открит в много антисептични продукти. Среща се като активна съставка в препарати за измиване на ръце, води за уста, орални гелове, дезинфектанти и консерванти. Хлорхексидинът обикновено не предизвиква дразнене на кожата, задържа се добре върху нея и има бърза бактерицидна активност. Въпреки това, неговата активност е силно зависима от състава. При наличието на анионни сърфактанти, фосфолипиди, органични вещества, включително серум, може да се наблюдава намалена активност. Активността му е зависима и от pH. В сравнение с бактериите, неговата вируцидна активност е по-променлива от повидон-йод. Той е значително по-слабо активен и по-бавно действащ. Като цяло хлорхексидинът е неефективен срещу вируси без суперкапсид (полиомиелитен вирус и аденовируси), но показва променлив потенциал за инактивиране на вируси с суперкапсид.

3.5.3. Хлороксиленол

Хлороксиленолът е халогениран фенолен антисептик. Бива широко използван в дезинфектанти в домакинството, за почистване на рани и за дезинфекция на хирургическо оборудване. Той е най-ефективен срещу бактерии, но има и променлива вируцидна активност. За неговия механизъм на действие срещу вируси и бактерии се знае изненадващо малко, въпреки широката му търговска употреба от дълго време. Обикновено хлороксиленолът е безопасен за външна употреба при хора, но има случаи при които се съобщава, че причинява контактен дерматит и контактна депигментация [62].

3.6. Алдехиди

3.6.1. Формалдехид

Формалдехидът е най-простият алдехид и е изключително силен дезинфектант с много добри свойства за вирусно инактивиране. Обикновено продаван като воден разтвор, наречен формалин, той се използва за инактивиране на вируси при производството на ваксини [35] и в научни изследвания [35]. Като дезинфектант от най-високо ниво, той може ефективно и бързо да инактивира много различни видове вируси, както в разтвор, така и върху повърхности. Той алкилира амино и сулфхидрилните групи на белтъците, както и амино групи в азотните бази на ДНК и РНК [23]. Въпреки това, високата му реактивоспособност го прави вреден за здравето на човека, тъй като причинява дразнене на откритите повърхности на тялото (напр. кожа и очи) [43], има мутагенни свойства и е предполагаем канцероген [52]. В резултат на това той подлежи на строги разпоредби по отношение на използването му като дезинфектант и стерилизиращ агент в болници и здравни заведения, с изключение на употребата му в добре проветриви помещения. Поради тези причини не се използва като дезинфектант в домакинството.

3.6.2. Глутаралдехид

Подобно на формалдехида, глутаралдехидът (известен още като глутардиалдехид) е мощен широкоспектърен дезинфекциращ и стерилизиращ агент. Той е силно ефективен срещу много вируси след кратко време на действие. Въпреки че не се предполага, че е канцерогенен [54], известно е, че причинява дерматит в очите, носа и устата, както и дразнене на лигавиците. Поради тези причини не се използва като дезинфектант в домакинството. Като цяло инструменти от метал, каучук, пластмаса и такива използващи лещи са толерантни към глутаралдехид, но не се препоръчва употребата му за дезинфекция на повърхности които не изискват пълна стерилност, поради високата му цена.

3.6.3. Орто-фталалдехид (OPA)

Орто-фталалдехидът или 1,2-дикарбоксибензалдехидът е друг дезинфектант на високо ниво. Подобно на формалдехида и глутаралдехида, неговите вируцидни свойства са резултат от реакции, при които свързват белтъци и нуклеинови киселини. OPA няма силно доловима миризма и не дразни кожата, очите или носната лигавица [9]. В допълнение, неговата отлична съвместимост с материали [1] му позволява да се използва като дезинфектант в болниците при много случаи, като например при ендоскопи [45] и урологични инструменти. Въпреки това, OPA може да превърне контактната кожа в сива и поради това трябва да бъде изплакван с обилно количество вода или да се използва с лични предпазни средства (напр. ръкавици и предпазни очила). Поради тази причина той не се използва широко като дезинфектант в домакинството.

4. Нанотехнология

4.1. Наноматериали за повърхностна деконтаминация

Нанотехнологията предлага много възможности за развитието на по-ефективни и обещаващи дезинфекционни системи (Фиг. 7). Употребата на маркери, базирани на наночастици, може да подпомогне проучвания за вирусите и механизма на инфектиране на клетките гостоприемници. От базираните на нанотехнологиите проучвания, днес обикновено се разработват такива за повърхности със самопочистващи се свойства [39]. Тези системи могат да имат антимикробна активност или бавно да освобождават химически дезинфектанти, удължавайки продължителността на тяхното действие. Могат да допринесат и за въвеждането на допълнителни функции като реагиращи системи, които доставят активни вещества в отговор на различни стимули, като фототермални, електротермални, фотокаталитични и други [10]. Някои метални наночастици имат широк спектър на действие срещу вируси и други микроорганизми [11]. Rai и колеги [41] правят преглед на литературата за антибактериалния, противогъбичния и антивирусния потенциал на металните наночастици. Според резултатите от това проучване металните наночастици, особено сребърните, могат да се използват като мощно и широкоспектърно антивирусно средство със или без повърхностна модификация. Въпреки това, антивирусната активност на тези наночастици все още не е достатъчно добре проучена.

Днес нанотехнологиите представляват решение на много проблеми в приложенията на дезинфекцията. През последните няколко десетилетия, нанотехнологиите се доказаха като една обещаваща нова технология за синтезата на наноматериали. Това са частици с големина до 100 нанометра, които проявяват антимикробния си ефект благодарение на високото съотношение площ/обем и уникалните им химични и физични свойства. Много наноматериали, като металните наночастици и графените нанолистове, имат естествен антивирусен ефект благодарение на техните уникални физикохимични свойства [53]. Обикновено те действат по общ механизъм който включва директно взаимодействие със суперкапсидните или капсидни белтъци на вирусите. По този начин разрушават структурния интегритет и инхибират инфектирането. Някои наноматериали могат и да попречат на вирусната репликация в инфектирани клетки [20, 28, 18]. Необходими са допълнително разработки за употребата на нанотехнологиите като по-ефективни дезинфектанти, както и за постигането на самодезинфектиращи се повърхности, за да бъде увеличена ефективността на инфекциозен контрол и безопасност за здравето и околната среда.

Таблица 1 показва публикувани проучвания и патенти за различни системи, базирани на нанотехнология за приложение като дезинфектанти.

Фигура 7: Схематично представяне на SARS-CoV-2 инфекция и нанотехнологични средства за предотвратяване и контрол на COVID-19.

Вирусът навлиза в клетката чрез ангиотензин-превръщаш ензим 2 (ACE2) рецептор и използване на механизмите на клетката гостоприемник за възпроизвеждане и контаминиране на нови клетки. Нано-базираните материали могат да помогнат в: (1) подобряване на скороста и чувствителността за вирусна детекция; (2) да помогнат за разработването на по-безопасно и по-ефективно лечение и ваксини и (3) подобряване на безошпасността на здравните работници чрез разработването на нано-базирани лични предпазни средства (ЛПС).

Таблица 1. Статии и патенти в литературата за нано-базирани дезинфектанти.

Класификация	Система носител	Матрица
Статия	Нанофилм	Поливинилов алкохол (PVA) Полиолефин (POD) Натриев хлорит (NaClO2)
	Нанокомпозит	Силициев диоксид/Сребро
	Мезо-структуни наночастици	Електрически зареден дезинфектант (CAC-717)
	Наноструктура	Целулоза
	Нанокомпозит	Силициев диоксид/Сребро
	Наночастици	Титаниев диоксид
	Фотокаталитични наноструктурни филми	Титаниев диоксид Силикон
	Полийонни комплексни наночастици (PCNs)	Поли[3-(акриламидо) пропил] Триметиламониев хлорид (PAMPTMA)
	Биогенни наночастици	Желязо Сребро
Патенти	Полимерни наночастици	C1–C4 едновалентни алкохоли и различни липиди
		Поли (млечна-ко-гликолова киселина) (PLGA) есенциално масло
		Полиетиленамин (PEI) Полидиалилдиалкиламониева сол Поли(акриламид-ко-диалил-диалкиламониевхалид) хитозан
		Сулфонилалкилциклодекстрани
	Биогенни наночастици	Сребро
	Фотокаталитични системи	Волфрамов триоксид Паладий
		Винена киселина Титаниев изопропоксид (IV)
	Метални наночастици	Титаниев диоксид Лимонени екстракти
		Сребро
		Сребро Четвъртична амониева сол

4.2. Метални наночастици

Среброто и неговите соли имат дълга история на употреба като антисептик и дезинфектант. Техния широк спектър от биоцидни свойства e добре познат [21]. Сребърните наночастици са най-проучения антивирусен наноматриал. Доказано е, че наночастици със или без покритие могат да инхибират голямо разнообразие от вируси [40]. Вирусите трудно развиват резистентност към този тип на третиране. Това прави тези системи изключително привлекателни за употреба срещу вируси с висока честота на мутация. Установено е, че сребърните наночастици са ефективни както в блокиране на навлизането на вириони в клетката, така и в инхибиране на репликацията вътре в инфектираните клетки. Като цяло сребърните наночастици са ефективни биоциди в малки дози [55], но тяхната потенциална токсичност за хората все още е под въпрос [26]. Съвременните методи позволяват синтез на сребърни наночастици с добре дефинирани форми, размери и полидисперсност. Това са важни параметри, определящи тяхната крайна биоцидна активност, биологична съдба и токсичност [25].

Вируцидните свойства на сребърните наночастици все още не са проучени достатъчно, но първоначалните резултати са окуражаващи. Сребърните наночастици могат да инхибират вируси по редица механизми, включително чрез свързване и взаимодействие с вирусните повърхностни белтъци и чрез денатуриране на ензими чрез взаимодействие с амино, карбоксилни, имидазолни и сулфхидрилни групи [6].

Сребърните наночастици в продукти, се появяват все повече на пазара. Това включва дрехи, превръзки, мазила и материали за опаковката на храни. Техните биоцидни активности са резултат от бавно, продължително освобождаване на сребърни нанопродукти [6]. Въпреки това трябва да се отбележи, че както всички дезинфекциращи агенти споменати по-горе, вируцидната активност на сребърните наночастици се различава от вирус до вирус. Още повече, количеството, формата, размерите и типа на освобождаваните сребърни нанопродукти зависи от тяхното приложение в реалния свят. Всичко това влияе върху техните вируцидни свойства. Следователно, ефикасността на тези продукти срещу вируси в реална обстановка, както и тяхната токсичност за хората трябва да бъдат внимателно оценени и проучени.

Освен сребърните наночастици, златните наночастици (AuNPs) също са обещаващи вируцидни агенти. AuNPs с чеснов екстракт със среден размер от 6 nm показват вируцидна активност срещу морбилния вируса. Те се свързват с повърхностни вирусни рецептори и впоследствие предотвратяват свързване към клетката гостоприемник и предизвикване на инфекция [34]. Въпреки това, поради цената на златните химически прекурсори, дезинфектантите с AuNP са малко вероятно да станат евтини и широко достъпни в търговската мрежа.

През последните години използването на метални наноматериали за създаване на самодезинфекциращи се повърхности придоби значителен интерес поради дългосрочната персистентност на вируси върху контаминирани повърхности. Самодезинфекциращите се повърхности инактивират вирусите, които влизат в контакт с тях in situ, намалявайки възможността за вирусна трансмисия чрез контакт с контаминирани повърхности. В един дизайн самодезинфекциращата се повърхност е оформена с фотоактивни метални нанокристали, за които е необходим стимул от видимата светлина за вирусна инактивация. Тези повърхности, произведени от CuInZn4S6 (CIZS), могат да абсорбират видима светлина и да произвеждат активни окислители. Те могат да инактивират influenza А вируса чрез окисляване на аминокиселинни остатъци, представени в белтъците на вирусния суперкапсид (Фиг. 8). Въпреки че са силно вирусоцидни, практичността на системата е ограничена от присъствието на видима светлина, което е задължително условие, за да бъде гарантиран ефектът на самопочистване.

Фигура 8. Илюстрация на вирусна дезинфекция, използваща самодезинфекцираща се повърхност активирана чрез видимата светлина

---

Тест LO 2.2

---

Литература

1. 1. Akamatsu, T., Minemoto, M., & Uyeda, M. (2005). Evaluation of the antimicrobial activity and materials compatibility of orthophthalaldehyde as a high-level disinfectant. Journal of international medical research, 33(2), 178-187.
   2. Bell, D. M. (2004). Public health interventions and SARS spread, 2003. Emerging infectious diseases, 10(11), 1900.
   3. Block, S. S. (Ed.). (2001). Disinfection, sterilization, and preservation. Lippincott Williams & Wilkins.
   4. Boyce, J. M. (2018). Alcohols as surface disinfectants in healthcare settings. infection control & hospital epidemiology, 39(3), 323-328.
   5. Campos, E. V., Pereira, A. E., De Oliveira, J. L., Carvalho, L. B., Guilger-Casagrande, M., De Lima, R., & Fraceto, L. F. (2020). How can nanotechnology help to combat COVID-19? Opportunities and urgent need. Journal of Nanobiotechnology, 18(1), 1-23.
   6. Castro-Mayorga, J. L., Martínez-Abad, A., Fabra, M. F., Lagarón, J. M., Ocio, M. J., & Sánchez, G. (2016). Antimicrobial Food Packaging.
   7. Christophersen, O. A., & Haug, A. (2006). Why is the world so poorly prepared for a pandemic of hypervirulent avian influenza? Microbial ecology in health and disease, 18(3-4), 113-132.
   8. Conley, L., Tao, Y., Henry, A., Koepf, E., Cecchini, D., Pieracci, J., & Ghose, S. (2017). Evaluation of eco‐friendly zwitterionic detergents for enveloped virus inactivation. Biotechnology and bioengineering, 114(4), 813-820.
   9. Cooke, R. P. D., Goddard, S. V., Whymant-Morris, A., Sherwood, J., & Chatterly, R. (2003). An evaluation of Cidex OPA (0.55% ortho-phthalaldehyde) as an alternative to 2% glutaraldehyde for high-level disinfection of endoscopes. Journal of Hospital Infection, 54(3), 226-231.
   10. Dalawai, S. P., Aly, M. A. S., Latthe, S. S., Xing, R., Sutar, R. S., Nagappan, S., … & Liu, S. (2020). Recent advances in durability of superhydrophobic self-cleaning technology: a critical review. Progress in Organic Coatings, 138, 105381.
   11. Dyshlyuk, L., Babich, O., Ivanova, S., Vasilchenco, N., Prosekov, A., & Sukhikh, S. (2020). Suspensions of metal nanoparticles as a basis for protection of internal surfaces of building structures from biodegradation. Case Studies in Construction Materials, 12, e00319.
   12. Eggers, M. (2019). Infectious disease management and control with povidone iodine. Infectious diseases and therapy, 8(4), 581-593.
   13. Fukuzaki, S. (2006). Mechanisms of actions of sodium hypochlorite in cleaning and disinfection processes. Biocontrol science, 11(4), 147-157.
   14. Gallandat, K., Wolfe, M. K., & Lantagne, D. (2017). Surface cleaning and disinfection: efficacy assessment of four chlorine types using Escherichia coli and the Ebola surrogate Phi6. Environmental Science & Technology, 51(8), 4624-4631.
   15. Gerba, C. P., & Betancourt, W. Q. (2017). Viral aggregation: impact on virus behavior in the environment. Environmental science & technology, 51(13), 7318-7325.
   16. Jeong, E. K., Bae, J. E., & Kim, I. S. (2010). Inactivation of influenza A virus H1N1 by disinfection process. American journal of infection control, 38(5), 354-360.
   17. Girard, M., Mattison, K., Fliss, I., & Jean, J. (2016). Efficacy of oxidizing disinfectants at inactivating murine norovirus on ready-to-eat foods. International journal of food microbiology, 219, 7-11.
   18. Huang, S., Gu, J., Ye, J., Fang, B., Wan, S., Wang, C., … & Cao, S. (2019). Benzoxazine monomer derived carbon dots as a broad-spectrum agent to block viral infectivity. Journal of colloid and Interface Science, 542, 198-206.
   19. Heuschele, W. P. (1995). Use of disinfectants in zoos and game parks. Revue Scientifique et Technique (International Office of Epizootics), 14(2), 447-454.
   20. Jackman, J. A., Lee, J., & Cho, N. J. (2016). Nanomedicine for infectious disease applications: innovation towards broad‐spectrum treatment of viral infections. Small, 12(9), 1133-1139.
   21. Jung, W. K., Koo, H. C., Kim, K. W., Shin, S., Kim, S. H., & Park, Y. H. (2008). Antibacterial activity and mechanism of action of the silver ion in Staphylococcus aureus and Escherichia coli. Applied and environmental microbiology, 74(7), 2171-2178.
   22. Kampf, G., Todt, D., Pfaender, S., & Steinmann, E. (2020). Persistence of coronaviruses on inanimate surfaces and their inactivation with biocidal agents. Journal of hospital infection, 104(3), 246-251.
   23. Kamps, J. J., Hopkinson, R. J., Schofield, C. J., & Claridge, T. D. (2019). How formaldehyde reacts with amino acids. Communications Chemistry, 2(1), 1-14.
   24. Lara, H. H., Garza-Treviño, E. N., Ixtepan-Turrent, L., & Singh, D. K. (2011). Silver nanoparticles are broad-spectrum bactericidal and virucidal compounds. Journal of nanobiotechnology, 9(1), 1-8.
   25. Lee, S. H., & Jun, B. H. (2019). Silver nanoparticles: synthesis and application for nanomedicine. International journal of molecular sciences, 20(4), 865.
   26. Liao, C., Li, Y., & Tjong, S. C. (2019). Bactericidal and cytotoxic properties of silver nanoparticles. International journal of molecular sciences, 20(2), 449.
   27. Lithgow, K., & Symonds, C. (2017). Severe thyrotoxicosis secondary to povidone-iodine from peritoneal dialysis. Case Reports in Endocrinology, 2017.
   28. Liu, H., Bai, Y., Zhou, Y., Feng, C., Liu, L., Fang, L., … & Xiao, S. (2017). Blue and cyan fluorescent carbon dots: one-pot synthesis, selective cell imaging and their antiviral activity. RSC advances, 7(45), 28016-28023.
   29. Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S. L., Matsudaira, P., Baltimore, D., & Darnell, J. (2000). Viruses: Structure, function, and uses. In Molecular Cell Biology. 4th edition. WH Freeman.
   30. Louie, W., & Reuschlein, D. (2011). 8 Cleaning and Disinfection in the Bottled Water Industry. Technology of Bottled Water, 223.
   31. Lukasik, J., Bradley, M. L., Scott, T. M., Dea, M., Koo, A., Hsu, W. Y., … & Farrah, S. R. (2003). Reduction of poliovirus 1, bacteriophages, Salmonella Montevideo, and Escherichia coli O157: H7 on strawberries by physical and disinfectant washes. Journal of food protection, 66(2), 188-193.
   32. McDonnell, G. E. (2007). Antiseptics, disinfection, and sterilization. Types, action, and resistance.
   33. Martini, M., Gazzaniga, V., Bragazzi, N. L., & Barberis, I. (2019). La pandémie de grippe espagnole: une leçon de 100 ans après 1918. J Prev Med Hyg, 60, E64-E67.
   34. Meléndez-Villanueva, M. A., Morán-Santibañez, K., Martínez-Sanmiguel, J. J., Rangel-López, R., Garza-Navarro, M. A., Rodríguez-Padilla, C., … & Trejo-Ávila, L. M. (2019). Virucidal activity of gold nanoparticles synthesized by green chemistry using garlic extract. Viruses, 11(12), 1111.
   35. Möller, L., Schünadel, L., Nitsche, A., Schwebke, I., Hanisch, M., & Laue, M. (2015). Evaluation of virus inactivation by formaldehyde to enhance biosafety of diagnostic electron microscopy. Viruses, 7(2), 666-679.
   36. Nuanualsuwan, S., & Cliver, D. O. (2003). Infectivity of RNA from inactivated poliovirus. Applied and environmental microbiology, 69(3), 1629-1632.
   37. Otter, J. A., Donskey, C., Yezli, S., Douthwaite, S., Goldenberg, S., & Weber, D. J. (2016). Transmission of SARS and MERS coronaviruses and influenza virus in healthcare settings: the possible role of dry surface contamination. Journal of hospital infection, 92(3), 235-250.
   38. Perry, K., & Caveney, L. (2012). Chemical disinfectants. Veterinary infection prevention and control, 129-143.
   39. Querido, M. M., Aguiar, L., Neves, P., Pereira, C. C., & Teixeira, J. P. (2019). Self-disinfecting surfaces and infection control. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 178, 8-21.
   40. Rai, M., Kon, K., Ingle, A., Duran, N., Galdiero, S., & Galdiero, M. (2014). Broad-spectrum bioactivities of silver nanoparticles: the emerging trends and future prospects. Applied microbiology and biotechnology, 98(5), 1951-1961.
   41. Rai, M., Deshmukh, S. D., Ingle, A. P., Gupta, I. R., Galdiero, M., & Galdiero, S. (2016). Metal nanoparticles: The protective nanoshield against virus infection. Critical reviews in microbiology, 42(1), 46-56.
   42. Rokhina, E. V., Makarova, K., Golovina, E. A., Van As, H., & Virkutyte, J. (2010). Free radical reaction pathway, thermochemistry of peracetic acid homolysis, and its application for phenol degradation: spectroscopic study and quantum chemistry calculations. Environmental science & technology, 44(17), 6815-6821.
   43. Rovira, J., Roig, N., Nadal, M., Schuhmacher, M., & Domingo, J. L. (2016). Human health risks of formaldehyde indoor levels: an issue of concern. Journal of environmental science and health, part a, 51(4), 357-363.
   44. Rutala, W. A., & Weber, D. J. (2008). Guideline for disinfection and sterilization in healthcare facilities, 2008.
   45. Rutala, W. A., & Weber, D. J. (2015). Disinfection, sterilization, and control of hospital waste. Mandell, Douglas, and Bennett’s principles and practice of infectious diseases, 3294.
   46. Santos, I. D. A., Grosche, V. R., Bergamini, F. R. G., Sabino-Silva, R., & Jardim, A. C. G. (2020). Antivirals against coronaviruses: candidate drugs for SARS-CoV-2 treatment? Frontiers in microbiology, 1818.
   47. Saunders-Hastings, P., Crispo, J. A., Sikora, L., & Krewski, D. (2017). Effectiveness of personal protective measures in reducing pandemic influenza transmission: A systematic review and meta-analysis. Epidemics, 20, 1-20.
   48. Singh, D., Joshi, K., Samuel, A., Patra, J., & Mahindroo, N. (2020). Alcohol-based hand sanitisers as first line of defence against SARS-CoV-2: a review of biology, chemistry and formulations. Epidemiology & Infection, 148.
   49. Sirisattha, S., Momose, Y., Kitagawa, E., & Iwahashi, H. (2004). Toxicity of anionic detergents determined by Saccharomyces cerevisiae microarray analysis. Water Research, 38(1), 61-70.
   50. Sriwilaijaroen, N., Wilairat, P., Hiramatsu, H., Takahashi, T., Suzuki, T., Ito, M., … & Suzuki, Y. (2009). Mechanisms of the action of povidone-iodine against human and avian influenza A viruses: its effects on hemagglutination and sialidase activities. Virology journal, 6(1), 1-10.
   51. Straughn, J. C., & Barker, F. B. (1987). Avoiding glutaraldehyde irritation of the mucous membranes. Gastrointestinal endoscopy, 33(5), 396-397.
   52. Swenberg, J. A., Moeller, B. C., Lu, K., Rager, J. E., Fry, R. C., & Starr, T. B. (2013). Formaldehyde carcinogenicity research: 30 years and counting for mode of action, epidemiology, and cancer risk assessment. Toxicologic pathology, 41(2), 181-189.
   53. Szunerits, S., Barras, A., Khanal, M., Pagneux, Q., & Boukherroub, R. (2015). Nanostructures for the inhibition of viral infections. Molecules, 20(8), 14051-14081.
   54. Takigawa, T., & Endo, Y. (2006). Effects of glutaraldehyde exposure on human health. Journal of occupational health, 48(2), 75-87.
   55. Tian, X., Jiang, X., Welch, C., Croley, T. R., Wong, T. Y., Chen, C., … & Yin, J. J. (2018). Bactericidal effects of silver nanoparticles on lactobacilli and the underlying mechanism. ACS applied materials & interfaces, 10(10), 8443-8450.
   56. Tung, G., Macinga, D., Arbogast, J., & Jaykus, L. A. (2013). Efficacy of commonly used disinfectants for inactivation of human noroviruses and their surrogates. Journal of food protection, 76(7), 1210-1217.
   57. URL-1: https://www.genome.gov/genetics-glossary/Virus
   58. URL-2: https://news.arizona.edu/story/continuously-active-surface-disinfectants-may-provide-barrier-against-spread-viruses
   59. Vafadar, S., Shahdoust, M., Kalirad, A., Zakeri, P., & Sadeghi, M. (2021). Competitiveexclusionduringco-infection as a strategytopreventthespread of a virus: A computationalperspective. PloSone, 16(2), e0247200.
   60. Van Doremalen, N., Bushmaker, T., Morris, D. H., Holbrook, M. G., Gamble, A., Williamson, B. N., … & Munster, V. J. (2020). Aerosol and surface stability of SARS-CoV-2 as compared with SARS-CoV-1. New England journal of medicine, 382(16), 1564-1567.
   61. Velázquez, D., Zamberk, P., Suárez, R., & Lázaro, P. (2009). Allergic contact dermatitis to povidone-iodine. Contact Dermatitis, 60(6), 348-349.
   62. Verma, G., Mahajan, V., Shanker, V., Tegta, G., Jindal, N., & Minhas, S. (2011). Contact depigmentation following irritant contact dermatitis to chloroxylenol (Dettol). Indian Journal of Dermatology, Venereology and Leprology, 77(5), 612.
   63. Viana, R. B., da Silva, A. B., & Pimentel, A. S. (2012). Infrared spectroscopy of anionic, cationic, and zwitterionic surfactants. Advances in physical chemistry, 2012.
   64. Weng, D., Qi, H., Wu, T. T., Yan, M., Sun, R., & Lu, Y. (2012). Visible light powered self-disinfecting coatings for influenza viruses. Nanoscale, 4(9), 2870-2874.
   65. Wilton, T., Dunn, G., Eastwood, D., Minor, P. D., & Martin, J. (2014). Effect of formaldehyde inactivation on poliovirus. Journal of virology, 88(20), 11955-11964.
   66. World Bank. (2016). 2014–2015 West Africa Ebola crisis: impact update.
   67. Yeargin, T., Buckley, D., Fraser, A., & Jiang, X. (2016). The survival and inactivation of enteric viruses on soft surfaces: a systematic review of the literature. American journal of infection control, 44(11), 1365-1373.

Резюме

В борбата с настоящата пандемия от COVID-19, наноматериалите могат да бъдат отлични кандидати срещу вирусни инфекции, особено срещу коронавирусни. Това се дължи на възможността им лесно да пенетрират клетката, да взаимодействат с вирусите и да инхибират възпроизвеждането на вирусния геном. В допълнение, използването на наночастици позволява детектиране на инфекциозни агенти в малки обеми проби. Те представляват чувствителна, прецизна и бърза форма за откриване на инфекциозни частици, при това с по-малко разходи от сега използваните технологии. Този напредък в ранната детекция позволява точно и бързо лечение.

Ключови думи/фрази: наноматериали, COVID-19, детекция

1. Въведение

Продължаващата експлозивно разпространени на новата коронавирусна болест COVID-19 привлича внимание в световен мащаб поради удължения си инкубационен период и значителна инфекциозност. Бързото разпространение на пандемията в световен мащаб, инициирано от SARS-CoV-2, създаде належаща необходимост от диагностика и лечение на заболяването. В резултат на това много изследователи се стремят да намерят най-ефективните и подходящи методи за детекция и лечение на SARS-CoV-2. Полимеразната верижна реакция с обратна транскриптаза в реално време (RT-PCR) в момента се използва като един от най-надеждните подходи за откриване на новия вирус. Този процес обаче отнема време, трудоемък е и изисква обучен лабораторен персонал. Освен това, въпреки високата специфичност, са документирани фалшиво-отрицателни резултати, особено от неназофарингеални проби, които могат да имат по-ниско вирусно натоварване. Следователно, разработването и използването на по-бързи и по-надеждни методи изглежда има изключително значение. През последните години бяха направени много опити за производство на различни биосензори на базата на наноматериали, с цел детекция на вируси и бактерии в клинични проби [27, 46].

За да се справим със съществуващите и предстоящите глобални заплахи за здравето на човека е необходимо използването надежден начин за диагностициране на коронавирусното заболяване COVID-19. Наночастиците предлагат едно удачно приложение и значителни перспективи да функционират като платформа за бързо диагностициране на вирусна инфекция с висока чувствителност. За детекцията на SARS-CoV 2 могат да бъдат използвани златни наночастици, магнитни наночастици и графен (G). Прилагат се в молекулярната диагностика и в серологични подходи. Наночастиците съкращават времето, необходимо за диагностика. Те могат да бъдат приложени в малки устройства, които насърчават самодиагностицирането у дома или на места като летища и магазини. Методи, базирани на наночастици, могат да бъдат използвани за анализ на контаминирани с вируси проби от пациент, повърхност и въздух [1].

2. Съвременни методи за детекция на SARS-CoV-2

Конвенционални методи за откриване на SARS-CoV-2 са полимеразната верижна реакция с обратна транскрипция (RT-PCR), компютърната томография (CT) и секвенирането от следващо поколение (NGS) [1, 26, 40] (Фиг. 1). Типичните диагностични техники за откриване на COVID-19 са RT-PCR и CT на гръдния кош. В процес на разработка са и други диагностични методи, като CRISPR, SHERLOCK, RT-LAMP, ELISA и секвениране. Те могат да подобрят точността и да сведат до минимум времето за детекция на вируса [1, 9]. RT-PCR е признат като водещия и най-ефективен метод за коронавирусна детекция [1, 26].

Фигура 1. Конвенционални методи, използвани за детекцията на SARS-CoV-2. (A) Полимеразна верижна реакция с ензима обратна транскриптаза (RT-PCR). кДНК, комплементарна ДНК. (B) Компютърна томография. (C) ELISA анализ.

2.1. 2.1. Полимеразна верижна реакция с ензима обратна транскриптаза (RT-PCR)

RT-PCR се използва широко за детекцията на COVID-19. Базира се на синтеза на кДНК от геномна РНК, последвано от амплификация [26, 38]. Амплификацията на минимални количества вирусен генетичен материал в смес с други нуклеинови киселини се извършва ефективно чрез RT-PCR. Понастоящем тази техника е златният стандарт за откриване на SARS-CoV-2 в проби, взети от горните дихателни пътища. В няколко проучвания са използвани проби от серум, очи и изпражнения за осъществяване на RT-PCR-базирана детекция. Друг метод използва самостоятелно взети проби от слюнка като една неинвазивна и сигурна техника за медицинския персонал преди извършване на RT-PCR. При този метод, обратната транскриптаза първо превръща вирусния РНК геном в ДНК, като използва къса последователност от нуклеотиди – праймер и генерира комплементарна ДНК (кДНК). След това чрез флуоресцентно багрило или флуоресцентно белязана специфична последователност от ДНК се проследява амплификацията на ДНК в реално време. И накрая, чрез флуоресцентен или електрически сигнал се детектира вирусната кДНК след няколко последователни амплификационни цикъла [1, 9, 22].

Конвенционалните RT-PCR анализи включват едноетапни или двуетапни подходи. Едноетапните методи използват една епруветка, съдържаща както компонентите за обратната транскрипсция, така и за амплификацията. Двуетапната процедура разделя двата процеса. Тя осигурява по-предпазливи и гъвкави условия за работа. Също така, при този метод кДНК може да бъде съхранена за количествено определяне на различни цели с по-малко изходни материали. Въпреки това, стандартният метод за откриване на SARS-CoV-2 е едноетапният подход, тъй като е по-бърз, изисква по-малко манипулиране на пробите, намалява времето за анализ и намалява грешките при пипетиране [9, 43].

Детектирането, базирано на RT-PCR, също е свързано с фалшиво-отрицателни резултати, което може да се дължи на нисък вирусен товар в гърлото на пациентите, неправилно боравене с РНК пробите или липса на достатъчно вътрешни контроли [8, 9, 16]. Основният проблем на RT-PCR е неговата ниска чувствителност към анализиране състоянието на белите дробове. Друга пречка е ниската чувствителност при анализ на кръвни проби поради малките количества вирус в кръвта [26].

2.2. Компютърна томография (CT)

AДруг метод за детектиране и справяне със заболяването COVID-19 е компютърната томография на гръдния кош. При нея се използва рентгеново изображение на гръдния кош на пациента под различни ъгли. Според радиологичните доклади, всички необичайни характеристики на изображението от компютърната томография може да се дължат на заразяване с COVID-19. Типично наблюдаваните характеристики при сканиране на гръдния кош на пациент с COVID-19 са изменения, наречени „непрозрачност тип матово стъкло“ (GGO), особено на периферните и долните лобове, консолидации (повишаване на непрозрачността на паренхима, което води до покриване на подлежащите съдове), промени тип „crazy-paving“ (GGO с интралобуларно и интерлобуларно септално удебеляване) и линейни непрозрачности. CT с висока разделителна способност може да помогне при детектиране на GGO в ранните етапи на инфекцията [9, 26, 40].

CT чувствителността е по-висока при пациенти с положителен RT-PCR (86–97% в различни проучвания) и по-ниска при пациенти с общи и нереспираторни симптоми (около 50%). Ултразвукът също се използва като диагностичен инструмент в малък брой случаи. Ултразвукът има много ниска специфичност и въпреки че се влияе от заболяването, теглото на пациента и сръчността на оператора, чувствителността при този метод се оценява на около 75%. Въпреки това, ултразвукът може да играе роля в наблюдение на напредването на заболяването чрез детекция на характеристики на интерстициална белодробна болест [26].

2.3. SHERLOCK

В допълнение към RT-PCR и CT, за детекцията на SARS-CoV-2 са разработени и други техники. Както е описано от Gupta et al., SHERLOCK е разработен от Zhang et al. [45] „за детектиране на РНК фрагменти на SARS-CoV-2 с концентрация 10–100 копия/μl. Основният принцип на SHERLOCK- базираната диагностика е детектиране, базирано на CRISPR. Този тест може да бъде извършен за < 60 минути, без необходимост от специфични инструменти. Те избират два целеви гена, S гена и Orf1ab гена, от генома на SARS-CoV-2. За да се сведе до минимум кръстосаната реактивност с други респираторни вирусни геноми, те избират и специфични насочващи секвенции.“ [9].

2.4. RT-LAMP

Оптимизираният метод за детекция, базиран на RT-LAMP, има по-голяма чувствителност от традиционните RT-PCR методи и изисква по-малко време (фиг. 2). В резултат на това този процес може да се използва за бързо диагностициране на коронавирусни заболявания и увеличаване на капацитета за тестване с 2–2,5 пъти [9, 13].

Фигура 2. . Сравнение на работния процес при RT-LAMP и qRT-PCR анализи при спешни случаи (амбулаторни пациенти) и болнични пациенти. RT-LAMP анализа е 2–2,5 пъти по-бърз от qRT-PCR анализите и пробата може да бъде транспортираа при стайна температура

Gupta et al. обобщават настоящите техники за детекция на инфекция от SARS-CoV-2 във Фиг. 3 [9].

Фигура 3. Техники, използвани за детекция на тежък остър респираторен синдром коронавирус 2 (SARS-CoV-2).

3. 3. Наноматериали за детекция на SARS-CoV-2

Настоящият метод за детекция на COVID-19 инфекция е тестване на нуклеинова киселина чрез полимеразна верижна реакция и обратна транскрипция (RT-PCR). Въпреки че RT-PCR се използва широко за откриване на COVID-19, при този метод има няколко проблема [3, 14, 29, 35].

1. Фалшиво-отрицателни резултати;
2. Отнема много време;
3. RT-PCR не е способен да детектира асимптомни пациенти, тъй като е необходимо присъствие на SARS-CoV-2 в събраните проби;
4. Слаба аналитична чувствителност;
5. Трудоемък;
6. Здравните центрове в извънградски условия нямат адекватна PCR инфраструктура, която да поеме големи количества проби;
7. Скъп;
8. Наличието на RT-PCR китове и реагенти не може да отговори на нарасналото търсене.

Настоящата ситуация изисква разработване на техники за детекция, които са бързи, рентабилни и лесни за работа. За да се преодолеят ограниченията на традиционните методи, е необходим подобрен мултидисциплинарен подход. Технологичните решения, базирани на наноматериали, предоставят различни възможности за борба с вируса [10, 32].

3.1. Свойства на наноматериалите

Уникалните характеристики на наночастиците играят решаваща роля в справянето с пандемията и смекчаването на бъдещи епидемии. Наночастиците показват отличителни свойства като:

• малък размер;
• разтворимост;
• мултифункционалност;
• възможност да се насочват към желана цел;
• реагиращи на стимул;
• голяма повърхностна площ;
• повърхностна адаптивност

Поради това те се използват широко за приложения в различни области като аналитична химия, фармация, като сензори/биосензори, в биотехнологиите, наномедицината, за доставяне на лекарства, за биологична детекция, трансфер на гени, в оптиката, при заздравяване на рани, намират енергийни, селскостопански и екологични приложения. Наночастиците подобряват тези приложения, като предоставят повишена производителност със значителна перспектива за внедряване в миниатюрна техника, включително преносима електроника. Следователно, те показват огромен потенциал за подобряване на качеството на живот чрез регулиране на вирусното разпространение чрез навременна детекция. Наночастиците имат поне една размерност в нанометровия диапазон (1 nm =10-9) (Фиг. 4) [1, 15, 30, 36].

Фигура 4. Скала на наночастиците с някои примери.

Високото съотношение повърхност към обем на наночастиците, високата адсорбция, квантовите ефекти и високата реактивоспособност позволяват ефективно взаимодействие с аналитите на пробата. Освен това, те имат изключителни мултиплекс способности, което ги прави подходящи за включване в най-съвременните технологии за детекция на вируси. Наночастиците предлагат и лесна повърхностна функционализация, което предполага, че множество лиганди могат да бъдат прикрепени чрез ковалентни или нековалентни връзки. Това допълнително подобрява селективността и намалява времето за детекция. В допълнение, наноматериалите могат да се използват и като маркери за увеличаване на детектирания сигнал, което помага за детектиране на сигнали с много нисък магнитут [32].

3.2. Категории наноматериали

Създадени са различни наноматериали за детекция и проследяване на вируси, като [11]:

• Метални наночастици, например златни наночастици (Au NPs), сребърни наночастици (Ag NPs);
• Наночастици от метален оксид, например магнитни наночастици от железен оксид (Fe3O4 NPs);
• Въглеродни наноматериали, включително 0-измерни (0D, например фулерени (C60), въглеродни точки (C-точки)), 1D (въглеродни нанотръби (CNTs), 2D (например графен (G), графенов оксид (GO), и 3D (например графит);
• Квантови точки (KT): CdS KT, CdTe KT, въглеродни KT;
• Порести материали: метало–органични рамки (MOFs), ковалентни органични рамки (COFs);
• Полимери: естествени полимери (например хитозан, целулоза), и синтетични (например политиофен, полипирол);
• Липидни наночастици (LNPs): триглицериди, мастни киселини, стероиди и восъци

Фигура 5..Схема, показваща различни примери за CoV детекция чрез методи, базирани на наноматериали. (a) Флуоресцентни Zr KT и магнитни наночастици се свързват с антитела, които свързват специфично CoV. При наличие на CoV се формира магнитен флуоресцентен комплекс. Той бива магнитно изолиран и детектиран чрез флуоресцентни измервания. (b) Нанокапаните се използват за концентриране на CoV и подобряване на неговата стабилност, като по този начин се улеснява детекция му. (c) PCR с обратна транскрипция при наличието на наночастици подобрява ефективността на полимеразната верижна реакция, подобрявайки чувствителността на този метод. (d) Метод за детекция на CoV, базиран на взаимодействието между комплементарна ДНК от CoV и acpnPNA сонда на повърхността на Ag NP. Това взаимодействие води до разделяне на Ag NP и получаване на жълт цвят, асоцииран с луминесценция на добре диспергирани Ag NP, допълнително разкриващи присъствието на CoV.

Фигура 6. Различни наночастици.

Наноматериалите могат да бъдат използвани за различни цели при COVID-19. Rasmi et all обобщават функциите и основната роля на наноматериалите в таблицата по-долу (Фиг. 7) [30].

Фигура 7. Обобщение на ролята на наноматериалите при COVID-19.

3.2.1. Златни NPs (Au NPs)

Златните наночастици (AuNP) се използват все повече в платформите за откриване на SARS-CoV-2 поради техните забележителни оптични свойства, като повишени коефициенти на екстинкция и регулируем локализиран повърхностен плазмонен резонанс (LSPR), позволяващ различно цветно отчитане с просто оборудване или с невъоръжено око. За откриване на антитела срещу SARS-CoV-2 (IgG, IgM или IgA) са предложени анализи на базата на AuNP и флуоресцентни наночастици [17].

Златните наночастици (AuNP) са един от най-често използваните наноматериали за бърза диагностика. Златната наночастица са използва за детекция на двойноверижна ДНК (двДНК) на таргетни вируси. По-конкретно, едноверижна ДНК (евДНК) или едноверижна РНК може да взаимодейства с цитратни йони на повърхността на AuNP. Добавянето на сол към разтвора може да стабилизира частиците и да промени цвета. Прилага се и прост колориметричен хибридизационен анализ за детектиране на двДНК, получена от евРНК на SARS-CoV. Този анализ може да свърже целта при 4,3 nM за 10 минути, без да е необходимо никакво устройство [18, 30].

Подход при който се променя цвета

Друг анализ предоставя метод за визуално откриване на вируса на COVID-19, без необходимостта от сложни инструменти. Проектирана е колориметрична детекция с помощта на AuNPs, покрити с тиол-модифицирани антисенс олигонуклеотиди (ASOs). Тиол-модифицираните ASO-cap AuNP селективно агрегират в присъствието на таргетната РНК последователност на SARS-CoV-2 и променят повърхностния плазмонен резонанс. Резултатът може да бъде наблюдаван след 10 минути при детекционна граница от 0,18 ng/μL [23, 30].

Фигура 8: Схема на селективна детекция с невъоръжено око на SARS-CoV-2 РНК, опосредствана от подходящо проектирани ASO-cap AuNP

Разработен е ефективен метод за детекция на COVID-19 чрез имобилизиране на белтъци върху повърхността на Au с помощта на Au-свързващи полипептиди. Чрез зелен флуоресцентен белтък, SARS-CoV-E белтъка и стрептавидин от Streptomyces avidinii имобилизират Au-свързващ полипептиден фузионен белтък върху AuNP. Тези комплекси взаимодействат с антитялото, което води до абсорбция и промяна на цвета [25, 30].

 Неинвазивен подход

ThПредложен е неинвазивен подход за детекция на COVID-19, използващ издишан въздух и AuNP-базиран сензор. Сензорът се състои от различни AuNP, прикрепени към органични лиганди и филм от неорганичен наноматериал. Неорганичният филм има електрическа проводимост. Следователно, когато е изложен на летливите органични съединения (ЛОС) от издишания дъх, органичният филм реагира с ЛОС, което води до подуване или свиване на неорганичния филм и промяна в електрическата проводимост. Следователно, този неинвазивен сензор може потенциално да се използва за бърз скрининг на COVID-19 [30, 32].

Подход с електрохимична хибридизация

Открит е AuNP-базиран електрохимичен хибридизационен метод, използващ генен сензор, състоящ се от тиолирана ДНК сонда, имобилизирана върху AuNPs въглероден електрод. Сондата хибридизира биотинилирана таргетна ДНК. Електрохимичен чип се свързва чрез въглеродния електрод, съставен от AuNP масив. Коронавирусният белтък се свързва върху AuNP-електрод и коронавирусният белтък и свободните вируси се конкурират за място на свързване при наличието на антитела. Има отлични линейни резултати на сензорен отговор и концентрация на коронавирус, вариращи от 0,001 до 100 ng mL−1. Анализът достига детекционна граница от 1,0 pg mL-1. Методът е едноетапен, чувствителен и прецизен (Фиг. 9) [17, 30].

Фигура 9. CоV имуносензорен чип (a), етапи на произвеждане на имуносензора (b), детекционния процес на конкурентния имуносензор за вируса (c).

Имунохроматографски подход

Чрез подхода на индиректната имунохроматография е предложен латерален поточен анализ за бърза детекция на IgM срещу COVID-19. Върху аналитична мембрана са разположени нуклеопротеинът SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2 НП) и античовешки IgM, конюгиран със AuNP, работещ като детекционен репортер. AuNP-ЛП анализа показа забележителна селективност при детекцията на IgM без интерференция от други вируси. Всеки анализ се нуждае само от 10–20 μL серум и резултат може да бъде получен в рамките на 15 минути [12, 30].

3.2.2. Квантови точки (КТ)

Квантовите точки (КТ) са още един механизъм, чрез който може да се борим с вируса COVID-19. Квантовите точки (КТ), известни също като „полупроводникови наноматериали“, играят жизненоважна роля в детектирането на COVID-19. КТ са признати като нова флуоресцентна сонда за молекулярна детекция. Размерът на КТ варира от 1 до 10 nm. Изключителните характеристики на КТ, включително страхотните им оптични и полупроводникови свойства, фотостабилност, висок квантов добив и тесен емисионен спектър, ги правят сериозен кандидат като флуоресцентни маркери. Поради тези изключителни свойства KT могат да се считат за чудесно средство за борба с вирусни инфекции. Освен това, чрез инкорпорирането на биосъвместими носители може да се осъществи интердисциплинарното проучване, което да позволи клинични подходи при борбата с вируса. Благодарение на техните превъзходни свойства, KT в момента са доминиращи сонди (хемосензори и биосензори) [21, 30].

Фигура 10. Описание на механизма на действие на AuNP-ЛП ленти.

КТ се използват поради тяхната проследимост под светлина с определена дължина на вълната. В допълнение, КТ могат да бъдат моделирани в желания размер (1–10 nm) и форма, която ефективно се насочва/прониква в SARS-CoV-2, с размери между 60 и 140 nm. Освен това положителният повърхностен заряд на КТ на основата на въглерод може да се използва за изолиране/деактивиране на S-белтъка на SARS-CoV-2. В допълнение, катионните повърхностни заряди на КТ, взаимодействат с отрицателната РНК верига на вируса, насочвайки към производството на реактивоспособни кислородни видове в SARS-CoV-2 [21].

Създаден е чип, базиран на КТ-конюгиран РНК аптамер, за чувствителна и бърза детекция на SARS-CoV N-белтък с граница на детекция от 0,1 pg mL−1. КТ-конюгираният РНК аптамер може да се свърже с SARS-CoV N-белтъка, имобилизиран върху чипа, създавайки оптичен сигнал. Използването на флуоресцентни КТ може да помогне на изследователите при проектирането на лесен, чувствителен и бърз диагностичен инструмент за COVID-19 [30, 31].

Фигура 11. Схема на действието на КТ върху SARS-CoV-2. КТ, квантова точка; S-белтък, шипчест белтък; SARS-CoV-2, тежък остър респираторен синдром коронавирус тип 2

Въглеродни квантови точки

Въглеродните квантови точки (CКТ) могат да се използват като биосензори за микроорганизми, биомолекули и инфекции. В допълнение, те могат да се използват в биосъвместими системи за инактивиране на патогенни човешки коронавирусни инфекции като доминантни сонди за визуализация (хемосензори и биосензори) с антивирусна активност. CКТ имат размери около 10 nm и могат да се разтварят добре във вода. Те се синтезират чрез хидротермална карбонизация на въглеродни прекурсори. Някои иновативни подходи за детектиране на коронавируси са фокусирани върху прилагането на CКТ. При един от методите антивирусната активност на седем вида CКТ е използвана за лечение на човешки коронавирусни инфекции. Използвани са различни видове CКТ, получени чрез хидротермална карбонизация и конюгиране на боронова киселина. Описано е, че инхибирането на вируса вероятно се дължи на обмена на химични групи между CКТ и рецепторите на вируса [10].

Циркониеви квантови точки (Zr КТ)

Цирконият, благодарение на свойства като механична стабилност, термична устойчивост и улавяне на UV светлина, се използва в много биомедицински направления. Освен това, наноразмерът на Zr има уникални физични и химични аспекти, дължащи се на голямата му повърхностна площ и електронни състояния [10].

Като цяло използването на КТ срещу коронавируса е един от най-подходящите избори поради изключителната му медицинска ефективност. Освен това, КТ могат да се използват като стабилна сонда за визуализация и сензор в диагностиката и прогнозирането. В допълнение, повърхността на КТ може да бъде покрита с лекарства за таргетиране на COVID-19. Въпреки това, те трябва да бъдат прилагани внимателно, за да бъдат избегнати бъбречна инфилтрация и допълнителни странични последици.

3.2.3. Въглеродни наноматериали

Въглеродните материали са функционални във всеки аспект от нашето ежедневие, защото те са многобройни и леки тъкани, които могат да бъдат използвани в множество приложения. Базираните на въглерод наноматериали могат да бъдат категоризирани въз основа на техните размерности (D) като например нула измерни (0D) (въглеродни точки), едно-измерни (1D) (при CNT) и дву-измерни (2D) (в графеновите наноструктури). Тези наноматериали поддържат по-широк диапазон на работна температура и по-широк обхват на трансдуциращ сигнал дори в екстремни ситуации на околната среда [24].

Въглеродните наноматериали са широко използвани при разработването на методи за детекция на COVID-19. Техните изключителни физикохимични и антивирусни характеристики показват, че наноматериалите играят жизненоважна роля в борбата срещу COVID-19. Тези наноматериали (графен и графенов оксид, въглеродни квантови точки, въглеродни нанотръби и фулерен) с отлични свойства, главно като биосензорност, антивирусни и антимикробни свойства, представляват една по-добра алтернатива за потенциални приложения като биосензори за диагностика, антивирусно покритие, филтриране на вируси разпространявани по въздушно-капков път, маски за лице и целево освобождаване на лекарства в организма [10, 24, 30].

 Графен и графенов оксид

Наноматериалите графен и графенов оксид имат две размерности, както и антимикробни и антивирусни свойства. Поради това те привличат голямо внимание и са обект на много изследвания. Разработени са графен-базирани полеви транзистори (FET) като сензори за анализиране на COVID-19 вирусен товар в клинични назофарингеални проби, използвайки антитела срещу неговия шипчест белтък. Разработените FET сензори могат да уловят SARS-CoV-2 шипчестия белтък във фосфатно буфериран физиологичен разтвор и 100 fg mL−1 медицинска течна транспортна среда, при концентрация 1 fgm L−1 и граница на детекция ~1,6 × 101 pfu mL-1 и ~2,42 × 102 pfu mL-1 съответно за култивирана проба и медицински тест. Този сензор показва, че е силно чувствителен към скрининг и диагностика на новото коронавирусно заболяване от 2019 г. и за него не е необходима предварителна обработка на пробите. Употребата на графен води до подобрено съотношение сигнал/шум [10].

Фигура 12. Схема на определени алотропни форми на въглеродни наноматериали за разработване на нанобиосензори

Въглеродни нанотръби

Въглеродните нанотръби (CNTs) биват широко използвани в биологични и биомедицински проучвания поради следните характеристики, с които отварят нови хоризонти за научно развитие [10]:

• 10− 100 nm в диаметър;
• антивирусна и антимикробна активност;
• добра ефективност на преобразуване на светлината в топлина;
• голямо съотношение повърхност/обем;
• ниска плътност;
• малък размер на порите;
• гъвкавост;
• резистентност към киселини и основи;
• добра механична здравина;
• способност за създаване на реактивоспособни кислородни видове;
• резистентност към респираторни капки;
• биологична съвместимост с няколко лекарства.

Въглеродните точки са открити през 2004 г. Те обикновено притежават фотолуминесцентни свойства и са биосъвместими и силно устойчиви. Тези характеристики ги правят подходящи за прилагане в различни сфери, включително биосенсинг и биовизуализация. Въглеродните нанотръби (CNT), графенът и въглеродните точки (CТ) могат да бъдат класифицирани като нула- (0D), едно-(1D) и дву-(2D) измерни въглеродни наноматериали [10, 30].

Фигура 13. Бъдещи перспективи на въглеродните нанотръби в профилактиката, диагностиката и лечението на SARS-CoV-2 инфекции.

Голямо пространство за съхранение, голяма повърхностна площ, висока биосъвместимост, отлично преминаване през биологични мембрани, относителна степен на биоабсорбция, и целева модификация на биомолекули са отлични свойства на CNT, които предоставят нови възможности за взаимодействие с COVID-19. CNT се използват като системи за диагностика и филтриране и като средство за инактивиране на вируси [10].

Проектирано е микроустройство с регулируем размер на CNT (CNT-STEM), което има за цел да концентрира вируси от сурови проби. CNT могат да се използват за диагностициране на респираторни вируси, включително SARS-CoV-1 и SARS-CoV-2. Страничната стена на канала в микроустройството е произведена от легирани с азот многостенни CNT, където интратубулното пространство между CNT е оптимизирано, за да съответства на размера на различни вируси. С помощта на това устройство беше определен щамът на вируса на птичия грип. CNT-STEM значително подобрява честотата на изолиране на вируса и детекционната чувствителност. Поради лесното приложение и надеждността на тази техника, тя може да бъде модифицирана за откриване на SARS-CoV-2 РНК или белтъци [30, 34].

Фигура 14. Принцип на работа на вирусно обогатяване и концентриране от полеви проби. (A) Пробата, съдържаща вируси (лилави сфери), се взема с помощта на памучен тампон или като тъканна проба. (B) Супернатантата от полевата проба преминава през CNT-STEM и вирусите се концентрират в устройството. Вмъкване (вдясно): Илюстрация на базирано на размера вирусно обогатяване от подравнените N-MWCNT. Вмъкване (долу вдясно): SEM изображение на H5N2 AIV вириони, уловени от N-MWCNT. Вмъкване (долу вляво): TEM изображение на концентриран H5N2 AIV, след като N-MWCNT структурите биват отделени от CNT-STEM.

Нанодиаманти

Поради високата им стабилност и ниска цитотоксичност, към нанодиамантите има значителен интерес за диагностика на COVID-19. Флуоресцентни нанодиаманти се използват като ултрачувствителни маркери в латерален поточен имуноанализ на COVID-19. Тези нанодиаманти са имобилизирани върху тестовата подложка и чрез микровълново поле селективно техния флуоресцентен сигнал се отделя от фоновия сигнал. Това значително подобрява чувствителността на детекция. Този анализ е 105 пъти по-чувствителен от традиционния латерален поточен анализ със златни наночастици. Въглеродните наноматериали могат да се използват като антивирусно терапевтично средство за COVID-19 [30].

3.2.4. Магнитни наночастици (MNPs)

Mагнитните NP (MNP) обикновено се използват за детектиране на SARS-CoV-2, имунен отговор на гостоприемника и разделяне на нуклеинови киселини. Доказано е, че NP от железен оксид със силикатно покритие се свързват с РНК на SARS-CoV-2, след като вирусът бива лизиран. За изолиране на свързаните с РНК NP от разтвора се използва магнит. Този метод е икономичен и лесен, позволявайки ефективна екстракция на РНК от проби [15, 30].

Прецизната детекция изисква ефективна екстракция и разделяне на нуклеиновите киселини от пробата, позволявайки целево пречистване. В едно проучване са използвани суперпарамагнитни наночастици (80 nm), конюгирани със сонда, комплементарна на таргетната последователност в SARS-CoVs. Чрез магнит, функционализираните суперпарамагнитни наночастици могат да екстрахират таргетната кДНК от пробата. Количеството на екстрахираната ДНК се увеличава чрез PCR, използващ флуоресцентни наночастици със силико-покритие, конюгирани с комплементарната последователност. Флуоресцентните наночастици със силико-покритие отделят флуоресцентен сигнал, пряко свързан с концентрацията на целевата кДНК [30].

Повърхностно функционализираните MNP адсорбират нуклеиновата киселина от лизиращия разтвор и биват отделени от повечето контаминанти с помощта на външно магнитно поле. След тази кратка процедура, нуклеиновата киселина може да бъде допълнително пречистена, като се отдели от функционализираната повърхност на MNP чрез процес на десорбция в елуента. Въпреки че този процес е много по-лесен и по-кратък от традиционните процедури, MNP асистирания екстракционен процес все още се състои от няколко етапа, неподходящи за практическа детекция. Наночастиците от цинков ферит се синтезират чрез продължително изпарение, а повърхността на наночастиците е функционализирана със силициев диоксид и карбоксил-модифициран поливинилов алкохол. Тази платформа демонстрира способност за бързото и лесно премахване на вирусната РНК от различни видове проби. Този метод намалява функционалните стъпки, което предоставя значителна перспектива за диагностика на COVID-19 на молекулно ниво [30, 34].

Наличен е по-опростен съвременен протокол за MNP асистирана РНК екстракция и RT-PCR-базирана диагностика на COVID-19. MNP от цинков ферит (ZNF) могат да бъдат синтезирани по рентабилния зол-гел самовъзпламенителен метод. След това повърхността им се функционализира чрез полимери, съдържащи карбоксилни групи (CPoly). От магнитните съединения е избран цинковият ферит поради неговата висока химическа устойчивост, добро магнитно поведение, лесна подготовка и биосъвместим характер. Благодарение на здравата връзка между нуклеиновите киселини и карбоксилните групи, повърхностно функционализираните MNP промотират бърза и ефективна адсорбция на вирусна РНК. Тази рентабилна и опростена техника може да осигури квалифицирана алтернатива на конвенционалните методи [34].

Фигура 15. Схема на протокол за РНК екстракция чрез повърхностно функционализирани MNP

Съществува и едноетапна процедура за екстракция на нуклеинови киселини, която използва поликарбоксил-функционализирани MNP с добавени аминогрупи, (PC-покрити NH2-MNP). Нуклеиновите киселини биват събрани с помощта на магнитно поле и след това освободени от MNPs чрез добавяне на промиващ буфер. При свързване на COVID-19-псевдовируси, поликарбоксил-функционализираните MNPs показват перфектна абсорбция и парамагнитни свойства, чрез бързото свързване (30 s магнитно свързване) към целта [30, 46].

Фигура 16: Схематично представяне на pcMNP-базиран метод за екстракция на вирусна РНК

3.2.5. Нанозими

Нанозимите са ензими, които не се срещат естествено в природата. Те са съставени от наноматериали и имат ефективност, подобна на тази на естествено срещащите се ензими. Нанозимите имат по-добра каталитична активност и способност за самосглобяване. Те биват широко използвани за диагностика и лечение на заболявания. Нов нанозим-базиран хемилуминесцентен хартиен анализ за бърза детекция на SARS-CoV-2 шипчест антиген съчетава нанозимен и ензимен хемилуминесцентен имуноанализ с латерален поточен тест.

Фигура 17: (A) Схема на нанозим хемилуминесцентен хартиен тест за SARS-CoV-2 S-RBD антиген. Разпознаване, разделяне и каталитична амплификация.

Конвенционалната хемилуминесцентна имунодиагностика използва естествени протеази, като HRP или алкална фосфатаза, които имат някои ограничения като това, че не са достатъчно устойчиви при съхранение, имат сложни методи за изготвяне и висока цена. Предложеният биосензор използва имитиращ пероксидаза Co-Fe@hemin нанозим, вместо естествена пероксидаза от хрян (HRP), който може да повиши значително хемилуминесцентния сигнал, достигайки граница на детектиране от 0,1 ng/mL. Доказано е, че нанозимът Co-Fe@hemin е по-устойчив на температура и алкалност в сравнение с HRP. Той може да остане стабилен и при съхранение на стайна температура. Този анализ може да бъде проведен в рамките на 16 минути, много по-бързо в сравнение с обичайните 1-2 часа, необходими за прилаганите в момента анализи на нуклеинови киселини. Освен това, детектирането на сигнал е възможно с помощта на камерата на обикновен смартфон. Компонентите за нанозимния синтез са леснодостъпни, което значително намалява общите разходи [20, 30].

3.2.6. Метало-органични рамки (MOF)

Порестите наноматериали могат да бъдат използвани за детектиране на различни патогени. Не е необходимо аналитът (патогенът) да бъде абсорбиран от порестите наноматериали, но патогена трябва да взаимодейства с повърхността на MOF, която бива модифицирана от различни NPs. Чрез това взаимодействие могат да бъдат оптимизирани допълнителни „изключване/включване“ или „включване/изключване“ оптични механизми за детектиране на патогена. В този случай различни оптични активни компоненти могат да бъдат използвани като гасители или активатори. При SARS-CoV-2 няма необходимост от детектиране на същия генетичен материал и генетична последователност на повърхността на маски или дрехи поради значителните несъответствия между концентрациите на SARS-CoV-2 и други вируси. Вместо това, чрез флуоресцентен модел „отпечатък“ върху контактната повърхност на газовата и твърдата фаза може да бъде измерен същия обхват на SARS-CoV-2 чрез оптични промени. Освен това, ако базираните на MOF биосензори работят успешно за детектиране на HIV-1, H1N1, ZIKA и други патогени със значителна прецизност и добра граница на детектиране, тогава морфологично и оптично-базирания биосензор за детекция на SARS-CoV-2 също трябва да функционира. [26].

4. Предизвикателства и ограничения на наноматериалите

Наноматериалите могат да бъдат изключително ценни в биомедицинската практика. Те обаче имат някои ограничения, като например токсичността им. Едно от значителните предизвикателства пред наноматериалите е да се гарантира безопасното им използване. Друго предизвикателство е, че поведението на наноматериалите в тялото може да се промени, когато те достигнат кръвообращението. Това се дължи на формирането на белтъчна корона. Поради това са необходими достоверни in vivo модели, за да бъде проучено достатъчно токсикокинетичното поведение на наночастиците в тялото, особено при дългосрочно им използване.

Друг проблем е липсата на стандартизирани протоколи за физикохимично и биологично дефиниране на наноматериалите и липсата на общоприето определение за наноматериал. Капацитетът за широкомащабно производство е друго препятствие, което трябва да бъде преодоляно за по-широкото комерсиализиране на нано-базирани формули. Поради множеството взаимодействия между наноматериалите и биологичните системи е много трудно да се предвиди поведението на тези материали при физиологични условия. Веднъж попаднали в тялото, наночастиците достигат кръвообращението, сложна матрица, съдържаща йони, малки молекули, белтъци и клетки. [37].

---

Тест LO 3.1

---

5. Литература

1. Abdelhamid H., and Badr G., (2021). Nanobiotechnology as a platform for the diagnosis of COVID‐19: a review. Nanotechnology for Environmental Engineering 6:19 https://doi.org/10.1007/s41204-021-00109-0
2. Abraham AM., Kannangai R., and Sridharan G., (2008). Nanotechnology: A new frontier in virus detection in clinical practice. Indian Journal of Medical Microbiology, 26(4): 297-301
3. Alhalaili B., Popescu I.N., Kamoun O., Alzubi F., Alawadhia S., Vidu R. (2020) Nanobiosensors for the detection of novel coronavirus 2019-nCoV and other pandemic/Epidemic Respiratory viruses: A review. Sensors 2020, 20, 6591. [CrossRef]
4. Alimardani V., Abolmaali S., Tamaddon A., (2021). Recent Advances on Nanotechnology-Based Strategies for Prevention, Diagnosis, and Treatment of Coronavirus Infections. Journal of Nanomaterials Volume 2021, Article ID 9495126, 20 pages https://doi.org/10.1155/2021/9495126
5. Alphandery E., (2020). The Potential of Various Nanotechnologies for Coronavirus Diagnosis/Treatment Highlighted through a Literature Analysis. Bioconjugate Chem. 2020, 31, 1873−1882. https://dx.doi.org/10.1021/acs.bioconjchem.0c00287
6. Bendavid E., Mulaney B., Sood N., Shah S., Ling E., Bromley-Dulfano R. (2020). COVID-19 Antibody Seroprevalence in Santa Clara County, California. MedRxiv
7. Carter L. J., Garner L. V., Smoot J. W., Li Y., Zhou Q., Saveson C. J., et al. (2020). Assay techniques and test development for COVID-19 diagnosis. ACS Cent. Sci. 6, 591–605. doi: 10.1021/acscentsci.0c00501
8. Di Paolo M., Iacovelli A., Olmati F., Menichini I., Oliva A., Carnevalini M., et al. (2020). False-negative RT-PCR in SARS-CoV-2 disease: experience from an Italian COVID-19 unit. ERJ Open Res. 6, 324–2020. doi: 10.1183/23120541.00324-2020
9. Eftekhari A., Alipour M., Chodari L., Maleki Dizaj S., Ardalan M., Samiei M., Sharifi S., Zununi Vahed S., Huseynova I., Khalilov R. et al. (2021). A Comprehensive Review of Detection Methods for SARS-CoV-2. Microorganisms, 9, 232. https://doi.org/10.3390/ microorganisms9020232
10. Ghaemi F., Amiri A., Bajuri M., Yuhana N., Ferrara M., (2021), Role of different types of nanomaterials against diagnosis, prevention and therapy of COVID-19. Sustainable Cities and Society 72 (2021) 103046
11. Gupta R., Sagar P., Priyadarshi N., Kaul S., Sandhir R., Rishi V. and Singhal N.K. (2020). Nanotechnology-Based Approaches for the Detection of SARS-CoV-2. Front. Nanotechnol. 2:589832. doi: 10.3389/fnano.2020.589832
12. Huang C., Wen T., Shi F.J., Zeng X.Y., Jiao Y.J., (2020). Rapid Detection of IgM Antibodies against the SARS-CoV-2 Virus via Colloidal Gold Nanoparticle-Based Lateral-Flow Assay. ACS Omega 2020, 5, 12550–12556.
13. Jiang M., Pan W., Arasthfer A., Fang W., Ling L., Fang, H., et al. (2020). Development and validation of a rapid, single-step reverse transcriptase loop- mediated isothermal amplification (RT-LAMP) system potentially to be used for reliable and high-throughput screening of COVID-19. Front. Cell. Infect. Microbiol. 10:331. doi: 10.3389/fcimb.2020.00331
14. Jindal S., and Gopinath P., (2020) Nano Ex. 1 022003
15. Kang J., Tahir A., Wang H., Chang J. (2021). Applications of nanotechnology in virus detection, tracking, and infection mechanisms. WIREs Nanomed Nanobiotechnol. 2021;13:e1700. https://doi.org/10.1002/ wnan.1700
16. Kelly J. C., Dombrowksi M., O’Neil-Callahan M., Kernberg A. S., Frolova A. I., and Stout M. J. (2020). False-negative testing for severe acute respiratory syndrome coronavirus 2: consideration in obstetrical care. Am. J. Obstet. Gynecol. 2(Suppl. 3):100130. doi: 10.1016/j.ajogmf.2020.100130
17. Layqah L.A., Eissa S. (2019). An Electrochemical Immunosensor for the Corona Virus Associated with the Middle East Respiratory Syndrome Using an Array of Gold Nanoparticle-Modified Carbon Electrodes. Microchimica Acta 2019, 186, 224.
18. Lew T., Aung K., Ow S., Amrun S., Sutarlie L., Ng L., and Su X., (2021). Epitope-Functionalized Gold Nanoparticles for Rapid and Selective Detection of SARS-CoV‐2 IgG Antibodies. ACS NANO, https://doi.org/10.1021/acsnano.1c04091
19. Li H., and Rothberg L., (2004). Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, 14036–14039
20. Liu D., Ju C., Han C., Shi R., Chen X., Duan D., Yan J., Yan, X. (2021). Nanozyme Chemiluminescence Paper Test for Rapid and Sensitive Detection of SARS-CoV-2 Antigen. Biosens. Bioelectron. 2021, 173, 112817
21. Manivannan S., Ponnuchamy K. (2020). Quantum Dots as a Promising Agent to Combat COVID-19. Appl. Organomet. Chem. 2020, 34, e5887
22. Mizumoto K., Kagaya K., Zarebski A., Chowell G.J.E. (2020). Estimating the asymptomatic proportion of coronavirus disease 2019 (COVID-19) cases on board the Diamond Princess cruise ship, Yokohama, Japan, 2020. Eurosurveillance , 25, 2000180
23. Moitra P., Alafeef M., Dighe K., Frieman M.B., Pan D. (2020). Selective Naked-Eye Detection of SARS-CoV-2 Mediated by N Gene Targeted Antisense Oligonucleotide Capped Plasmonic Nanoparticles. ACS Nano, 14, 7617–7627.
24. Ozmen E., Kartal E., Turan M., Yazicioglu A., Hiazi J., and Qureshi A., (2021). Graphene and carbon nanotubes interfaced electrochemical nanobiosensors for the detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) and other respiratory viral infections: A review. Materials Science & Engineering C 129 (2021) 112356
25. Park T.J., Lee S.Y., Lee S.J., Park J.P., Yang K.S., Lee K.-B., Ko S., Park J.B., Kim T., Kim S.K., (2006). Protein Nanopatterns and Biosensors Using Gold Binding Polypeptide as a Fusion Partner. Anal. Chem. 2006, 78, 7197–7205
26. Pascarella G., Strumia A., Piliego C., Bruno F., Del Buono R., Costa F., et al. (2020). COVID-19 diagnosis and management: a comprehensive review. J. Intern. Med. 288, 192–206. doi: 10.1111/joim.13091
27. Pishva P., and Yuce M., (2021). Nanomaterials to tackle the COVID-19 pandemic. Emergent Materials https://doi.org/10.1007/s42247-021-00184-8
28. Rabiee N., Bagherzadeh M., Ghasemi A., Zare H., Ahmadi S., Fatahi Y., Dinarvand R., Rabiee M., Ramakrishna S., Shokouhimehr M., Varma R.S. (2020). Point-of-Use Rapid Detection of SARS-CoV-2: Nanotechnology-Enabled Solutions for the COVID-19 Pandemic. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 5126. https://doi.org/10.3390/ijms21145126
29. Rai M., Bonde S., Yadav A., Bhowmik A., Rathod S., Ingle P., Gade A. (2021). Nanotechnology as a Shield against COVID-19: Current Advancement and Limitations. Viruses 2021,13,1224. https:// doi.org/10.3390/v13071224
30. Rasmi Y., Saloua K.S., Nemati M., Choi J.R. (2021). Recent Progress in Nanotechnology for COVID-19 Prevention, Diagnostics and Treatment. Nanomaterials 2021, 11, 1788. https://doi.org/10.3390/ nano11071788
31. Roh C., Jo S.K., (2011). Quantitative and Sensitive Detection of SARS Coronavirus Nucleocapsid Protein Using Quantum Dots- Conjugated RNA Aptamer on Chip. J. Chem. Technol. Biotechnol. 2011, 86, 1475–1479.
32. Shan B., Broza Y.Y., Li W., Wang, Y., Wu S., Liu Z., Wang J., Gui S., Wang L., Zhang Z., et al. (2020). Multiplexed Nanomaterial-Based Sensor Array for Detection of COVID-19 in Exhaled Breath. ACS Nano 2020, 14, 12125–12132.
33. Singh P., Singh D., Sa P., Mohapatra P., Khuntia A., and Sahoo S. (2021). Insights from nanotechnology in COVID-19: prevention, detection, therapy and immunomodulation. Nanomedicine (Lond.) (2021) 16(14), 1219–1235
34. Somvanshi S., Kharat P., Saraf T., Somwanshi S., Shejul S., and Jadhav K. (2021). Multifunctional nano-magnetic particles assisted viral RNA-extraction protocol for potential detection of COVID-19, Materials Research Innovations, 25:3, 169-174, DOI: 10.1080/14328917.2020.1769350
35. Talebian S., Wallace g., Schroeder A., Stellacci F., and Conde J. (2020). Nature Nanotechnology, Vol 15, August 2020, 618-624, www.nature.com/naturenanotechnology
36. Tavakol S., Zahmatkeshan M., Mohammadinejad R., Mehrzadi S., Joghataei M., Alavijeh M., Seifalian A. (2021). The role of nanotechnology in current COVID-19 outbreak. Heliyon 7 (2021) e06841
37. Tharayil A., Rajakumari R., Chirayil C., Thomas S. and Kalarikkal N., (2021) A short review on nanotechnology interventions against COVID-19. Emergent Materials (2021). 4:131–141  https://doi.org/10.1007/s42247-021-00163-z
38. To K.K.-W., Tsang O.T.-Y., Yip C.C.-Y., Chan K.-H., Wu T.-C., Chan J.M.-C., Leung W.-S., Chik T.S.-H., Choi C.Y.-C., Kandamby D.H. et al. (2020). Consistent Detection of 2019 Novel Coronavirus in Saliva. Clin. Infect. Dis
39. Toledo G., Toledo V., Lanfredi A., Escote M., Champi A., Da silva M., Nantes-Cardoso I., (2020), Promising Nanostructured Materials against Enveloped Virus. An Acad Bras Cienc (2020) 92(4): e20200718 DOI 10.1590/0001-3765202020200718
40. Udugama B., Kadhiresan P., Kozlowski H. N., Malekjahani A., Osborne M., Li V. Y. C., et al. (2020). Diagnosing COVID-19: the disease and tools for detection. ACS Nano 14, 3822–3835. doi: 10.1021/acsnano.0c02624
41. Varghese R., Salvi S., Sood P., Karsiya J., Kumar D. (2021). Carbon nanotubes in COVID-19: A critical review and prospects. Colloid and Interface Science Communications 46 (2022) 100544
42. Waller J. V., Kaur P., Tucker A., Lin, K. K., Diaz M. J., Henry T. S., et al. (2020). Diagnostic tools for coronavirus disease (COVID-19): comparing CT and RT-PCR viral nucleic acid testing. Am. J. Roentgenol. 215, 834–838. doi: 10.2214/AJR.20.23418
43. Wong M.L., Medrano J.F. (2005). Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques 39, 75–85.
44. Yeh Y.-T., Tang Y., Sebastian A., Dasgupta A., Perea-Lopez N., Albert I., Lu H., Terrones M., Zheng, S.-Y., (2016). Tunable and Label-Free Virus Enrichment for Ultrasensitive Virus Detection Using Carbon Nanotube Arrays. Sci. Adv. 2016, 2, e1601026.
45. Zhang F., Abudayyeh O. O., Gootenberg J. S., Sciences C., and Mathers L. (2020). A Protocol for Detection of COVID-19 Using CRISPR Diagnostics.
46. Zhao Z., Cui H., Song W., Ru X., Zhou W., Yu X. (2020). A Simple Magnetic Nanoparticles-Based Viral RNA Extraction Method for Efficient Detection of SARS-CoV-2. bioRxiv 2020.

Резюме

Напредъкът на нанотехнологиите е от съществено значение за диагностицирането на COVID-19. Профилактиката и диагностиката са важни за контролиране на разпространението на инфекцията. Нанотехнологиите предлагат нови методи за бърза диагностика, детектиране на инфекции в ранните етапи и идентифициране на COVID-19. Поради по-малкия си размер и по-голямата си повърхност, нанотехнологичните продукти могат да детектират заболяването с висока точност. Тъй като симптомите на COVID-19 са близки до тези на други респираторни заболявания, от съществено значение е наличието на прецизни, чувствителни и бързи диагностични инструменти за детектиране на инфекцията в ранен етап.

Ключови думи/фрази: нанотехнология, COVID-19, диагностика

1. 1. Въведение

Коронавирусното заболяване от 2019 г. (COVID-19), предизвикано от тежък остър респираторен синдром коронавирус 2 (SARS-CoV-2), е глобален здравен проблем, който СЗО обяви за пандемия. COVID-19 доведе до световен локдаун и застраши глобалната икономика. SARS-CoV-2 се разпространи бързо по целия свят, генерирайки повсеместна пандемия. Този вирус се разпространява от човек на човек чрез респираторни капки и близък контакт. Хора от всички възрасти могат да бъдат инфектирани. Разпространяването на COVID-19 оказа международен натиск върху модерните общества, особено върху инфраструктурата, свързана със здравеопазването. Следователно, необходими са диагностични тестове, специфични за това заболяване, за да се диагностицират положителните случаи, пациентите да бъдат подложени на скрининг и за да се извърши проследяване на вирусното поведение. Диагностиката играе голяма роля в предотвратяването на COVID-19 като позволява бързо предприемане на действия от институциите, ограничаващи разпространението чрез детекция и изолиране на индивиди и чрез проследяване на контактните лица. Следователно, светът е изправен пред ново предизвикателство: да създаде ултрабързи, ултрачувствителни устройства и наномащабни аналитични инструменти или сензорни системи (напр. нанобиосензори), които да бъдат високоефективни в детектирането на новия коронавирус от 2019 г. (COVID-19) или тежкия остър респираторен синдром (SARS) [3, 10, 17].

С напредъка в нанотехнологиите, изключителните свойства на наноматериалите, включително способността им да усилват сигнала при детекция, могат да бъдат използвани за разработването на нанобиосензори и нановизуализационни процеси. Заедно с други диагностични инструменти могат да бъдат приложени за детектиране в ранен етап на заболяването. Нанотехнологиите биват цялостно изследвани за перспективите си в разработването на диагностични техники, терапии, ваксини и стратегии за облекчаване на здравеопазването [10].

2. Съвременни лабораторни методи за диагностициране на SARS-CoV-2

Диагностицирането на COVID-19 се основава на анализиране на симптомите на пациента или изследване за наличието на вируса, например неговата РНК или белтък. Температурата на пациента (повишена температура), чувството за отпадналост и затруднено дишане предполагат наличието на инфекция. Въпреки това, тези симптоми са неспецифични и могат да се наблюдават при инфекция с други патогени. Патологичните изменения в органи на пациента, като например органите в гръдния кош, могат да бъдат наблюдавани чрез компютърна томография (CT). Компютърната томография може да бъде надежден тест за скрининг на SARS-COV 2 случи, както при други видове пневмония. Анализът обаче, изисква специализирано оборудване и не успява да отговори на голяма част от изискванията. COVID-19 може да бъде диагностициран чрез лабораторни измервания. Тези методи обикновено се използват за изследване на пациенти. Те не могат да се използват за анализ на замърсени проби като повърхност и въздух [1].

Фигура 1. Методи за диагностика на COVID-19.

Разработени са няколко метода за диагностика на COVID-19. Основните тестове за диагностика могат да бъдат класифицирани в три основни категории [1]:

1. Генетични тестове (тестове за наличието на вирусна нуклеинова киселина): анализ на вирусния геном, използващ методи като количествена полимеразна верижна реакция в реално време, използваща ензима обратна транскриптаза (RT-qPCR), изотермична амплификация (например изотермична амплификация, медиирана от формирането на структури наподобяващи примка (LAMP), амплификация базирана на последователност в нуклеиновата киселина (NASBA), транскрипционно медиирана амплификация (TMA), амплификация на търкалящото се колело (RCA), клъстерирани къси палиндромни повтори (CRISPR)) и нaнопорово таргетирано секвениране (NTS).
2. Антигенни тестове:анализ на вирусните белтъци (мембранно свързани шипчести белтъци или нуклеокапсидни белтъци) чрез колориметрични техники, техники използващи полеви транзистор (FET), ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) и масспектрометрия (MS).
3. Серологични тестове: анализ на антитела (имуноглобулин M (IgM) и имуноглобулин G (IgG)) срещу вируса [18, 19]. Изследването на антителата на пациента може да бъде постигнато чрез методи като електрически (EC) биосензори, локализиран повърхностен плазмонен резонанс (LSPR), усилено повърхностно Раманово разсейване (SERS), кварцов кристален микробаланс (QCM), флуоресцентен биосензор, колориметричен биосензор, имунохроматография със златни наночастици, ELISA, хемилуминесцентен имуноанализ и пиезоелектрични микроконзолни сензори (PEMS).

За съжаление много традиционни методи за детекция на респираторни вируси, като RT-PCR, имат много недостатъци. Те отнемат много време, скъпи са, не винаги са възпроизводими и изискват квалифициран персонал и други технически съоръжения [3].

Фигура 2. Недостатъци на традиционните методи.

3. Нанотехнологии

Нанотехнологиите предлагат нови техники за бърза диагностика, ранно откриване на инфекции и идентифициране на вирусни патогени, причиняващи пандемии. Те подобряват ефективността и качеството на детекционния процес чрез използване на нанобиосензори. Освен това, новите наноструктури и наносензори показват свойства и характеристики, невиждани досега на макроскопично ниво, за детектиране и улавяне на инфекции [3]

Нанотехнологиите могат да подобрят диагностицирането на COVID-19 и да предложат най-съвременен диагностичен метод, базиран на „Point Of Care“ (POC) сенсинг технологията. Освен това, те могат да бъдат свързани с изкуствен интелект (AI) и биосензори, интегрирани в интернет-свързани медицински устройства (IoMT) за изучаване на практическа информатика чрез съхранение, споделяне и анализ на данни. Освен това, те могат да заобиколят традиционните процеси с ниска чувствителност, ниска селективност, висока цена и удължено време за диагностика. Могат да се използват в нови методи за безболезнени анализи на проби, като например анализиране на слюнката на пациента с помощта на графенов оксид (GO)/Au/Fiber Bragg grating (FBG) сонда. Нанотехнологиите могат да усъвършенстват технологии като свободни от бележене биосензори, хартиени латерални поточни анализи, оптични технологии и цифрови технологии [1].

3.1. Нанобиосензори

По-големият превес на вирусни огнища може да се дължат на неправилни детекционни инструменти, използвани за откриване на инфекциозни агенти. Необходим е инструмент за детектиране или диагностика с убедителни, бързи и прецизни биосенсинг свойства. Биосензорите могат да бъдат характеризирани като аналитични инструменти, които могат да анализират ниски концентрации от аналита в биологични проби (като човешки серум, кръв, сълзи, слюнка и др.). В сравнение с традиционните китове за качествени и количествени анализи, тези биосензори са по-предпочитани поради своята прецизност и чувствителност към избраната целева молекула [15].

Фигура 3. Класификация и приложения на различните биосензори.

Необходимостта от точност и бързина при диагностицирането на COVID-19 не се удовлетворява от традиционните методи като серологични тестове и полимеразна верижна реакция с обратна транскрипция (RT-PCR), които рутинно се използват за детектиране и диагностициране на COVID-19. Това условие може да бъде изпълнено чрез използване на ултрачувствителни нанобиосензори, които играят важна роля в детектирането на новия коронавирус. Нанобиосензорите предоставят бърза, рентабилна, прецизна и миниатюризирана платформа за детектиране на SARS-CoV-2 [10]. Биосензорите обикновено са изградени от молекула за биологично разпознаване, имобилизирана върху повърхността на сигнален трансдуктор и могат да бъдат използвани за анализ, диагностика, защита, сигурност и тестване на по-големи популации [3].

Нанобиосензорите предоставят няколко предимства, водещи до ефективно детектиране, като например [3]:

• Рентабилност;
• Дълъг живот;
• Лесни за употреба;/li>
• Автономност;
• Прецизност;
• Портативни са;
• Бързо получаване на резултати;
• Силно чувствителни;
• Мултиплексни възможности;
• Приложим процес.

Нанобиосензорите са устройства, в които трансдукторът се променя, за да улови целевия компонент, биологичният отговор се превръща в електрически сигнали, който бива детектиран бързо и с висока точност. Физичните отговори могат да бъдат изчислени чрез използване на подходящи биорецептори, като нуклеинови киселини, антигени, ДНК сонда, пептид, цяла клетка, микроорганизъм и тъкан. Тези рецептори са лесно разпознаваеми, силно чувствителни и могат да детектират специфичен биоаналит. Таргетната молекула се свързва с биорецептора. След това трансдукторът с интегрирани наноструктури трансформира детекцията в електрически сигнал, дефиниран от детектора (фиг. 4) [3].

Фигура 4. Схема на различни аналити, биорецептори и трансдуктори като части от типичния нанобиосензорен дизайн за детекция на респираторни вируси.

Нанобиосензорите, използвани за детектиране на SARS или MERS коронавируси, могат да бъдат категоризирани въз основа на биологичната молекула към която са насочени (нуклеинови киселини, антигени или антитела) като биосензори,базирани на нуклеинова киселина, биосензори базирани на антиген и биосензори базирани на антитяло (Фиг. 5) [3].

Фигура 5. Схема на класификация на различни биосензори за детекция на SARS и MERS коронавируси.

3.1.1. Електрохимични нанобиосензори

Електрохимичните биосензори са най-широко използвания и най-предпочитания тип биосензори. Според дефиницията на IUPAC, електрохимичният биосензор е „интегрирано устройство, което е способно да предоставя специфична количествена или полуколичествена аналитична информация, използвайки елемент за биологично разпознаване (биохимичен рецептор), който поддържа пряк пространствен контакт с електрохимичен трансдуциращ елемент.“ [8, 13].

Електрохимичния нанобиосензор е молекулно сензорно устройство, което свързва процеса на биологично разпознаване с електроден трансдуктор, за да създаде използваем електричен сигнал. Тъй като в електрохимичните наносензори има електроди, полупроводниковите свойства, диелектричните свойства и разпределението на заряда са критични елементи [3].

Фигура 6. Схема, показваща компонентите на биосензор, използвани за сенсинг на целеви аналитни проби. Обърнато е внимание на използването на електрохимична биосензорна платформа, която трансформира биохимичната информация в ток или напрежение върху електрохимична трансдукторна повърхност.

Основните предимства на електрохимичните биосензори са [5, 11]:

• Лесно разработване;
• Възможност за миниатюризация;
• Висока чувствителност;
• Сравнително ниска цена.

Електрохимичните сензори са привлекателен избор за детектиране на различни биомолекули, тъй като те могат да бъдат лесно комбинирани с множество модули като а) евтини микроелектронни вериги; б) миниатюризирани „lab-on-a-chip“; в) електронни системи за отчитане на сигнала и г) устройства за обработка на сигнали. Тъй като електрохимичните биосензори са чувствителни, лесни за миниатюризиране, изискват малки обеми от аналита, имат по-добра граница на детектиране на аналита и предоставят бързи резултати, те са най-предпочитани в медицинската диагностика и много други изследователски области, включително безопасност на храните и мониторинг на околната среда [8].

Електрохимичният биосензор може да бъде категоризиран въз основа на видовете трансдуктори, използвани за измерване на сигнала. Те включват кондуктометрични, амперометрични и потенциометрични трансдукторни платформи. Общият принцип на електрохимичния (био-електрохимичния) биосенсинг се основава на електрохимичния отговор, протичащ върху или в близост до електрода и/или между електродите. Това води до формирането на: (i) измерим токов сигнал (амперометричен), (ii) кумулативен заряд или потенциал (потенциометричен), или (iii) промени в проводимостта на средата (кондуктометричен). [8].

Фигура 7. Класификация на електрохимичните биосензори в зависимост от типа на трансдуктора и видовете сигнал.

Електрохимичните нанобиосензори могат да се използват и за идентифициране на вирусни нуклеинови киселини. Разработен е електрохимичен геносензор за детектиране на SARS. Той използва монослой от тиолирани олигонуклеотиди, самосглобени върху въглеродни електроди, покрити със златни наночастици. Олигонуклеотидните последователности са специфични за нуклеокапсидния протеин на SARS и детектирането на вирусната инфекция се осъществява чрез ензимна амплификация на вирусна ДНК. Нанобиосензорът спомага за осъществяване на високочувствителна детекция на SARS. Проектиран е електрохимичен нанобиосензор за детектиране на MERS-CoV, който използва въглероден електрод, покрит със златни наночастици и рекомбинантен шипчест протеин S1 като биомаркер. Този подход е обещаващ за детектиране и на други коронавируси. Биосензорът е създаден с помощта на флуор-легиран субстрат и златни наночастици, амплифициращи сигнала благодарение на значителната им електрическа проводимост. [10].

Модифицирането на електрохимични сензори със златни наночастици (AuNP) показва подобрени свойства на сензора. Такива сензори могат да бъдат използвани за детектиране на MERS-CoV. AuNP притежават електрокаталитични свойства и позволяват амплификация на електричния сигнал (Фигура 8). Проектиран е имуносензор, детектиращ вируса MERS-CoV, който свързва перспективата на електрохимичните сензори и златните наночастици. Нанобиосензорът е изграден от въглеродни електроди, покрити със златни наночастици.

Фигура 8. Операционни стъпки на COVID-19 електрохимична сенсинг платформа: (A) Вземане на проба от носа или слюнката, (B) РНК екстракция, (C) имобилизиране на РНК върху графен-евДНК-AuNP платформа, (D) инкубиране за 5 min и (E) отчитане на електрохимичния сигнал.

При този имуносензор, рекомбинантният шипчест белтък (S1) бива имобилизиран върху златни наночастици. Имобилизирания S1 се конкурира с вирусните частици в пробата за свързване към антитялото (добавено в минимални количества към пробата). Когато отсъства вирусна инфекция, антитялото се свързва към имобилизирания шипчест белтък. Тъй като този сензор съдържа много електроди, той позволява мултиплексна детекция на различни коронавируси [5, 10].

 Електрохимично детектиране на SARS-CoV-2 с графенови сензори

Електрохимичните трансдукторни платформи могат да детектират вируси и други патогенни микроорганизми, използвайки техните специфични елементи за биоразпознаване. Има няколко алтернативни начина за електрохимична детекция на болестотворни микроорганизми. Въпреки това, детектирането на генетични маркери чрез електрохимични сензорни платформи не е чувствителен метод за детектиране на вируси, поради недетектируемите вирусни титри, особено в началото на вирусните инфекции [8, 14].

През последните години са направени няколко опита за прилагане на стратегии, подобни на електрохимичните глюкомери, за детектиране на вируси или вирусни инфекции. Torrente-Rodríguez et al. разработиха евтин графенов преносим електрохимичен биосензор за бърза диагностика и биохимичен мониторинг на COVID-19 от проби от серум и слюнка [8, 14].

Електродите на електрохимичния сензор са изградени от графен, гравиран върху гъвкав полиимиден (PI) полимерен субстрат за мултиплексна детекция на вирусни инфекциозни биомаркери (антигени и антитела). Авторите демонстрират количествено детектиране на специфични за COVID-19 биомаркери в кръв и слюнка, като например шипчестия белтък на SARS-CoV-2 (S1), нуклеокапсидния белтък на SARS (NP), специфични имуноглобулини срещу SARS-CoV-2 шипчестия белтък (S1-IgM и S1-IgG), както и неспецифичния C-реактивен протеин (CRP). Детектирането се осъществява във физиологично значими граници. Тази платформа има мултиплекс капацитет за детектиране на няколко SARS-CoV-2 маркера. Получените резултати се предават безжично към преносимо мобилно устройство. Този тип миниатюризирана електрохимична платформа показва голям капацитет за използването и в бъдещи PoC електрохимични устройства и системи за персонализирана медицина [8, 14].

3.1.2. Оптични нанобиосензори

Благодарение на изключителните характеристики на оптичните биосензори, като висока чувствителност, това че са свободни от маркер (т.е. целевите молекули не са белязани от определено вещество), здравина, устойчивост на електромагнитни смущения, изчислими оптични данни, податливи на миниатюризация, възможности за интегриране, портативни, с мултиплексен капацитет и осигуряване на едновременна детекция на различни цели, оптичните биосензори се използват като диагностични инструменти за респираторни вирусни инфекции. Поради това оптичните биосензори са подходящи за използване извън лабораториите [9, 10].

Фигура 9. Безжична графен-базирана телемедицинска платформа (SARS-CoV-2 RapidPlex) за бързо и мултиплексно електрохимично детектиране на SARS-CoV-2 в кръв и слюнка (A) Схема на SARS-CoV-2 RapidPlex мултисензорна телемедицинска платформа за детектиране на SARS-CoV-2 вирусни белтъци, антитела (IgG и IgM) и възпалителен биомаркер С-реактивен протеин (CRP). Данните могат да се предават безжично към мобилен потребителски интерфейс. WE, работен електрод; CE, противоелектрод; RE, референтен електрод. (B) Масово произвеждани лазерно гравирани графенови сензори. (C) Снимка на гъвкав графенов сензор за еднократна употреба. (D) Изображение на SARS-CoV-2 RapidPlex система с графенов сензор, свързана към платка за обработване на сигнала и безжична комуникация.

Въглеродните нанотръби, златните наноострови и графенът се използват основно в оптични и електрохимични биосензори. Златни наноострови, направени от малки златни наноструктури, могат да бъдат конструирани с изкуствено синтезирани ДНК рецептори и комплементарни РНК последователности на SARS-CoV-2 върху стъклен субстрат. Тъй като COVID-19 е едноверижен РНК вирус, рецепторът на нанобиосензора действа като комплементарна последователност на РНК секвенцията на коронавируса и по този начин детектира вируса. За детектиране на РНК секвенция, свързваща се към сензора се използва LSPR (локализиран повърхностен плазмонен резонанс). След свързване на молекулите на повърхността на нанобиосензора, локалният инфрачервен индекс се променя, оптичния нанобиосензор изчислява промените и определя наличието на РНК вериги [9, 10].

Демонстрирано е високоефективно детектиране на SARS-CoV-2 с оптичен биосензор, комбинирано с повърхностен плазмонен резонанс и флуоресценция. Когато оптичен биосензор бива комбиниран с метода на повърхностния плазмонен резонанс, се получава технология за бърза диагностика на SARS инфекции. Тази техника е по-предпочитана дори от ензимно-свързания имуносорбентен анализ (ELISA). Биосензор с оптични влакна, базиран на локализиран повърхностен плазмонен резонанс и комбиниран с флуоресценция (LSPCF), може да детектира рекомбинантен N белтък (SARS-CoV-N), използвайки AuNP. Чрез този метод може да бъде детектиран вирусен товар от 106 частици/mL в рамките на 15 минути. Тези проучвания показват, че вирусните респираторни инфекции могат да бъдат диагностицирани бързо чрез използване на биосензори с наноматериали [9].

Фигура 10. Схема на оптичен биосензор

3.1.3. Графенови биосензори

Графеново FET (полеви транзистор) устройство се използва за определяне на вирусния товар на SARS-CoV-2 в назофарингеални проби на пациенти с COVID-19. Графеновият FET нанобиосензор се състои от субстрат от SiO2/Si, покрит с графен, представляващ сенсинг зоната. Върху графеновото покритие е имобилизирано антитяло, свързващо SARS-CoV-2 шипчестия белтък. Тези биосензори спомагат за детектиране на шипчестия SARS-CoV-2 антиген във фосфатен буфер, дори при концентрация от 1 fg/mL [10].

Графеновите биосензори са ценни за тестване и детектиране на [9]:

• кръвна глюкоза;
• респираторна честота;
• телесна температура в реално време;
• кръвно налягане;
• вируси;
• малки молекули.

Поради рентабилността, високия афинитет и лесното им производство, графеновите наноматериали са едни от най-предпочитаните материали за биосензори. Например, транзисторен биосензор е успешно разработен за откриване на SARS-CoV-2 (шипчест белтък). Биосензорът е произведен от полеви транзистор (FET), покрит с графен. Върху графена е имобилизирано специфично антитяло (Фигура 9). Графенът и неговите производни показват добри резултати при улавянето на вируси. Тези устройства за бисенсинг имат предимства пред другите диагностични методи, налични в момента [9].

Базираните на FET биосензорни устройства могат да правят чувствителни и мигновени измервания, използвайки малки количества аналит. Освен това, FET биосензорите могат да бъдат полезни в клиничната диагностика и в тестването на пациенти на място, извън лабораториите. Създадена е неамплифицираща и бърза наносенсинг платформа за детектиране на РНК на SARS-CoV-2 във фарингеални проби. Проектиран е графенов FET (G-FET) сензор, към който са добавени златни наночастици (AuNP). Върху повърхностите на AuNPs са имобилизирани комплементарни фосфородиамидат морфолино олиго (PMO) сонди. Този сензор излъчва нисък фонов сигнал, тъй като PMO е силно чувствителен към SARS-CoV-2 RdRp. Когато графенов полеви транзистор е се комбинира с CRISPR-Cas9 биосензор, той може да детектира неамплифицирани таргетни гени и по този начин може да бъде използван за детектиране на вирусини таргети, като например нуклеиновите киселини на SARS-CoV-2 [9].

3.1.4. Хирални нанобиосензори

Хиралните биосензори скоро ще станат изключително популярни в областта на бионанотехнологиите поради тяхната ултра-чувствителност и бързо време на действие. Те могат да бъдат инструмент за справяне с пандемията от SARS-CoV-2. Популярността на хиралната нано-оптика нараства поради новите методи за производство на метални наноструктури с променлива повърхностна морфология. Това предлага безпрецедентен контрол върху техните електронни и оптични свойства. Най-важното предимство на такива нанохибридни структури е, че те подобряват хироптичния отговор, който може да бъде от значителен интерес в различни приложения, свързани с хиралния биосенсинг, позволявайки приложението им в нови научни области. В сравнение с естествените хирални молекули, хиралните плазмонни наноструктури не само, че имат значителни хироптични ефекти, но също така въвеждат изцяло нова концепция за суперхирална светлина в технологичните приложения [2, 5].

Фигура 11. Детектиране на SARS-CoV-2 с помощта на FET: Схемата показва вземане на биологични проби от пациент и тяхното поставяне в графеновата сензорна зона на FET биосензор. Свързването на SAR-CoV-2 вируса бива детектирано от сензора в реално време.

Ahmed et al. разработват хирален имуносензор, използващ златни наночастици и квантови точки. При него циркониеви квантови точки и магнитни наночастици биват конюгирани със специфични за коронавируса антитела, след което биват смесени. В присъствието на вируса, както квантовите точки, така и наночастиците ще се свържат към вирусната мишена и ще се получат магнитни плазмонни-флуоресцентни нанохибриди, които могат да бъдат разделени от магнит. След това, концентрацията на аналита може да се определи чрез изчисляване на флуоресценцията на отделените нанохибриди. Този сенсинг процес има граница на детектиране от 79,15 EID/50 μl [2, 5, 10].

3.1.5. Аптамерни биосензори

Благодарение на надеждния скрининг метод, аптамерите могат да детектират вирусни гени, белтъци или други маркери на вирусна инфекция. Променяйки вече разработените анализи, аптамерните сензори могат да разграничат инфектирани и неинфектирани клетки или активни и неактивни вирусни форми. Поради своите свойства, аптамерната детекция има значителни предимства пред антителата, включително висока устойчивост на широк диапазон от температури, лесен синтез чрез систематично модифициране на лиганди чрез метод на експоненциално обогатяване (SELEX) и лесна трансформация според нуждите на анализа [4].

Фигура 12. Детектиране на SARS-CoV и SARS-CoV-2 чрез аптамерни биосензори.

Биосензорите използват антитяло- и аптамер-базирани механизми за детекция. Аптамерите са по-трайни, по-достъпни и по-бързи за синтез от антителата. Аптамерите, известни също като „химични антитела“ или „изкуствени антитела“, често биват сравнявани с антителата по отношение на тяхната специфичност спрямо мишената. Някои аптамери биват използвани в SARS-CoV-2 детекцията като се инкорпорират в аптасенсинг платформи [7].

Аптамерите са олигонуклеотидни секвенции, които могат ба бъдат разработени така, че да разпознават и да се свързват специфично с различни молекули:

• малки молекули като аминокиселини, нуклеотиди и антибиотици;
• макромолекули като нуклеинови киселини и белтъци;
• повърхностни епитопи на вируси, бактерии и други клетки

Аптамерите формират уникални триизмерни (3D) структури, свързвайки се специфично към аналитите. Те могат да бъдат бързо моделирани и стабилно имобилизирани върху повърхността на биосензорите. Аптамерните биосензори (аптасензори) могат да детектират количествено целеви аналити чрез изчисляване на сигнала, получен от химични и/или биохимични повърхностни взаимодействия. Аптамерите се считат за обещаващ диагностичен инструмент за детектиране на вируси [7].

Аптасензорите представляват аптамер-базирани биосензори, предназначени да изследват и определят количествено таргетни биомолекули чрез определени биохимични реакции, при които се генерира количествено измерим сигнал. Взаимодействието на специфични аптамери с целеви биомолекули представлява механизма на свързване и биоразпознаване, което е съпроводено с отделянето на пропорционален сигнал. Аптасензорите за детектиране на SARS-CoV-2 могат да бъдат разделени в две категории въз основа на естеството на отделения сигнал: оптични и електрохимични аптасензори [7].

3.2. „Point-of-Care“ Тестване

„Point-of-Care“ тестването, дефинирано от Центъра за контрол и превенция на заболяванията, представлява „диагностични тестове, извършвани на или близо до мястото, където е взета пробата, при които се предоставят резултати в рамките на минути, а не часове. Това може да бъдат тестове, при които се амплифицират нуцелинови киселини (NAAT), тестове за детекция на антигени или антитела.“ [18].

Пазарът за „Point-of-Care“ тестване на инфекциозни заболявания (POCT) представлява обещаващ и значителен растеж в глобалната in vitro диагностика (IVD). Нарастващото разпространение на вируса на човешката имунна недостатъчност (HIV), туберкулозата (TB), маларията в развиващите се страни и опасността от възникващи и повторно появяващи се инфекциозни заболявания като респираторния синдром от Близкия изток (MERS), тежък остър респираторен синдром (SARS), ZIKA, различни щамове на грипния вирус и вирусът на Западно нилската треска са фактори, които повишават нуждата от POCT [6].

Инфекциозните заболявания представляват сериозна заплаха за човешкото здраве и водят до повече от половината смъртни случаи в света. Освен това, широко разпространените инфекциозни заболявания непрекъснато увеличават смъртността в развиващите се страни. Най-ефективният начин за ограничаване на епидемията е ранната диагностика, което представлява предизвикателство за използваните досега подходи, поради скъпото оборудване, необходимостта от специалисти и бавното получаване на резултати. Поради това бързите POCT методи са от съществено значение за преодоляване на тези пречки чрез миниатюризиране и намаляване на разходите за оборудване, както и предоставяне на достъпни, бързи и лесни за употреба диагностични тестове без специализирано обучение [6].

PoC тестването позволява диагностициране на инфектирани индивиди, без да е необходимо изпращане на проби от пациенти в лабораториите. Това е изключително важно за населени места или жители, които нямат подходяща лабораторна инфраструктура за анализиране на проби. Съществената част от PoC тестването е биосензорът, който се използва за постигане на биохимична реакция, с цел детекция на патогена.

Предимствата за използването на PoC тестове са [4]:

1. минимално пространство за тестване и съхранение;
2. широкомащабни анализи;

• тестването може да се извърши на различни места;

1. могат да бъдат адаптирани за различни медицински нужди.

Фигура 13. Схематична илюстрация на количествена оценка на SARS-CoV-2 с помощта на SARS аптасензор. (a) След като лизатите на SARS-CoV-2 освободят таргетните шипчести белтъци, те се разпознават от аптамерните ДНК, разположени върху повърхността на Au наноструктури. Свързаните с S белтъка аптамери се отделят от повърхността на Au наноструктури, което води до понижаване на интензитета на Raman пика на Cy3 репортерите. (b) Cy3-маркирани аптамерни ДНК молекули хибридизират с ДНК върху Au наносубстрат. Вътрешните стандартни 4-MBA са имобилизирани заедно с аптамерни ДНКи върху Au наносубстрат. (c) Разпознаването на SARS-CoV-2 S белтъка индуцира конформационна промяна на аптамерните ДНКи, което позволява на аптамерните ДНКи да се свържат с RBD на шипчестия белтък.

Едни от най-атрактивните POCT са тези, които се базират на колометричните биосензори, тъй като те позволяват детектиране на аналита чрез промени в цвета, които могат да бъдат наблюдавани с невъоръжено око [5].

Фигура 14: Колориметрична детекция на вируси, базирана на наночастици. Тази фигура изобразява механизма, при който вирусът агрегира с наночастиците, което води до промяна на цвета от червено в лилаво.

Kim et al. създават колориметричен анализ, използващ златни наночастици, за детектиране на вируса MERS-CoV. Този анализ използва две модифицирани с тиол сонди и златни наночастици (AuNPs), покрити с цитрат и потопени в положителен електролит (напр. 0,1 М MgCl2) [5, 6].

Колориметричният тест, базиран на златни наночастици, представлява разтвор на златни наночастици, който свързват вируса, което води до видима промяна на цвета в течността. Това позволява бърза детекция на COVID-19 чрез промяна на цвета на разтвора на златните наночастици. Този евтин тест действа много по-добре от другите диагностични техники, подобни на стандартните PCR тестове. Основното предимство на този тест е, че разтворът на златните наночастици показва специфични цветове, защото абсорбира определена дължина на вълната. Към златните наночастици се добавя пробата, съдържаща SARS-CoV-2, което води до свързване на вируса. Това вода до промяна в абсорбцията и промяна на цвета на разтвора. Тази промяна в цвета може да бъде наблюдавана с невъоръжено око. Недостатъкът на този метод е, че той е осъществим само когато вирусния товар е много висок [12].

Сондите са конюгирани със AuNPs чрез силни Au-S връзки. Хибридизирането на целевите ДНКи с едноверижните ДНКи на повърхността на златните наночастици, води формиране на двойноверижна ДНК, агрегиране на златните наночастици в електролита, водещо до промяна в оптичните свойства на AuNP [5, 6].

TПотенциалната детекционна граница на този анализ е 1 pmol μl-1, което позволява детектиране на по-ниски количества от целевия вирус. Освен това, използването на такъв тип колориметричен анализ позволява евтина и бърза диагностика на заболяването без необходимост от сложни инструменти [5].

3.3. Нанопорово целево секвениране (NTS)

Доказано е, че нанопоровият метагеномен метод (NTS) ефективно детектира бактериални респираторни инфекции и вируси от клинични проби. Патогените и гените за резистентност към антибиотици могат да бъдат разпознати за няколко часа, много по-бързо от конвенционалните методи на култивиране. Нанопоровото секвениране генерира резултати в реално време. Освен това, нанопоровото секвениране може да бъде използвано за транскриптомно характеризиране на отделни секвенции или цели коронавирусни генонми РНКи. Методът NTS открива едновременно SARS-CoV-2 и десет други респираторни вируса само за 6–10 часа. Поради това, той е подходящ за текущата диагностика на COVID-19. Въпреки това, границата на детектиране може да бъде разширена за диагностициране и на други вируси и патогени. NTS се основава на амплифициране на 11 SARS-CoV-2 вирулентни и уникални генни фрагменти (напр. orf1ab) чрез вътрешен първичен панел, последвано от секвениране на амплифицирания фрагмент върху нанопорова платформа. Този проект използва нанопорова платформа за секвениране, която може да секвенира дълги фрагменти от нуклеинови киселини и едновременно с това да анализира изходните данни в реално време. Това позволява потвърждаване на SARS-CoV-2 инфекциите в рамките на минути след секвенирането, чрез картиране на прочетените секвенции към генома на SARS-CoV-2 и анализиране на идентичността и валидността на изходната секвенция [16, 17].

4. Предизвикателства и ограничения на нанотехнологиите в COVID-19 детекцията

Системите, базирани на нанотехнологии, въпреки предимствата си, срещат множество предизвикателства преди да бъдат безопасно представени на пазара. Най-честите проблеми са:

• Мащабируемост и производствени разходи;
• Интелектуална собственост;
• Потенциална токсичност и въздействие върху околната среда.

Преди нанотехнологиите да бъдат широко приети в системата на здравеопазването, трябва да бъдат решени някои проблеми, свързани с тяхното приложение. Основната задача ще бъде да се гарантира безопасността на наноматериалите чрез in vitro изследвания на тяхната биосъвместимост. Съдбата на наноматериалите в тялото може да се промени, когато те навлязат в кръвообращението поради образуването на т.нар. белтъчна корона. Следователно, изследванията in vivo трябва да бъдат извършвани внимателно, за да бъде опозната по-добре токсичността на наночастиците в тялото. Поради тези ограничения са използвани общи протоколи за категоризиране на ранен етап от научноизследователската и развойна дейност, които минимизират шансовете за неуспехи по отношение на клиничния подход в терапия, базирана на нанотехнологии. Необходимо е по-тясно сътрудничество между регулаторните агенции, експертите в науката, фармакологията и токсикологията, за да бъдат преодолени другите ограничения [10].

---

Тест LO 3.2

---

Литература

1. Abdelhamid H., and Badr G.
2. (2021). Nanobiotechnology as a platform for the diagnosis of COVID‐19: a review. Nanotechnology for Environmental Engineering 6:19 https://doi.org/10.1007/s41204-021-00109-0.
3. Ahmed SR., Nagy É., and Neethirajan S. (2017). Self-assembled star-shaped chiroplasmonic gold nanoparticles for an ultrasensitive chiro- immunosensor for viruses RSC Adv. 7 40849–57
4. Alhalaili B., Popescu I.N., Kamoun O., Alzubi F., Alawadhia S., Vidu R. (2020). Nanobiosensors for the detection of novel coronavirus 2019-nCoV and other pandemic/Epidemic Respiratory viruses: A review. Sensors, 20, 6591.
5. Gupta R., Sagar P., Priyadarshi N., Kaul S., Sandhir R., Rishi V. and Singhal N.K. (2020). Nanotechnology-Based Approaches for the Detection of SARS-CoV-2. Front. Nanotechnol. 2:589832. doi: 10.3389/fnano.2020.589832
6. Jindal S., and Gopinath P. (2020). Nano Ex. 1 022003
7. Kim H.,Park M.,Hwang J.,Kim J.H., Chung D-R., Lee Kand Kang M. (2019). Development of label-free colorimetric assay for MERS-CoV using gold nanoparticles ACS Sens.
8. Mandal M., Dutta N., and Dutta G. (2021). Aptamer-based biosensors and their implications in COVID-19 diagnosis. Anal. Methods, 2021, 13, 5400
9. Ozmen E., Kartal E., Turan M., Yazicioglu A., Hiazi J., and Qureshi A. (2021). Graphene and carbon nanotubes interfaced electrochemical nanobiosensors for the detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) and other respiratory viral infections: A review. Materials Science & Engineering C 129 (2021) 112356
10. Pradhan A., Lahare P., Sinha P., Singh N., Gupta B., Kuca K., Ghosh K.K., Krejcar O. (2021). Biosensors as Nano-Analytical Tools for COVID-19 Detection. Sensors 2021, 21,7823. https://doi.org/10.3390/ s21237823
11. Rai M., Bonde S., Yadav A., Bhowmik A., Rathod S., Ingle P., Gade A. (2021). Nanotechnology as a Shield against COVID-19: Current Advancement and Limitations. Viruses 2021,13,1224. https:// doi.org/10.3390/v13071224
12. Satvekar R. (2021). Electrochemical nanobiosensors perspectives for COVID 19 pandemic.  J. Electrochem. Sci. Eng. 00(0) (2021) 000-000; http://dx.doi.org/10.5599/jese.1116
13. Tavakol S., Zahmatkeshan M., Mohammadinejad R., Mehrzadi S., Joghataei M., Alavijeh M., Seifalian A. (2021). The role of nanotechnology in current COVID-19 outbreak. Heliyon 7, e06841
14. Thevenot D.R., Toth K., Durst R.A., Wilson G.S., Biosens. (2001). Bioelectron. 16:121–131.
15. Torrente-Rodríguez R.M., Lukas H., Tu J., Min J., Yang Y., Xu C., Rossiter H.B., Gao W., (2020). Matter. 3: 1981–1998.
16. Varghese R., Salvi S., Sood P., Karsiya J., Kumar D. (2021). Carbon nanotubes in COVID-19: A critical review and prospects. Colloid and Interface Science Communications 46: 100544
17. Wang M., Fu A., Hu B., Tong Y., Liu R., et al. (2020). Nanopore target sequencing for accurate and comprehensive detection of SARS-CoV-2 and other respiratory viruses. medRxiv.
18. Waris A., Ali M., Khan AU., Ali A. (2020). Baset A. Role of nanotechnology in diagnosing and treating COVID-19 during the Pandemic. Int J Clin Virol. 2020; 4: 065-070.
19. https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/point-of-care-testing.html

Резюме

SARS-CoV-2 (коронавирус тип 2, причиняващ тежък остър респираторен синдром) е причинителят на заболяването, известно като COVID-19. Заразяването със SARS-CoV-2 обикновено е свързано с развитие на леко до умерено изразена респираторна симптоматика, но част от пациентите може да се нуждаят от хоспитализация и, понякога, от интензивно лечение. Консервативната терапия при COVID-19 се основава на използване на комбинация от кортикостероиди, антикоагуланти или антиагреганти и, при развитие на бактериална пневмония, антибиотици. Разработени са няколко типа специализирани терапии за COVID-19 (антивирусни агенти, моноклонални антитела, и други), които могат да се използват под формата на пре-експозиционна профилактика или като лечение на ранните етапи на инфекцията при пациенти, за които има висок риск от възникване на усложнения. Съвременните нанотехнологии предлагат редица високотехнологични решения за целите на превенцията на заразяването, диагностиката и пост-експозиционната профилактика, както и ефективно лечение в случаите, когато COVID-19 и неговите усложнения вече са се развили. Базираните на наноматериали сензори, лекарства и ваксини имат потенциал да играят важна роля в управлението на пандемията от COVID-19 в недалечното бъдеще.

Ключови думи/фрази: COVID-19, антивирусни агенти, моноклонални антитела, ваксини, нанотехнологии

1. Ваксини и лекарства за лечение на COVID-19 – общи сведения

1.1. SARS-CoV-2 и COVID-19 – преглед на етиологията, патогенезата и потенциалните подходи за намаляване на усложненията след прекаран COVID-19

На 31 декември 2019 г. Световната здравна организация (СЗО) беше информирана за бързо увеличаване на броя случаи в град Ухан, Китай на пневмония с причинител, който по това време все още не беше известен. Причинителят беше идентифициран от местните здравни власти на 7 януари 2020 г. като непознат до този момент досега представител на семейството на бета-коронавирусите.

SARS-CoV-2 (коронавирус тип 2, предизвикващ тежък остър респираторен синдром) причинява инфекциозно заболяване, наречено COVID-19 (съкратено от Coronavirus Disease of 2019). В повечето случаи инфекцията със SARS-CoV-2 е свързана с развитие на лека до умерена клинична картина, включваща едно или повече от следните сипмтоми и признаци: астеноадинамия, хрема, кашлица, главоболие, ставни и мускулни болки, коремна болка, диария и други. В повечето случаи възстановяването е спонтанно, в рамките на няколко дни до две седмици. Някои пациенти обаче могат да развият синдром на остър респираторен дистрес (acute respiratory distress, ARDS) и прогресираща дихателна недостатъчност. В сравнение със сходните по протичане SARS (тежък респираторен синдром) и MERS (близкоизточен респираторен синдром), COVID-19 обикновено предизвиква по-леки клинични симптоми и води до по-ниска смъртност. Въпреки това, на практика всеки може да се зарази и да умре от SARS-CoV-2, независимо от пола и възрастта (макар че рискът от смърт е по-висок при мъжете и децата, както и възрастните с тежки предходни заболявания).

1.2 Патогенетични механизми

 

Подобно на повечето коронавируси, SARS-CoV-2 навлиза в клетката чрез ендоцитоза, използвайки като входна врата мембранно-свързаната форма на ангиотензин-конвертиращия ензим тип 2 (angiotensin-converting enzyme 2, ACE2, популярно наричана ACE2 рецептор). Процесът се осъществява посредством свързване на рецептор-свързващия домен (receptor-binding domain, RSD) на белтъка S (spike, шипов) към ACE2 рецептора на прицелната клетка [67]. След навлизането си в клетката, вирусът „съблича” белтъчната си обвивка и освобождава вирусната нуклеинова киселина. Геномът на SARS-CoV-2 представлява плюс-сенс едноверижна РНК, която бива транслирана до два полипротеина. От последните чрез хидролиза се генерират 16 неструктурни белтъка, които образуват комплекса РНК репликаза-транскриптаза. Той синтезира, от една страна, копия на вирусния геном и, от друга, генерира отворени рамки за четене за синтез на вирусни белтъци. Следва самосглобяване на вирусната РНК със структурните протеини, при което се образуват нови инфекциозни вирусни частици, които се освобождават чрез екзоцитоза [66, 38]. Тъй като генът ACE2, освен в белия дроб, се експресира и в много други тъкани (стомашно-чревния тракт, бъбреците и други [74, 15]), при пациентите с COVID-19, освен белодробното увреждане, често се развиват увреждания и на много други тъкани и органи.

1.3. Патоморфологични и клиниколабораторни особености при пациентите с COVID-19

Основните патоморфологични находки при пациенти с COVID-19 са дифузното увреждане на белодробните алвеоли, патологичните промени в белодробното съдово русло и алвеоларните хеморагии [Pathology of COVID-19: Atlas, 2020]. Друг често срещан тип тъканна увреда при пациентите с COVID-19 е системното възпаление с изразена лимфоцитна и моноцитна инфилтрация, където основни прицелни тъкани са белият дроб и сърцето [22, 38]. Типични лабораторни находки при пациенти с тежко протичащ COVID-19 са лимфопения (въпреки че при някои пациенти може да се наблюдава и лимфоцитоза), тромбоцитопения, повишени нива на прокалцитонина, фибриногена, D-димера, лактатдехидрогеназата, феритина, интерлевкини -2, -7 и -6, моноцитният хемоатрактантен белтък (monocyte chemoattractant protein 1, MCP1), макрофагеалният възпалителен белтък 1-алфа (macrophage inflammatory protein 1-alpha, MIP1-alpha) и тумор-некротизиращият фактор-алфа (tumour necrosis factor (TNF-α). При пациентите с насложена бактeриална инфекция се наблюдават повишени нива на С-реактивния протеин (C-reactive protein, CRP).

1.4. Механизми на предаване на причинителя от човек на човек и методи за превенция на заразяване

Както всички коронавируси, SARS-CoV-2 е нестабилен извън живата клетка, поради което предаването на инфекцията се осъществява при близък контакт със секрети от дихателните пътища на заразено лице. Главният път на разпространение на вируса е въздушно-капковият. Към момента, най-ефективните начини за предотвратяване или поне за забавяне на предаването му от човек на човек са поддържане на безопасна дистанция (над 1,5 м) между хората, самоизолация при проява на симптоми, често миене на ръцете (и/или използване на дезинфектанти за ръце на базата на 70% етанол), редовна дезинфекция на повърхностите и предметите, които често биват докосвани и използване на правилно поставени лицеви маски при пребиваване в закрити пространства. СЗО редовно публикува осъвременени насоки за превенция на инфекция със SARS-CoV-2: https://www.covid19treatmentguidelines.nih.gov/about-the-guidelines/whats-new/

1.5. Прицелни точки за патогенетичното лечение при инфекция със SARS-CoV-2

Геномът на SARS-CoV-2 кодира 4 основни структурни белтъка, а именно: шипов белтък (spike, S), белтък на обвивката (envelope, E), мембранен белтък (membrane, M) и белтък на нуклеокапсида (nucleocapside, N), както и редица други белтъци без структурна функция и спомагателни белтъци. Механизмите на действие на разработваните в момента лекарствени средства са насочени както към вирусната РНК, така и към структурните вирусни белтъци. Най-често използваните в момента агенти с антивирусно действие обикновено са насочени към РНК синтезата (и по-точно, към РНК-зависимата РНК полимераза на вируса), докато моноклоналните антитела са по-често насочени към структурните белтъци.

1.6. Рискови фактори, допринасящи за възникване на усложнения след прекарана инфекция със SARS-CoV-2

Основните непредотвратими рискови фактори за неблагоприятен изход (смърт или трайни увреждания) при пациентите с COVID-19 са мъжкият пол и предходно съществуващи у пациента сериозни хронични заболявания – сърдечно-съдови заболявания, бъбречни заболявания, диабет, хронични респираторни заболявания и неоплазми [51]. Обструктивната сънна апнея е специфичен рисков фактор, който увеличава риска от хоспитализация и дихателна недостатъчност при инфекция със SARS-CoV-2 почти 8 пъти в сравнение с пациентите без обструктивна сънна апнея [36]. В самото начало на пандемията се смяташе, че напредналата възраст е основен рисков фактор за неблагоприятен изход от заболяването. По-късно, обаче, се установи,че наличието на предходно тежко хронично заболяване като рисков фактор за неблагоприятен изход има значително по-голяма тежест от тази на фактора възраст: [https://www.cdc.gov/aging/covid19/covid19-older-adults.html; https://gis.cdc.gov/grasp/COVIDNet/COVID19_5.html].

1.7. Лечение на инфекциите със SARS-CoV-2 и потенциалните им усложнения

1.7.1. Консервативно лечение

При неусложнени случаи на COVID-19 най-подходящият терапевтичен подход е почивка и симптоматично лечение със съпътстващ мониторинг в условия на домашна самоизолация. При около 10-20% от заразените се развиват усложнения, които водят до тежко протичане на заболяването. Те може да се нуждаят от специализирана медицинска помощ и интензивни грижи [https://www.uptodate.com/contents/covid-19-clinical-features]. При усложнените случаи се прилагат стратегиите, заложени в протоколите, издадени специално за тази цел от на СЗО и Центъра за превенция и контрол на заболяванията (Center for Disease prevention and control, CDC) в Атланта, САЩ, както и модифицирани версии на тези протоколи съобразно локалните политики. Тъй като COVID-19 протича със системен възпалителен отговор и активиране на системата на кръвосъсирване, критично важни компоненти от всеки протокол за лечение на усложнени инфекции със SARS-CoV-2 са противовъзпалителната, антикоагулационната и/или антиагрегационна терапия [https://covidprotocols.org/en/chapters/inpatient-management/]. Основа на противовъзпалителната терапия при пациентите с COVID-19 са кортикостероидите, и то най-вече тези с намалена минералкортикоидна активност и дълго действие – напр. дексаметазон. При пациенти с тежка дихателна недостатъчност към него може да се добави кортикостероид с по-краткотрайно действие, напр. метилпреднизолон. Мощното противовъзпалително действие на кортикостероидите обаче, е за сметка на редица нежелани ефекти. Сред тези ефекти най-често срещан е гастроинтестиналното дразнене, поради което обикновено лечението с кортикостероиди е съпроводено с приложение на H2 антагонисти или инхибитори на протонната помпа. Антибиотиците влизат в употреба при пациенти с COVID-19, когато има данни за развитие на вторична бактериална пневмония. Това е често срещано усложнение при пациентите с тежко протичащ COVID-19, тъй като инфекцията води и до значително подтискане на вродения имунитет и общо разрегулиране на имунната сигнализация [76]. Обикновено се използват широкоспектърни антибиотици, като антибиотиците с бактерицидно действие (напр. пеницилини, 4-хинолони и аминогликозиди) обикновено се предпочитат пред тези с бактериостатично действие (напр. макролиди и тетрациклини). При около 2% от заразените пациенти има риск от развитие на прогресивна тежка дихателна недостатъчност. Тези пациенти имат нужда от интензивно лечение [https://www.uptodate.com/contents/covid-19-clinical-features].
По отношение на антикоагулантната терапия, обичайният избор при пациенти с COVID-19 е нискомолекулен хепарин, но понякога се използва нефракциониран хепарин или нови перорални антикоагуланти, както и антиагреганти като аспирин, клопидогрел, дихидропиридамол и други.

1.7.2. Специфично лечение

Множество вещества с антивирусно действие и моноклонални антитела вече са били са изпитвани за потенциална активност срещу SARS-CoV-2. По-голямата част от тях са предходно съществуващи лекарства, които вече са преминали изпитания за безопасност и ефикасност при други заболявания, причинени от вируси с РНК геном. Такива са, например, антивирусните агенти фавипиравир, ремдесивир, комбинацията лопинавир/ритонавир, моноклоналното антитяло тоцилизумаб и други (виж по-долу). Други, като нирматрелвир (компонент от наскоро одобрения от Pfizer комбиниран препарат Paxlovid) и сотровимаб са специално разработени за целите на лечението на COVID-19, въпреки че се основават на базата на други, предходно разработени антивирусни лекарства или моноклонални антитела.

Появата на ваксините срещу SARS-CoV-2 измени съществено стратегията за борба с разпространението на инфекцията, както и прогнозата за изхода от болестта при пациентите, развили COVID-19. Причинителят на COVID-19 беше изолиран към края на 2019 г. [70] и първата геномна секвенция на вируса беше публикувана по-малко от 2 седмици след това [71]. По този начин изследователската общност, клиницистите и фармацевтичната индустрия получиха най-рано необходимите данни за биологията и генетичната изменчивост на SARS-CoV-2. Благодарение на това, те имаха възможността да насочат и обединят усилията си към разработването на ефективно лечение за COVID-19 и ваксини срещу вируса още преди първата вълна от пандемията да се разгърне през м. март и април 2020 г. Първата експериментална ваксина срещу SARS-CoV-2 (Convidecia, разработена от CanSino Biologics) беше одобрена за спешна употреба в Китай в края на юни 2020 г. През следващите няколко месеца около десетина различни ваксинални препарата от векторен, пептиден и иРНК тип и преминаха в ускорени срокове клиничните изпитания и бяха одобрени за употреба при възрастни, а по-късно и при деца. Към 21 декември 2020 г., 14 ваксини срещу SARS-CoV-2 бяха преценени като напълно завършени и още около 10 бяха в процес на разработка или изпитване (напр. EpiVac Corona на изследователския център по вирусология и биотехнология „Вектор“ в Русия), или им предстоеше окончателна оценка (такива бяха, например ваксиналните продукти на BioCubaPharma, CanSinoBio, Sanofi, Clover Pharmaceuticals, както и други). Актуализирана информация за статуса на ваксиналните препарати срещу SARS-Cov-2 могат да се видят на този адрес: Status_COVID_VAX_23Dec2021.pdf (who.int).

Някои ваксинални продукти не достигнаха финалната фаза на разработка или отпаднаха на ниво изпитания. Такава беше, за съжаление, първата ваксина, изцяло базирана на наночастици (зорецимеран на CureVac). Отначало СЗО прецени, че този препарат заслужава внимание, но по-късно заявката за оценка на безопасността и ефективността беше оттеглена от производителя, тъй като експериментално доказаната ефикасност на защита на ваксината срещу симптоматично заболяване се оказа сравнително ниска – под 50% (по-точно, 48%) във всички изследвани в проучването групи. Наистина, същата ваксина демонстрира 100% ефикасност на защита срещу хоспитализация и смърт при изследваните индивиди, но тъй като експерименталната група се състоеше само от 134 индивида, окончателният анализ посочи, че е било необходимо в изследваната група да има поне още 80 допълнителни индивида, за да може да има надеждна оценка на безопасноста и ефикасността [https://www.reuters.com/business/healthcare-pharmaceuticals/curevacs-covid-19-vaccine-misses-efficacy-goal-mass-trial-2021-06-16/]. CureVac прекрати работата си по проекта с разработване на тази ваксина и започна да работи в сътрудничество със Sanofi-GlaxoSmithCline по разработката на друг ваксинален препарат [https://www.reuters.com/business/healthcare-pharmaceuticals/curevac-withdraw-first-generation-covid-19-vaccine-candidate-2021-10-12/]. Към м. януари 2021, в официалните списъци на СЗО се числяха общо 63 ваксини в клиничен стадий на изпитания и още 173 препарата в преклиничен стадий на разработка.

2. Нанотехнологични решения за превенция на инфекции със SARS-CoV-2 и лечение на COVID-19

Според актуалната дефиниция на Центъра за контрол на заболяванията в Атланта, САЩ, нанотехнологиите представляват: „…манипулиране на материята на ниво отделни атоми с цел производство на нови структури, материали и устройства… чрез използване на материали, изградени от частици с размер в диапазона 1 – 100 нанометра… при който размер материалите проявяват уникални свойства, които влияят на [тяхното] физично, химично и биологично поведение”: https://www.cdc.gov/niosh/topics/nanotech/default.html#:~:text=Nanotechnology%20is%20the%20manipulation%20of,new%20structures%2C%20materials%20and%20devices.&text=Nanotechnology%20refers%20to%20engineered%20structures,between%201%20and%20100%20nanometers. Наноматериалите показват добра разтворимост в биологични течности и високо съотношение повърхност/обем. Това им позволява да бъдат използвани като носители на лекарствени вещества. Тъй като взаимодействат добре с биологичните мембрани, те осигуряват възможност за по-добър контрол върху отделянето на съдържащото се в тях лекарствено средство в сравнение с класическите фармацевтични продукти.

SARS-CoV-2 е вирус със среден размер (60-140 nm, средно 100 nm) и, съответно, попада в диапазона на размери, обхванат от дефиницията на наноматериалите. Съвременните нанотехнологии предлагат разнообразие от високотехнологични решения за целите на превенцията на инфекции (дизайн и производство на ефективни лични предпазни средства (ЛПС), разработване на ваксини, на лекарства за предекспозиционна профилактика и др.); за диагностика (откриване на вируса в биологични проби и проби от околната среда, като напр. смивки, отривки, отпечатъци и пр.); за управление на ранните етапи на инфекцията (постекспозиционна профилактика), както и ефективни лечения в случаите, когато заболяването, свързано със SARS-CoV-2, вече се е развило. Към момента има всички основания да се очаква, че базираните на наноматериали сензори, лекарства и ваксини ще играят критична роля в управлението на пандемията в близко бъдеще [52, 41].

Към днешна дата са разработени редица нанотехнологични решения за детекция на SARS-CoV2, ограничаване на разпространението на инфекцията, за подобряване на ефективността на лекарствата и ваксините. Подробен преглед на разнообразието на наноматериали и техните приложения може да се види тук: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8308319/table/nanomaterials-11-01788-t001/?report=objectonly

2.1. Приложение на нанотехнологиите за превенция на заразяване със SARS-CoV-2

Сериозният инфекциозен потенциал на SARS-CoV-2 беше открит още при ранните му варианти в самото начало на пандемията. Впоследствие, обаче, по-късните варианти Делта и Омикрон определено надминаха очакванията по отношение на капацитета си за разпространение [https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/science/science-briefs/sars-cov-2-transmission.html]. Най-голям инфекциозен потенциал имат вирусните частици на SARS-CoV-2, които се съдържа във фините капчици секрет, отделящи от инфектирания индивид когато той говори, кашля и киха, тъй като те могат да попаднат директно в дихателните пътища на други индивиди. По-едрите капки (които, естествено, също съдържат вирусни частици) също имат висок инфекциозен потенциал, когато се намират върху повърхности и предмети, които често се докосват [https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/variants/omicron-variant.html].

Рутинното защитно облекло и оборудване (платнени, марлени и хирургически лицеви маски, респиратори, престилки, ръкавици и пр.) е доказало ефективността си при използване за защита от заразяване с други често срещани заболявания, предавани по въздушно-капков път (грип, варицела и други). Вирусната частица на SARS-CoV-2, обаче, прониква лесно през обичайните предпазни средства. Поради това се положиха много усилия за разработването на нови или модифицирани видове ЛПС и именно поради размера на вируса се наложи използването на нанотехнологии. Бяха разработени нови материали за изготвяне на нановлакна и фино омрежени тъкани от нановлакна (наномрежи) за изготвяне на защитни лицеви маски за медицинския персонал и екипите, оказващи доболнична помощ. Лицевите маски с висока ефективност на предпазване от SARS-CoV-2 (покриващи изискванията на стандарт FFP2, FFP3 и N95) използват комбинация от наномрежа и електростатичен заряд, които дават висока степен на защита от по-големите капки секрет от дихателните пътища [9]. Стандартните FFP маски се изработват чрез 3D принтиране, за да прилягат плътно към лицето на потребителя. Някои от тях имат формован накрайник за нос за създаване на херметично уплътнение между лицето и маската. Според изискванията, които маските с висока ефективност за предпазване от по-големи капки (>0,3 μm) трябва да покриват, за да могат да бъдат пуснати на пазара, процентът на филтрирани капки трябва да бъде най-малко 78% за маските стандарт FFP1, 92% за FFP2 и 98% за FFP3 [https://www.protectivemasksdirect.co.uk/ffp3-masks-hse-guidance].

Допълнително повишаване на филтрационната ефективност може да се осигури чрез импрегниране на слоевете на маската със съединения с антимикробно и антивирусно действие. Към момента успешно за тази цел са използвани наночастици от сребърен и меден оксид, както самостоятелно, така и натоварени с други вещества с бактерицидно и/или вирусоцидно действие (напр. йод) [6, 1].

Тъй като маските с висока степен на филтрация са скъпи, осигурена е възможност за многократното им използване след почистване чрез специални нанопокрития (силициеви, графенови и други), които дават възможност за почистване на филтъра[14, 75].

Вирусните частици проникват през порите на филтъра на маската. Размерът на порите във филтъра може да бъде намален допълнително чрез импрегниране с полимери – напр. ß-циклодекстрин. Трябва да се отбележи обаче, че докато безопасността за носителя на маската е от решаващо значение, една абсолютно плътно прилягаща лицева маска за лице с минимален размер на порите в действителност може, парадоксално, да доведе до повишаване на риска от заразяване поради създаване на дискомфорт на потребителя. Стандартните хирургически маски и респиратори се характеризират със сравнително ниска пропускливост за въздух, вследствие на което потребителят сравнително бързо започва да изпитва дискомфорт и започва да придърпва, разхлабва и намества маската. Съвременните нановлакна създават фина мрежа с отлична въздушна пропускливост, подобрявайки ефективността на филтрацията на маските.

Нанотехнологии се използват и за производството на медицински ръкавици и други бариерни ЛПС. Специално внимание заслужават ръкавиците, импрегнирани със сребърни наночастици, които имат както бактерициден, така и вирусоциден ефект.

През 2021 г. беше направено едно интересно предложение за разработка на ЛПС, базирано на нанотехнологии – улавяне и секвестриране на вирусни частици чрез лиганд-рецепторно взаимодействие, основано на патогенетичния механизъм на навлизане на SARS-CoV-2 в клетката. По-точно, предложението беше филтрите на лицевите маски, ръкавиците и другите ЛПС, използвани от медицинския персонал да бъдат импрегнирани с ACE2-рецептор, изготвен с помощта на рекомбинантни ДНК технологии (които също са, по същество, нанотехнологии). По този начин вирусните частици, които са преодолели чисто бариерната функция на защитните средства биха се свързали с изкуствения АСЕ2 рецептор и по този начин рискът от заразяване би бил сведен до минимум [2]. Публикуването на пълните резултати от това проучване, обаче, тепърва предстои.

SARS-CoV-2 е вирус с липидна обвивка, както и грипният вирус, HCV, HBV и HIV. Поради това, най-често използваните в момента дезинфектанти за ръце и повърхности са на базата на етанол или 2-изопропанол. Счита се, че концентрацията на етанол, която напълно инактивира вируса, е над 35 % v/v [44]. Етанолът и изопропанолът обаче са летливи и лесно запалими, както и сравнително скъпи. Също така, излагането на действието им може да има неблагоприятни ефекти, както локални (дразнене на кожата, алертични реакции), така и системни (главоболие, гадене, замаяност). Поради естеството на производството им, в тях могат да се съдържат други вредни за човека съединения в потенциално опасни концентрации. Вече са разработени няколко вида дезинфектанти за ръце и повърхности на базата на наночастици от титанов оксид, сребро, капсулиран водороден пероксид, както и на инженирани водни наноструктури [49, 7, 65]. Те осигуряват добро бактерицидно и вирусоцидно действие.

2.2. Приложение на нанотехнологиите за диагностика на наличие на вирусни частици на SARS-CoV-2

Независимо от сродството му с досега известните бета-коронавируси, SARS-CoV-2 се оказа различен от тях както по отношение на биологията си, така и по отношение на параметрите си на разпространение. Вирусът има много висок инфекциозен потенциал, но не всички хора, изложени на вируса, се заразяват. Заразеното лице, дори когато е симптомно, не произвежда специфичен клиничен и лабораторен фенотип, който да позволява надеждно диагностициране на COVID-19 въз основа само на клинични или клиниколабораторни данни. Инкубационният период след заразяване може да варира значително – между 2 и 14 дни (въпреки че понастоящем се смята, че ако няма проявени симптоми 7 дни след последния контакт с вируса, малко вероятно е контактното лице да е заразено). Диференциалната диагноза на леки и умерени случаи на COVID-19 може да включва практически всякаква друга респираторна инфекция, тъй като няма патогномонични за инфекцията с COVID-19 симптоми и признаци. При тежките случаи клиничната картина е неспецифична и може да наподобява усложнени възпалителни заболявания, сепсис, съдови инциденти и др. Значителна част от случаите се откриват само при образни изследвания, тъй като относителният дял на фалшиво-отрицателните тестове за наличие на вирусен антиген или вирусна РНК при SARS-CoV-2 е относително висок.

Както всеки РНК вирус, SARS-CoV-2 има вътрешно присъщ много висок мутационен потенциал. Това му дава възможност чрез ускорена микроеволюция да избягва от обсега на рутинната диагностика. Разработването на диагностичен тест за COVID-19, който да съчетава едновременно бързина на получаване на резултата, висока чувствителност и висока специфичност все още е въпрос на бъдещето.

COVID-19 е модерна пандемия, поради което съвременните технологии, включително и нанотехнологиите, бяха впрегнати в борбата с вируса. Повечето от технологиите и устройствата, използвани за откриване на SARS-CoV-2, са базирани на тези, разработени няколко години преди това за откриване на родствените вируси SARS и MERS. Поради наличието на предходни данни, нанотехнологиите бяха използвани за целите на диагностицирането на инфекции със SARS-CoV-2 още в първите месеци след началото на пандемията. Едни от първите наноматериали, тествани и одобрени за бърза детекция на вирусни агенти още преди появата на COVID-19 бяха сребърни и златни наночастици, към които са свързани полипептиди и белтъчни молекули [32, 47]. Други, също успешно използвани за откриване на вирусни частици, се основават на молекулна хибридизация. Такива са технологиите, основани на ДНК сонди, имобилизирани върху въглероден електрод, покрит със златни наночастици; както и златни наночастици, покрити с антисенс олигонуклеотиди. Разпознаването и свързването към таргетната нуклеинова киселина е спрегнато с ензимна реакция, при кояго от хромогенен или флуоресцентен субстрат се получава цветен или флуоресциращ продукт, осигурявайки бърза визуална детекция и, при нужда, количествена оценка [39, 30, 42].

Тъй като основната входна врата и първично място за намножаване на SARS-CoV-2 в човешкия организъм е лигавицата на носоглътката, в тестовете за детекция на SARS-CoV-2 обикновено се използва материал, събран от назофаринкса или гърлото с помощта на тампон или четчица. Този метод на пробовземане има относително ниска степен на инвазивност, но тъй като неминуемо включва близък контакт между пациента и пробовземащия, понякога се разглежда от пациентите като нарушение на личното им пространство. Това може да доведе до неефективна техника на пробовземане, за да се избегнат оплакванията на пациента, и, съответно до повишаване на и без това немалкия процент на фалшиво-отрицателни резултати. Като решение на този въпрос бяха предложени по-малко инвазивни подходи за откриване и бърз скрининг за SARS-CoV-2 – в издишан въздух с помощта на биосензор, съдържащ на златни наночастици [57, 19]. Засега обаче тази методология не се е наложила.

Магнитните наночастици се използват сравнително отдавна в молекулярната диагностика за изолиране и пречистване на нуклеинови киселини от биологични проби и проби от околната среда. През 2008, магнитни наночастици бяха използвани за изолиране на РНК на SARS-CoV-1, причинителят на тежкия остър респираторен синдром [20]. На тази база през 2020-2021 г. беше разработен специализиран протокол за екстракция на РНК на SARS-CoV-2 с използване на намагнитени наночастици от цинков ферит [58; 76].

Квантовите точки са кристали с изкуствен произход с размери в нанодиапазона. Те съдържат електрони, чието квантово състояние може да бъде променено при облъчване с точно определени дължини на вълната. Те могат да преминат във високоенергетично възбудено състояние или в нискоенергетично състояние, излъчвайки светлина с определена дължина на вълната. Квантовите точки притежават свойства на полупроводници и могат да имат различни оптически характеристики в зависимост от размера си. Специфичните оптични свойства на квантовите точки им позволяват да се използват като репортерни елементи в биосензори. Още през 2011 г. , квантови точки бяха били използвани в биосензор за откриване на нуклеокапсидния антиген на SARS [56]. През 2020 г. Liu et al. адаптираха същата технология за откриване на SARS-CoV-2 [33].

Други видове наноматериали, като напр. т.нар. „въглеродни квантови точки“, въглеродни нанотръбички, нанодиаманти и пр. са използвани предходно за пречистване и концентриране на проби, съдържащи нисък вирусен товар [72]. Беше установено, че това значително увеличава чувствителността на детекция на вирусни нуклеинови киселини.

Нанозимите са друг вид изкуствено създадени молекули с размери в нанодиапазона, които притежават каталитична активност. Сравнително наскоро, през 2020 г., беше разработена методология за бърза и високочувствителна детекция на SARS-CoV-2, базирана на използване на нанозим по-точно, изкуствено създадена Co-Fe хемин пероксидаза [33]. Според авторите, тази технология осигурява откриване на присъствие на вирусен белтък в концентрация по-малко от 10 pg/ml. Не е за подценяване и фактът, че времето от пробовземането до получаването на резултатите е само около 15 минути (колкото е и технологичното време на най-масово използваните в момента „бързи тестове“).

Нанотехнологиите подпомогнаха и серологичната детекция за SARS-CoV-2 (популярно известна като „изследване на антитела“). През 2020 г. от Huang et al. беше разработен диагностичен тест за бързо откриване на IgM срещу SARS-CoV-2 (свидетелстващи за „прясна“ инфекция) с помощта на вирусен нуклеопротеин, конюгиран със златни наночастици [23]. Получаването на резултатите при тази методология също отнема, според авторите на цитираното проучване, по-малко от 15 минути.

3. Нанотехнологиите в помощ на борбата срещу COVID-19: научно-изследователска дейност в областта на разработване на лекарства

Когато в началото на 2019 г. SARS-CoV-2 за първи път демонстрира капацитета си за заразяване и предизвикване на кратковременни и отдалечени последствия, изследователите, разработчиците на технологични решения и клиничната и фармацевтичната общност осъзнаха заплахата почти незабавно и реагираха като обединен фронт за отпор на пандемията. Това даде възможност сравнително бързо (в рамките на седмици и месеци) да бъдат преустроени съществуващите дотогава представа за особеностите на защитата от инфекциозни заболявания и да се модифицира драстично първоначално разработеният протокол за лечение на инфекцията. По този начин се осигури възможност за контрол над разпространението на пандемията и за намаляване на относителния дял на случаите с неблагоприятен изход. Към настоящия момент нанотехнологиите имат потенциала да се превърнат в неразделна част от разработването на лечения за COVID-19. Те могат да предоставят нови платформи за насочена доставка на лекарства, моноклонални антитела и други биоактивни вещества до прицелната тъкан или орган и контролирано по време освобождаване на лекарствения продукт. Тази област на материалознанието се развива интензивно, макар и за момента да изостава в сравнение с огромния подем в областта на разработките на фармацевтични продукти с антивирусни и имуномодулиращи свойства. Като се има предвид ускоряването на процеса на изследователска и развойна дейност във връзка с пандемията, може да се очаква, че разработването на нови нано-базирани лекарства и ваксини срещу вируса ще бъде основа на диагностиката и терапията на заболяването в близкото бъдеще.

3.1. Антивирусни средства срещу COVID-19

3.1.1. Фавипиравир

Фавипиравир представлява гуанозинов аналог, който се свързва и инхибира РНК-зависимата РНК-полимераза на SARS-CoV-2. Той е предходно съществуващо лекарство, първоначално използвано в Япония за лечение на грип под търговската марка Avigan (Fujifilm Toyama Chemical Co, Ltd.) След появата на SARS-CoV-2, в Китай започнаха изпитания на фавипиравир за лечение на COVID-19 и през м. февруари 2020 г. лекарството получи статут на лекарство против с променено предназначение под името Favilavir (Zhejiang Hisun Pharmaceutical) https://www.pharmaceutical-technology.com/news/china-favilavir-testing-approval/. По-късно през 2020 г. фавипиравирът беше одобрен и в Италия за експериментална употреба срещу COVID-19 [13]. Фавипиравир се прилага през устата и се изписва само от лекар. В литературата неколкократно е докладвано, че фавипиравир може да се използва при леки случаи на COVID-19, особено при пациенти, които презентират с повишена температура [27, 62], но лекарството все още не се счита за достатъчно ефикасно, за да бъде прилагано масово. Официалното изявление на Fujifilm Toyama Chemical Co. в тази връзка е: „…на този етап клиничното приложение на Avigan…за лечение на Covid-19 е в процес на проучване и подготовка, за да се получат ясни доказателства за ефикасността и безопасността на лекарството“ [https://www.fujifilm.com/fftc/en/avigan].

През 2020 г. беше докладвана нова технология за насочена доставка на фавипиравир директно в белодробния епител чрез наноемулсия [55]. През 2021 г. бяха разработени твърди липидни наночастици за целите на насочена доставка на фавипиравир до белия дроб посредством разпрашаване [64]. Тези изследвания, обаче, към момента са на етап in vitro, а проучванията in vivo тепърва предстоят.

3.1.2. Молнупиравир (Lagevrio на Merck)

Молнупиравирът също представлява нуклеозиден (пиримидинов) аналог, който инхибира РНК-зависимата РНК-полимераза на SARS-CoV-2 [46]. Подобно на фавипиравир, молнупиравир беше първоначално разработен за целите на лечение на грипна инфекция. Разрешението за спешна употреба (Emergency Use Authorization, EUA) за молнупиравира беше предоставено от Федералната агенция по лекарствата на САЩ (Federal Drug Agency, FDA) на 23 декември 2021 г., на следващия ден след предоставянето на EUA за комбинирания препарат Paxlovid (виж по-долу) [https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-additional-oral-antiviral-treatment-covid-19-certain]. Както и фавипиравирът, молнупиравир се прилага перорално и само по лекарско предписание. Показан е за употреба при нехоспитализирани възрастни пациенти с „…лека до умерена коронавирусна болест…с положителен резултат от тест за наличие на РНК на SARS-CoV-2, при които има висок риск от прогресия до тежък COVID -19, включително хоспитализация или смърт, и за които други варианти за лечение на COVID-19, разрешени от FDA, не са достъпни или не са клинично подходящи“. Понастоящем EUA за това лекарство не разрешава прилагането му при деца. Според действащия протокол, приложението на молнупиравир при наличие на показания за това трябва да започне в рамките на пет дни от появата на първите симптоми. Според проучванията, при пациенти с висок риск прилагането на молнупиравир може да намали риска от хоспитализация или смърт с 50% [37, 25, 69]. Честотата на свързаните с лекарството нежелани събития е сравнима с честотата, която се наблюдава при болни, лекувани с други терапевтични схеми [69]. Има развитие в посока използване на нанотехнологии за осигуряване на по-добро доставяне и по-висока бионаличност на молнупиравир [25], но изпитанията за това все още са в ход.

3.1.3. Ремдесивир

Remdesivir (Veklury на Gilead Sciences) беше едно от първите специфични лекарства срещу COVID-19, което при изпитанията си демонстрира висока ефикасност. Той представлява аденозинов аналог, който се свързва с нарастващата нуклеотидна верига при репликацията на вируса и инхибира нейния синтез [21]. Ремдесивир беше първоначално разработен за лечение на хепатит С. Впоследствие беше установено, че е ефикасен при животни, заразени с вируса Ебола [68], но при употреба при хора, ефикасността му е по-ниска от другите терапевтични средства за лечение на Ебола [43]. За разлика от повечето други антивирусни средства за лечение на COVID-19, ремдесивир се използва само парентерално, като бавна интравенозна инфузия. Той е показан за употреба само при хоспитализирани пациенти с тежко протичане на COVID-19. Първоначално лекарството беше одобрено за използване при възрастни и деца (при условие, че са на възраст ≥12 години и тежат ≥40 kg) с COVID-19 с тежко протичане и дихателна недостатъчност, които вече приемат дексаметазон [https://www.covid19treatmentguidelines.nih.gov/management/clinical-management/hospitalized-adults–therapeutic-management/].

По-късно ремдесивир беше одобрен за употреба и при по-малки деца и при определени групи нехоспитализирани пациенти [https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-takes-actions-expand-use-treatment-outpatients-mild-moderate-covid-19]. Пациентите, които отговарят на критериите за лечение с ремдесивир трябва да имат доказан чрез тестване за наличие на вирусна РНК COVID-19 (въпреки че в случаите, когато няма положителен тест, наличието на образни находки (рентгенографско или от компютърна томография, напр. тип „матово стъкло“) може да е достатъчно, за да бъде оправдана употребата на лекарството). Нуждата от приложение на ремдесивир се преразглежда във всеки отделен случай, но като цяло е противопоказана при пациенти с високостепенна чернодробна и бъбречна недостатъчност и се прилага само след отрицателна кожна алергична проба.

До момента са публикувани няколко доклада във връзка с използването на нанотехнологиите за насочване на доставката на ремдесивир до прицелните тъкани. Един от тях, който е базиран на използването на нановезикули от ко-полимер на млечната и гликоловата киселина, съдържащи ремдесивир, обещава да стане основа на ефективна платформа за подобрено доставяне на лекарството [71]. Приложими клинично резултати, обаче, все още се очакват, тъй като положителните данни засега са на ниво компютърно моделиране.

3.1.4. Нирматрелвир/ритонавир (Paxlovid на Рfizer)

В края на декември 2002 г. FDA издаде разрешение за спешна употреба за комбинирания препарат на Pfizer Paxlovid (нирматрелвир и ритонавир). Нирматрелвир е протеазен инхибитор. Той се свързва ковалентно и инхибира вирусната протеаза 3CLpro, която частично хидролизира полипротеина, генериран от транслацията на вирусната иРНК, за да се получат отделните вирусни белтъци [45]. Нирматрелвир беше разработен на основа луфотрелвир – протеазен инхибитор с подобно действие, който предходно също беше подложен на предклинични изпитания за лечение на COVID-19 [5]. Другият компонент на лекарството – ритонавир – е добре проучен и често използван инхибитор на CYP3A, който често се включва в режимите за високоактивна антиретровирусна терапия (highly active antiretroviral therapy – HAART, сега вече наричана само антиретровирусна терапия – ART) за лечение на HIV инфекция. Това намалява скоростта на разграждане на нирматрелвира от клетъчните протеази и по този начин води до повишаване на серумните му нива [40]. Според едно скорошно прессъобщение на Pfizer, Paxlovid намалява риска от хоспитализация или смърт на пациентите с COVID-19 с 89% [https://www.pfizer.com/news/press-release/press-release-detail/pfizers-novel-covid-19-oral-antiviral-treatment-candidate]. Paxlovid се прилага перорално и е показан за лечение на COVID-19 при възрастни пациенти и деца (на възраст над 12 години и с тегло над 40 килограма), при които протичането е от леко до умерено тежко, но по някаква причина имат висок риск за прогресия до тежък COVID-19 (включително хоспитализация или смърт) [https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-first-oral-antiviral-treatment-covid-19]. Paxlovid се предписва само от лекар и лечението трябва да започне не по-късно от пет дни след появата на първите симптоми. Проучванията за ефекта на Paxlovid върху хода на COVID-19 при пациенти с висок риск все още са малобройни. Това налага допълнителни проучвания, за да се изясни дали е реално предходно докладваното намаление на риска от хоспитализация и смърт. Един от публикуваните мета-анализи показва, че пациентите, които са приемали Paxlovid в ранните етапи на развитие на клиничната картина на COVID-19 са имали по-ниска честота на поява на усложнения и че относителният дял на нежеланите събития, свързани с терапията с Paxlovid, е близък до този в плацебо групата [69]. Натрупаните данни, обаче, все още не са достатъчни, за да се направят надеждни заключения за ефикасността и безопасността на лекарството.

До момента, нанотехнологиите и наноматериалите не са намерили значително приложения за повишаване на бионаличността, ефикасността или подобряването на доставката на Paxlovid до прицелните тъкани.

3.1.5. Лопинавир/ритонавир

Лопинавир/ритонавир (Kaletra на Abbott или Aluvia на AbbVie) също е комбинация от протеазни инхибитори, която е част от съвременната терапия за лечение на HIV-инфекция. Недостатък на лекарството е ниската водоразтворимост, което води до трудно предсказуема бионаличност при различните пациенти. През 2016 г. беше докладвано разработването на гранулирана форма на лопинавира, които при разтваряне във вода спонтанно се самосглобяват до наночастици, съдържащи активния компонент. Това води до подобрение на ефективността на доставка на лекарството [48]. Kaletra е едно от лекарствата, което за кратък период беше използвано в лечението на COVID-19 при хоспитализирани пациенти. Впоследствие, обаче, редица проучвания (включително и проучването RECOVERY) показаха, че използването на Kaletra не намалява значимо риска от хоспитализация и смърт при пациенти с COVID-19 [53]. По-късно проучванията на Patel et al. свидетелстваха, че честотата на нежеланите събития е дори по-висока при пациентите, лекувани с лопинавир/ритонавир в сравнение с пациентите, получили друго лечение [60]. Поради това, в момента този комбиниран препарат не се използва в лечението на пациенти с COVID-19.

3.2. Моноклонални антитела (МАБ) за лечение на инфекции със SARS-CoV-2

Моноклоналните антитела се използват успешно при лечението на редица имунни и автоимунни заболявания като ревматоиден артрит, псориатичен артрит, улцерозен колит и болест на Crohn, някои неоплазми, цитокинови бури вследствие на тежки инфекции, при трансплантирани пациенти и др. Най-честите нежелани събития при прилагане на моноклонални антитела са алергични реакции, включително и анафилактичен шок.

Всички МАБ, използвани понастоящем при терапията на COVID-19 се използват при пациенти с леко и умерено тежко протичане, при които има риск от развитие на тежки усложнения. Повечето МАБ са насочени към структурните белтъци на вируса, но могат да бъдат и насочени срещу ключови белтъчни компоненти на пътищата на възпалението (какъвто е тоцилизумаб – виж по-долу). Понастоящем само за моноклоналните антитела, които са насочени към S-белтъка на SARS-CoV-2 е доказано наличие на значима клинична полза [28]. Някои моноклонални антитела могат да се използват като преекспозиционна профилактика (за подробности, виж по-долу). Няколко неутрализиращи моноклонални антитела имат разрешение за спешна употреба от FDA за използване в амбулаторни условия при пациенти с доказана инфекция с SARS-CoV-2. Четири от тях се използват в комбинация (бамланивимаб и етесевимаб, казиривимаб и имдевимаб), докато сотровимаб, бебтеловимаб и регданвимаб могат да се използват самостоятелно. Една комбинация от две антитела (тиксагевимаб и цилгавимаб) е разрешена за употреба в момента само с цел пре-експозиционна профилактика.

3.2.1. Бамланивимаб и етесевимаб (генеричен препарат на Ely Lilly)

Бамланивимаб и етесевимаб се свързват с различни, макар и припокриващи се епитопи в рецептор-свързващия домен на шиповия белтък на SARS-CoV-2. Прилагат се под формата на интравенозна инфузия. Проучването BLAZE-1 демонстрира клинична полза от използването на тази комбинация при пациенти на над двегодишна възраст с леко до умерено тежко протичащ COVID-19 [12]. Бамланивимаб и етесевимаб, обаче, се оказаха с намалена активност срещу варианта Oмикрон и поради това, (поне към момента) FDA ограничи целенасочено тяхната употребата при пациенти с COVID-19 [https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-limits-use-certain-monoclonal-antibodies-treat-covid-19-due-omicron].

3.2.2. Казиривимаб и имдевимаб (REGEN-COV на Regeneron, Ronapreve на Roche)

Казиривимаб и имдевимаб са моноклонални антитела, които се свързват с неприпокриващи се епитопи на рецептор-свързващия домен на шиповия белтък. Според Комитета по лекарства, предназначени за употреба при хора (Human Medicines Committee of the European Medicine Agency, CHMP) на Европейската агенция по лекарствата, комбинираният препарат Ronapreve значително намалява честотата на хоспитализациите и смъртните случаи при пациенти с COVID-19, при които има риск от тежки усложнения [COVID-19: EMA recommends authorisation of two monoclonal antibody medicines | European Medicines Agency (europa.eu)].

3.2.3. Сотровимаб (Xevudy на GlaxoSmithKline)

Сотровимаб е МАБ, специфично към един от епитопите в рецептор-свързващия домен на шиповия белтък, който е висококонсервативен при родствените SARS-CoV и SARS-CoV-2. Поради това, сотровимаб притежава ефикасност срещу варианта Омикрон [https://www.fda.gov/media/149534/download]. Показан е за употреба при нехоспитализирани възрастни пациенти или деца на възраст ≥12 години и с тегло ≥40 kg с леко до умерено тежко протичащ COVID-19, при които има висок риск от развитие на усложнения. Прилага се като еднократна интравенозна инфузия или подкожно в първите 10 дни от появата на първите симптоми.

3.2.4. Бебтеловимаб (генерично, на Ely Lilly)

Бебтеловимаб е друго моноклонално антитело, насочено към шиповия белтък, което, според наличните данни, има значима активност срещу варианта Омикрон. Той получи разрешение за спешна употреба от FDA през февруари 2022 г. за употреба при възрастни и деца с леко до умерено тежко протичащ COVID-19 [https://investor.lilly.com/news-releases/news-release-details/lillys-bebtelovimab-receives-emergency-use-authorization]. Бебтеловимаб се прилага като еднократна интравенозна инжекция.

3.2.5. Тиксагевимаб/цилгавимаб (Evusheld на Astra Zeneca)

Тиксагевимаб и цилгавимаб са МАт, свързващи се с неприпокриващи се епитопи на рецептор-свързващия домен на шиповия белтък [10]. Към момента, комбинацията тиксагевимаб/цилгавимаб се използва за пре-експозиционна профилактика. Подходящи за лечение са лица, за които към момента има данни от молекулярна диагностика, че не са заразени със SARS-CoV-2 и не са били в скорошен контакт със заразено лице, но имат присъщ висок риск от неадекватен имунен отговор при ваксинация срещу COVID-19 или имат документирана анамнеза на тежка нежелана реакция след поставяне на ваксина срещу COVID-19 или някой от нейните компоненти [https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-new-long-acting-monoclonal-antibodies-pre-exposure].

3.2.6. Регданвимаб (Regkirona на Celltrion)

Регданвимаб е човешко моноклонално антитяло, насочено срещу шиповия белтък на SARS-CoV-2. Прилага се парентерално като еднократна венозна инфузия. Показан е за лечение на възрастни с лека до умерена форма на COVID-19, които към момента не се нуждаят от кислородотерапия, но имат повишен риск от прогресия до тежкопротичащ COVID-19 [https://www.ema.europa.eu/en/documents/product-information/regkirona-epar-product-information_en.pdf]. Според официалното становище на CHMP приложението на Regkirona значително намалява риска от хоспитализация и смърт при пациенти с COVID-19, които имат риск от тежки усложнения [COVID-19: EMA recommends authorisation of two monoclonal antibody medicines | European Medicines Agency (europa.eu)].

3.2.7. Тоцилизумаб (Actemra, RoActemra на Roche)

Тоцилизумаб се прилага успешно като биологично лечение при различни автоимунни заболявания, включително ревматоиден артрит и системен ювенилен идиопатичен артрит. Това е хуманизирано моноклонално антитяло срещу рецептора за интерлевкин-6 (IL-6). Тъй като IL-6 играе основна роля в процеса на възпалението и е сред ранните маркери за възпаление при COVID-19, първоначално се считаше, че подтискането на сигнализацията, опосредствана от IL-6 може да намали смъртността сред пациентите. По това време за основен патогенетичен механизъм на усложненията, свързани с COVID-19, се смяташе цитокиновата буря в резултат на разрегулиране на имунната сигнализация. Тоцилизумаб получи разрешение за спешна употреба от FDA за лечение на COVID-19 през юни 2021 г. [https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-drug-treatment-covid-19]. Резултатите от няколко големи проучвания (RECOVERY, REMAP-CAP) по това време показваха, че употребата на тоцилизумаб при пациенти, които вече получават дексаметазон води до допълнително намаление на смъртните случаи сред пациентите [73]. Първоначалният ентусиазъм обаче скоро беше поохладен поради наблюдаваното значително повишаване на нивата на трансаминазите у лекуваните с тоцилизумаб пациенти. Повишаването на трансаминазите е известен нежелан ефект от лечението с тоцилизумаб. Също така това е и типична лабораторна находка в хода на COVID-19, която е както израз на общия възпалителен отговор, така и на чернодробно увреждане. Оказа се, че употребата на тоцилизумаб увеличава риска от развитие на сериозно увреждане на черния дроб при пациенти с COVID-19. През юли 2020 г. Hoffmann-LaRoche обяви, че лечението с тоцилизумаб не подобрява клиничния статус на пациенти с COVID-19 пневмония и не води до намаление на смъртността на пациентите: [Roche provides an update on the phase III COVACTA trial of Actemra/RoActemra in hospitalized patients with severe COVID-19 associated pneumonia“]. Към момента тоцилизумаб не се препоръчва за употреба при пациенти с COVID-19.
През пролетта на 2021 г. беше проведено изпитване на комбиниран инхалаторен препарат, съдържащ фавипиравир и тоцилизумаб, опакован в мукоадхезивни везикули [61] Засега не са публикувани резултати, които да показват значими ползи от използването на тази препарат.

3.3. Други лекарства с потенциал за употреба при пациенти с COVID-19

3.3.1. SQAd/VitE наночастици

Едно проучване, публикувано през 2020 г., описва разработването на препарат с антивъзпалително действие, базирано на използване на наночастици [11]. Наночастиците съдържат конюгат на естествено срещаните съединения сквален (с антивъзпалително действие) и аденозин (с имуномодулаторно действие), опаковани заедно с α-токоферол (антиоксидант). Авторите на това проучване считат, че това лекарство и подобните му препарати имат потенциал за приложение като нов терапевтичен подход при лечението на възпалителни заболявания. Евентуалните клинични приложения, обаче, все още са далече от практиката.

3.3.2. Барицитиниб

Барицитиниб (Olumiant, на Ely Lilly) е предходно съществуващо лекарство, базирано на инхибиране на сигналните пътища, медиирани от Janus киназата (JAK). Най-честата му употреба е при лечение на ревматоиден артрит, където е лекарство от втора линия. Първоначално барицитиниб не беше разрешен като самостоятелно лечение за COVID-19. През ноември 2020 г. FDA издаде разрешение за употребата на комбинацията ремдесивир/барицитиниб при хоспитализирани възрастни и деца на ≥ 2 годишна възраст с COVID-19 и тежка дихателна недостатъчност [https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-drug-combination-treatment-covid-19]. През 2021 г. беше докладвано, че използването на комбинацията барицитиниб/ремдесивир превъзхожда самостоятелното използване на ремдесивир при пациенти с тежък COVID-19, особено при тези, които са на неинвазивна вентилация, и че има добър профил на безопасност [26]. През юли 2021 г. разрешението за спешна употреба беше преразгледано и понастоящем барицитиниб може да се използва и самостоятелно за лечение на COVID-19 [https://www.thepharmaletter.com/article/fda-authorizes-baricitinib-alone-as-treatment-for-covid-19, https://www.fda.gov/media/143822/download]

3.3.3. Флувоксамин (Fevarin на Mylan и Luvox на Solvay Pharmaceuticals, Inc.)

Флувоксамин е селективен инхибитор на обратния захват на серотонина (selective serotonine reuptake inhibitor, SSRI), който се използва в клиничната психиатрия от десетилетия. Обикновено се предписва при тежко депресивно разстройство и обсесивно-компулсивно разстройство, но се прилага и при тревожни разстройства [17]. Има добър профил на безопасност, с по-ниска честота на типичните нежелани реакции, свързани с употребата на SSRI – главболие, тревожност, раздразнителност, сексуална дисфункция и усложнения от страна на сърдечно-съдовата система. Механизмът на действие на повечето лекарства, използвани в психиатрията обикновено включва действие върху повече от една молекулни „мишени” и, съответно, са описани множество потенциални странични ефекти. Поради това, възможността за насочена доставка на лекарства винаги е била критично важна в клиничната психиатрия. През 2019 г. беше съобщено за разработване на натоварени с флувоксамин твърди липидни наночастици, които, според авторите, дават възможност за насочен транспорт и ефективно освобождаване на лекарството, които могат да се контролират по време и място [29].

До момента са проведени поне три рандомизирани проучвания, посветени на изучаване на ефектите на флувоксамина при лечение на амбулаторни пациенти с COVID-19. Първото (STOP COVID) – показва намаление на риска от клинично изразено влошаване на статуса при пациентите, лекувани с флувоксамин [69]. Второто проучване беше преустановено от Борда за наблюдение на безопасността на проекта преди завършване на заложените периоди на изпитание, тъй като наблюдаваните на междинни нива ефекти от лечението бяха значително по-ниски от теоретично очакваните [69]. Третото беше проучването TOGETHER, което показа през 2022 г., че в стандартни терапевтични дози флувоксаминът може да доведе до намаляване на тежестта на симптомите, свързани с COVID-19 и намаляване на смъртността при нехоспитализирани пациенти с рано диагностицирано заболяване и висок риск от усложнения [54, 69]. Тъй като резултатите от проучванията са противоречиви, ефектите от употребата на флувоксамин при пациенти с COVID-19 са обект на допълнителни проучвания. Заявление за разрешение за спешна употреба на флувоксамин при пациенти с COVID-19 беше подадено до FDA [https://www.medpagetoday.com/special-reports/exclusives/96431], но към днешна дата няма данни да е издадено такова.

4. Ваксини, съдържащи наночастици

4.1. Исторически преглед и основни механизми на ваксинацията като метод за предпазване от инфекциозни заболявания

От края на XVIII век, когато Едуард Дженър приложи на практика наблюденията си върху кравешката шарка за създаване на невъзприемчивост срещу едра шарка, ваксините се превърнаха в основно оръжие в арсенала на медицината срещу инфекциозните болести. Строго погледнато, заслугата за въвеждането на практиката на ваксинация не е единствено на Дженър, тъй като той несъмнено е бил запознат с източната практика на „вариолизация“ (въведена във Великобритания няколко години от Мери Уортли Монтегю) и изследванията на д-р Джон Фюстър, който също е демонстрирал устойчивост към заразяване с едра шарка при подопитни индивиди, влизали в контакт с материали, съдържащи вируса на кравешката шарка [63]. Блестящата публична репутация на Дженър и високият му социален статус, обаче, допринасят в огромна степен за популяризацията на неговите ваксинални практики. През XX век се разработват множество ваксини срещу различни често срещани инфекциозни заболявания и част от тях стават задължителна част от ваксинационния календар по целия свят. Налични са и ваксини срещу ендемични инфекциозни заболявания като жълта треска, кърлежови енцефалити, японски енцефалит, коремен тиф и други. Някои от тях са задължителни за пътуващите в райони с ендемична ваксинопредотвратима болест, а други са пожелателни.

Най-общо казано, действието на ваксините се заключава в следното: по един или друг начин, на имунната система на гостоприемника се представя антиген, типичен за инфекциозния агент, без при това да се осъществява същинска инфекция. По този начин гостоприемникът може да изгради готов за действие механизъм за защита срещу нарушителя още преди срещата си с него или на много ранни етапи на заразяването. „Ваксинация” и „имунизация” са два различни термина, които обаче много често се използват (неправилно) като взаимозаменими. Имунитетът срещу определен агент може да бъде вроден или придобит. Той може да се развие или след ваксинация, или след като гостоприемникът се е срещнал с инфекциозния агент и е преминал естествения ход на инфекциозното заболяване. Ваксинацията включва представяне само на антигена (или повече от един антиген, какъвто е случаят с инактивираните ваксини) на имунната система на гостоприемника без риск (или, както при живите ваксини, с много нисък риск) от заразяване със свързаното заболяване.

4.2. Типове ваксини

От историческа гледна точка се разграничават четири основни типа ваксини:

• Инактивирани (напр. ваксина на Salk срещу полиомиелит, ваксина срещу бяс, ваксина срещу хепатит А и други);
• Живи атенюирани (ваксина на Sabin срещу полиомиелит, ваксините срещу морбили, рубеола и инфекциозен паротит и други);
• Токсоиди (напр. тетанични и дифтерийни анатоксини);
• Субединични ваксини (някои от ваксините срещу грип, напр. FluMist Quadrivalent на MedImmune; ваксини срещу хепатит В и др.). Към тази категория спадат и пептидните, полизахаридните и конюгираните ваксини.

Наскоро към тези категории бяха добавени още два типа ваксини: а именно векторните ваксини (например Zabdeno – срещу Ебола и няколко ваксини срещу SARS-CoV-2); и иРНК ваксини (засега само срещу SARS-CoV-2).

Може да съществуват и да се използват едновременно няколко различни типове ваксини срещу едно и също заболяване. За някои от най-старите ваксини (като полиомиелитната ваксина) може се използват няколко различни типа (напр. в случая на полиомиелита – жива атенюирана или инактивирана ваксина, които се прилагат по различен начин). Различните страни може да имат различна политика по отношение на вида на ваксината, използвана в общата популация (здравите индивиди) и при специални случаи (напр. при имунокомпрометирани). Допреди появата на COVID-19, обаче, никога не е имало толкова голямо разнообразие от ваксини срещу един и същи инфекциозен агент.

иРНК ваксините имат сходен или дори по-добър профил на безопасност в сравнение с повечето други типове ваксини. Когато се прилагат в поне две дози, те осигуряват високи нива на защита (94-95 %) срещу развитието на COVID-19 и свързаните с него усложнения [50, 3]. Хуморалният имунен отговор, предизвикан от повечето използвани в момента иРНК ваксини срещу SARS-CoV-2 има тенденция да намалява след 6 месеца от втората доза. Временно решение за това беше намерено чрез прилагане на трета бустерна доза [31]. Съобщава се, че бустерната доза повишава ефикасността на защитата, осигурена от ваксината, като при ваксинираните с три дози се наблюдават близо 75 % по-малко посещения в отделенията за спешна помощ, свързани с COVID-19 и нуждата от хоспитализация се намалява с над 80 % [16].

4.3. Ваксини срещу SARS-CoV-2

Ваксините срещу SARS-CoV-2, за които към момента е издадено разрешение за употреба, могат да принадлежат към три от четирите основни „класически“ типа, изброени по-горе, или могат да бъдат от по-новите типове векторни или иРНК ваксини.

4.3.1. Ваксини, основани на използване на „класически“ технологии

Инактивирани ваксини срещу SARS-CoV-2 са и двете ваксини, разработени от Sinopharm (Sinopharm BIBP и Sinopharm WIBP) както и Turkovac (на здравните институти на Турция), CoronaVac (SinoVac Biotech), Covaxin (на Bharat Biotech), QazVac (на Казахския изследователски институт за биобезопасност).

Субединичните ваксини обикновено са основани на представяне на шиповия белтък протеин на имунната система на гостоприемника. Такива са: EpiVacCorona (на Центъра по биотехнологии „Вектор”, Corbevax (на Biological E. Ltd.), Novavax, Soberana и ваксината на Sanofi-GSK, която все още няма официално име;

Живи атенюирани ваксини срещу SARS-CoV-2 все още са най-слабо разработени. Понастоящем единствената разработена жива атенюирана ваксина е COVI-VAC на Codagenix Inc., и тя все още е във фаза 1 на изпитанията си.

4.3.2. Приложение на съвременните нанотехнологии за разработване на ваксини срещу SARS-CoV-2

Голяма част от ваксините срещу SARS-CoV-2 спадат към по-новото поколение векторни ваксини. Такива са, например, ваксините Vaxzevria на Oxford/Astra Zeneca; ваксината, разработена от Janssen-Cilag; Спутник V, Convidecia (на CanSino Biologics), и др.

Разработването на иРНК-базирани ваксини датира от поне 20 години. Преди да се разгърне пандемията от COVID-19, обаче, основните усилия в областа бяха насочени към развитието на противогрипни ваксини и специфични антиракови ваксинални препарати. Представители на иРНК ваксините са препаратите Comirnaty (на Pfizer-BioNTech) и Spikevax (на Moderna). И двете работят на един и същи принцип – създаване и поддържане на имунитет спрямо SARS-CoV-2 чрез предварително представяне на изкуствено създадени модифицирани иРНК, от които чрез транслация се получават сегменти от сравнително висококонсервативния  шипов белтък на SARS-CoV-2. Разработката на иРНК ваксини е добър пример за нанотехнологично решение. Получените чрез синтез in vitro иРНК се опаковат в липидни наночастици (напр. липозоми). Тези частици биват поети от дендритните клетки и се транспортират вътреклетъчно до рибозомите, където се транслират. Получените белтъчни фрагменти се експортират на повърхността на антиген-представящите клетки и, свързани с белтъците на човешкия главен комплекс за тъканна съвместимост, биват представени на Т клетките, което предизвиква имунен отговор.

Липозомите са, общо взето, биосъвместими и практически нетоксични платформи за доставка на лекарства в организма. Липозомни препарати вече многократно са били успешно използвани in vivo при хора за доставяне на лекарства до специфични цели, главно в клиничната онкология [34, 35]. Трябва, обаче, да се отчита риска, че модификациите (включително конюгирането с PEG) могат да доведат до повишена имуногенност на получения препарат. Описани са анафилактични и други имунни реакции при използването на различни PEG-съдържащи препарати (лаксативи, депо стероиди и др.) [59]. иРНК ваксините, общо взето, притежават отличен профил на безопасност. Честотата на нежеланите събития след ваксинация възлиза едва на 0,2 % [https://www.cdc.gov/mmwr/volumes/70/wr/mm7002e1.htm]. Случаи на анафилактични и анафилактоподобни реакции, обаче, са докладвани както за Comirnaty, така и за Spikevax [4, 8]. Понастоящем се смята, че почти всички случаи на анафилаксия след прилагане на ваксината Pfizer-BioNTech са свързани с наличието на PEG3350 във ваксиналния препарат [18]. Тъй като в справката за безопасност на ваксината на Moderna не се описва дали има или не PEG в техния ваксинален препарат, трудно може да се анализира дали докладваните досега случаи на анафилактични реакции са свързани именно с PEG3350 или с някой друг компонент на препарата. Понастоящем официалната препоръка на FDA е: „Ако сте алергични към PEG, Вие не трябва да получавате иРНК ваксина срещу COVID-19…Ако сте алергични към полисорбати, Вие не трябва да получавате ваксината на J&J/Janssen срещу COVID-19.” https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/vaccines/recommendations/specific-groups/allergies.html

Липозомите и свързаната с тях технология за опаковане на биоактивни вещества са само ранни предшественици на възникналото впоследствие много по-голямо разнообразие от технологии, базирани на липидни наночастици. Потенциалните следващи цели в тази област са: подобряване на специфичността към прицелните клетки, тъкани и органи; прецизен контрол върху освобождаването на лекарството, развитие на тригерирани липозоми (чувствителни към определени стимули, като напр. промени в температурата, pH, свързване на специфичен лиганд и т.н.), както и много други. Използването на нанотехнологиите ще подобри защитата на човечеството срещу бъдещи пандемии на всички нива и би позволило създаване на надеждни, стабилни и лесно достъпни диагностични тестове, лични предпазни средства, лекарства и ваксини.

---

Тест LO 4.1

---

Литература

1. Albaz A., Rafeeq M., Sain Z., Almutairi W., Alamri A., Aloufi A., Almalki W., et al. (2021). Nanotechnology-based approaches in the fight against SARS-CoV-2. AIMS Microbiol, 7(4), 368-398.
2. Aydemir D. and Ulusu N. (2020). Angiotensin-converting enzyme 2 coated nanoparticles containing respiratory masks, chewing gums and nasal filters may be used for protection against COVID-19 infection. Travel Med Infect Dis, 37, 101697.
3. Baden L., El Sahly H., Essink B., Kotloff K., Frey S., Novak R., Diemert D., et al., and Zaks T, for the COVE Study Group. (2021). Efficacy and Safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 Vaccine. N Engl J Med, 384(5), 403-16.
4. Bigini P., Gobbi M., Bonati M., Clavenna A., Zucchetti M., Garattini S. and Pasut G. (2021). The role and impact of polyethylene glycol on anaphylactic reactions to COVID-19 nano-vaccines. Nature Nanotechnol, 16, 1169-1171.
5. Boras B. Jones R., Anson B., Arenson D., Aschenbrenner L., Bakowski M., Beutler N., et al. (2021). Preclinical characterization of an intravenous coronavirus 3CL protease inhibitor for the potential treatment of COVID19. Nature Communications, 12 (1), 6055.
6. Borkow G., Zhou S., Page T. and Gabbay J. (2010). A novel anti-influenza copper oxide containing respiratory face mask. PLoS One, 5(6), e1.
7. Campos E., Pereira A., de Oliveira J., Carvalho L., Guilger-Casagrande M., de Lima R. and Fraceto L. (2020). How Can Nanotechnology Help to Combat COVID-19? Opportunities and Urgent Need. J Nanobiotechnol 18, 1-23.
8. CDC COVID-19 Response Team and Food and Drug Administration. (2021). Allergic Reactions Including Anaphylaxis After Receipt of the First Dose of Moderna COVID-19 Vaccine — United States, December 21, 2020–January 10, 2021. MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 70(4), 125-129.
9. Chua M., Cheng W., Goh S., Kong J., Li B., Lim J., Mao L., et al. (2020). Face Masks in the New COVID-19 Normal, Materials, Testing, and Perspectives. Review Research (Wash DC), 7286735. doi, 10.34133/2020/7286735. eCollection 2020.
10. Dong J., Zost S., Greaney A., Starr T., Dingens A., Chen C., Chen R., et al. (2021). Genetic and structural basis for SARS-CoV-2 variant neutralization by a two-antibody cocktail. Nature Microbiol 6 (10), 1233-1244.
11. Dormont F., Brusini R., Cailleau C., Reynaud R., Peramo A., Gendron A., et al. (2020). Squalene based multidrug nanoparticles for improving mitigation of controlled inflammation in rodents. Sci Adv, 6(23), eaaz5466.
12. Dougan M., Azizad M., Mocherla B., Gottlieb R., Chen P., Hebert C., Perry R., et al. (2021). A randomized, placebo-controlled clinical trial of bamlanivimab and etesevimab together in high-risk ambulatory patients with COVID-19 and validation of the prognostic value of persistently high viral load. Clin Infect Dis, ciab912.
13. Dube T., Ghosh A., Mishra J., Kompella U. and Panda J. (2020). Drugs, Molecular Vaccines, Immune-Modulators, and Nanotherapeutics to Treat and Prevent COVID-19 Associated with SARS-CoV-2, a Deadly Nanovector. Review Adv Ther (Weinh), 2000172.
14. El-Atab N., Qaiser N., Badghaish H., Shaikh S. and Hussain M. (2020). Flexible Nanoporous Template for the Design and Development of Reusable Anti-COVID-19 Hydrophobic Face Masks. ACS Nano, 14(6), 7659-7665.
15. Fan C., Li K. and Ding Y. (2021). ACE2 expression in kidney and testis may cause kidney and testis damage after 2019-nCoV infection.  Front Med (Lausanne), 13, 7:56389.
16. Ferdinands J., Rao, Dixon B., Mitchell P., DeSilva M., Irving S., Lewis N., et al. (2022). Waning 2-Dose and 3-Dose Effectiveness of mRNA Vaccines Against COVID-19-Associated Emergency Department and Urgent Care Encounters and Hospitalizations Among Adults During Periods of Delta and Omicron Variant Predominance – VISION Network, 10 States, August 2021-January 2022. MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 71(7), 255-263.
17. Figgitt D. and McClellan K. (2000). Fluvoxamine. An updated review of its use in the management of adults with anxiety disorders. Drugs, 60 (4), 925-54.
18. Garvey L. and Nasser S. (2021). Anaphylaxis to the first COVID-19 vaccine – is polyethylene glycol (PEG) the culprit? Br J Anaesth, 126(3), e106-e108.
19. Giovannini G., Haick H. and Garoli D. (2021). Detecting COVID-19 from Breath, A Game Changer for a Big Challenge. ACS Sens, 6, 1408-1417.
20. Gong P., He X., Wang K., Tan W., Xie W., Wu P. and Li H. (2008). Combination of Functionalized Nanoparticles and Polymerase Chain Reaction-Based Method for SARS-CoV Gene Detection. J Nanosci Nanotechnol, 8, 293-300.
21. Gordon C., Tchesnokov E., Woolner E., Perry J., Feng J., Porter D. and Götte M. (2020). Remdesivir is a direct-acting antiviral that inhibits RNA-dependent RNA polymerase from severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 with high potency. J Biol Chem, 295(20), 6785-6797.
22. Huang C., Wang Y. and Li X. (2020). Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet (London, England), 395(10223), 497-506.
23. Huang C., Wen T., Shi F., Zeng X. and Jiao Y. (2020). Rapid Detection of IgM Antibodies against the SARS-CoV-2 Virus via Colloidal Gold Nanoparticle-Based Lateral-Flow Assay. ACS Omega, 5, 12550-12556.
24. Harris J. and Chess RB. (2003). Effect of pegylation on pharmaceuticals. Nat Rev Drug Discov, 2(3), 214-221.
25. Imran M., Arora M., Asdaq S., Khan S., Alaqel S., Alshammari M., Alshehri M., et al. (2021). Discovery, Development, and Patent Trends on Molnupiravir, A Prospective Oral Treatment for COVID-19. Review Molecules, 26(19), 5795.
26. Kalil A., Patterson T., Mehta A., Tomashek K., Wolfe C., Ghazaryan V., Marconi V., et al., and ACTT-2 Study Group Members. (2021). Baricitinib plus Remdesivir for Hospitalized Adults with Covid-19. Randomized Controlled Trial N Engl J Med, 384(9), 795-807.
27. Krishnan H., Leema M., Gopika G., Hari Prasad P., Rajan A., Anil A., Dev A. and Pillai Z. (2021). SARS CoV-2, Progression and treatment protocols – An overview. Mater Today Proc, 46, 3144-3147.
28. Kumar R., Lee M., Mickael C., Kassa H., Pasha Q., Tuder R. and Graham B. (2020). Pathophysiology and potential future therapeutic targets using preclinical models of COVID-19. ERJ Open Res, 6(4), 00405-2020.
29. Kumar A., Mancy S., Manjunath K., Kulkarni S. and Jagadeesh R. (2019). Formulation and Evaluation of Fluvoxamine Maleate Loaded Lipid Nanoparticle. Int J Pharm Sci Nanotechnol, 12(4), 4593-4600.
30. Layqah L. and Eissa S. (2019). An Electrochemical Immunosensor for the Corona Virus Associated with the Middle East Respiratory Syndrome Using an Array of Gold Nanoparticle-Modified Carbon Electrodes. Microchimica Acta, 186, 224.
31. Levin E., Lustig Y., Cohen C., Fluss R., Indenbaum V., Amit S., Doolman R., et al. (2021). Waning Immune Humoral Response to BNT162b2 Covid-19 Vaccine over 6 Months. N Engl J Med, 385(24), e84.
32. Li H. and Rothberg L. (2004). Colorimetric Detection of DNA Sequences Based on Electrostatic Interactions with Unmodified Gold Nanoparticles. Proc Natl Acad Sci USA, 101, 14036-14039.
33. Liu S., Wang Z., Xie H., Liu A., Lamb D. and Pang D. (2020). Single-Virus Tracking, From Imaging Methodologies to Virological Applications. Chem Rev, 120, 1936-1979.
34. Liu D., Ju C., Han C., Shi R., Chen X., Duan D., Yan J., et al. (2021). Nanozyme Chemiluminescence Paper Test for Rapid and Sensitive Detection of SARS-CoV-2 Antigen. Biosens Bioelectron, 173, 112817.
35. Lu L., Ding Y., Zhang Y., Rodney J., Ho Y., Zhao Y., Zhang T. and Guo C. (2018). Antibody-modified liposomes for tumor-targeting delivery of timosaponin AIII. Int J Nanomedicine, 13, 1927–1944.
36. Maas M., Kim M., Malkani R., Abbott S. and Zee P. (2021). Obstructive Sleep Apnea and Risk of COVID-19 Infection, Hospitalization and Respiratory Failure. Sleep Breath, 25(2), 1155-1157.
37. Mahase E. (2021). Molnupiravir reduces risk of hospital admission or death by 50% in patients at risk, MSD reports. BMJ, 375, n2422.
38. Malone B., Urakova N., Snijder E. and Campbell E. (2022). Structures and functions of coronavirus replication–transcription complexes and their relevance for SARS-CoV-2 drug design. Nature Rev Mol Cell Biol 23, 21-39.
39. Martínez-Paredes G., González-García M.B. and Costa-García A. (2009). Genosensor for SARS Virus Detection Based on Gold Nanostructured Screen-printed Carbon Electrodes. Electroanal. Int J Devoted Fundam Pract Asp Electroanal, 21, 379-385.
40. McDonald E. and Lee T. (2022). Nirmatrelvir-ritonavir for COVID-19. CMAJ, 194(6), E218.
41. Mohammed S. and Shaaban E. (2019). Efficacious nanomedicine track toward combating COVID-19. Randomized Controlled Trial N Engl J Med, 381(24), 2293-2303.
42. Moitra P., Alafeef M., Dighe K., Frieman M. and Pan D. (2020). Selective Naked-Eye Detection of SARS-CoV-2 Mediated by N Gene Targeted Antisense Oligonucleotide Capped Plasmonic Nanoparticles. ACS Nano, 14, 7617-7627.
43. Mulangu S., Dodd L., Davey R. Jr., Mbaya O., Proschan M., Mukadi D., Manzo M., et al., and PALM Consortium Study Team. (2019). A Randomized, Controlled Trial of Ebola Virus Disease Therapeutics. N Engl J Med, 381, 2293-2303.
44. Nomura T., Nazmul T., Yoshimoto R., Higashiura A., Oda K. and Sakaguchi T. (2021). Ethanol Susceptibility of SARS-CoV-2 and Other Enveloped Viruses. Biocontrol Sci 2021, 26(3), 177-180.
45. Owen D., Allerton C., Anderson A., Aschenbrenner L., Avery M., Berritt S., Boras B., et al. (2021). An oral SARS-CoV-2 M(pro) inhibitor clinical candidate for the treatment of COVID-19. Science 374(6575), 1586-1593.
46. Painter W., Holman W., Bush J., Almazedi F., Malik H., Eraut N., Morin M., et al. (2021). Human Safety, Tolerability, and Pharmacokinetics of Molnupiravir, a Novel Broad-Spectrum Oral Antiviral Agent with Activity Against SARS-CoV-2. Antimicrob Agents Chemother, 65, e02428-20.
47. Park T., Lee S., Lee S., Park J., Yang K., Lee K.-B., Ko S., et al. (2006). Protein Nanopatterns and Biosensors Using Gold Binding Polypeptide as a Fusion Partner.  Anal Chem, 7197–7205.
48. Pham K., Li D., Guo S., Penzak S., and Dong X. (2016). Development and in vivo evaluation of child-friendly lopinavir/ritonavir pediatric granules utilizing novel in situ self-assembly nanoparticles. J Control Release, 226, 88-97.
49. Pini M., Cedillo González E., Neri P., Siligardi C., and Ferrari A. (2017). Assessment of Environmental Performance of TiO2 Nanoparticles Coated Self-Cleaning Float Glass. Coatings, 7, 8.
50. Polack F.P., Thomas S.J., Kitchin N., Absalon J., Gurtman A., Lockhart S., Perez J.L., et al., and C4591001 Clinical Trial Group. (2020). Safety and Efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid–19 Vaccine. N Engl J Med, 383(27), 2603-2615.
51. Rashedi J., Poor B., Asgharzadeh V., Pourostadi M., Kafil H., Vegari A., Tayebi-Khosroshahi H., et al. (2020). Risk Factors for COVID-19. Infez Med, 28(4), 469-474.
52. Rasmi Y., Saloua K., Nemati M., and Choi J. (2021). Recent Progress in Nanotechnology for COVID-19 Prevention, Diagnostics and Treatment. Review Nanomaterials (Basel), 11(7), 1788.
53. RECOVERY Collaborative Group. (2020). Lopinavir-ritonavir in patients admitted to hospital with COVID-19 (RECOVERY), a randomised, controlled, open-label, platform trial. Randomized Controlled Trial Lancet, 396(10259), 1345-1352.
54. Reis G., Dos Santos Moreira-Silva E.A., Silva D.C.M., Thabane L., Milagres A.C., Ferreira T.S., Dos Santos C.V.Q., et al., and TOGETHER investigators. (2022). Effect of early treatment with fluvoxamine on risk of emergency care and hospitalisation among patients with COVID-19, the TOGETHER randomised, platform clinical trial. Lancet Glob Health, 10(1), e42–e51.
55. de M Ribeiro N. and Fonseca B. (2020). The role of pharmaceutical nanotechnology in the time of COVID-19 pandemic Review Future Microbiol, 15, 1571-1582.
56. Roh C. and Jo S. (2011). Quantitative and Sensitive Detection of SARS Coronavirus Nucleocapsid Protein Using Quantum Dots-Conjugated RNA Aptamer on Chip. J Chem Technol Biotechnol, 86, 1475-1479.
57. Shan B., Broza Y., Li W., Wang Y., Wu S., Liu Z., Wang J., et al. (2020). Multiplexed Nanomaterial-Based Sensor Array for Detection of COVID-19 in Exhaled Breath. ACS Nano, 14, 12125-12132.
58. Somvanshi S., Kharat B., Saraf S., Somwanshi S., Shejul S. and Jadhav K. (2020). Multifunctional Nano-Magnetic Particles Assisted Viral RNA-Extraction Protocol for Potential Detection of COVID-19. Mater Res Innov, 25, 169-174.
59. Stone C., Liu Y., Relling M.V., Krantz M., Pratt A., Abreo A., Hemler J. and Phillips E. (2019). Immediate hypersensitivity to polyethylene glycols and polysorbates – more common than we have recognized. J Allergy Clin Immunol Pract, 7(5), 1533‐1540.
60. Patel T., Patel P., Barvaliya M., Saurabh M., Bhalla D. and Khoslae P. (2021). Efficacy and safety of lopinavir-ritonavir in COVID-19. A systematic review of randomized controlled trials. J Infect Public Health, 14(6), 740-748.
61. Thakur V., Ratho R., and Panda J. (2021). Respiratory delivery of favipiravir-tocilizumab combination through mucoadhesive protein-lipidic nanovesicles, prospective therapeutics against COVID-19. Virusdisease, 32(1), 131-136.
62. Tiwaskar M., Dhar R., Talwar D., Ansari A., Lakhe M., Panchal S., Bhagat S., et al. (2022). Real-world Experience with Favipiravir for Treatment of COVID-19 among Indian Healthcare Professionals. J Assoc Physicians India, 69(12), 11-12.
63. Thurston L. and Williams G. (2015). An examination of John Fewster’s role in the discovery of smallpox vaccination.  J Royal Coll Phys Edinburgh, 45, 173-79.
64. Tulbah A. and Lee W-H. (2021). Physicochemical Characteristics and In Vitro Toxicity/Anti-SARS-CoV-2 Activity of Favipiravir Solid Lipid Nanoparticles (SLNs). Pharmaceuticals (Basel), 14(10), 1059.
65. Vaze N., Pyrgiotakis G., McDevitt J., Mena L., Melo A., Bedugnis A., Kobzik L., et al. (2019). Inactivation of Common Hospital Acquired Pathogens on Surfaces and in Air Utilizing Engineered Water Nanostructures (EWNS) Based Nano-Sanitizers. Nanomed. Nanotechnol Biol Med, 18, 234-242.
66. V’kovski P., Kratzel A., Steiner S., Stalder H. and Thiel V. (2021). Coronavirus biology and replication, implications for SARS-CoV-2. Nature Rev Microbiol, 19, 155-170.
67. Wang Q., Zhang Y., Wu L., Niu S., Song C., Zhang Z., Lu G., et al. (2020). Structural and Functional Basis of SARS-CoV-2 Entry by Using Human ACE2. Cell. 181 (4), 894-904.
68. Warren T., Jordan R., Lo M., Ray A., Mackman R., Soloveva V., Siegel D., et al. (2016). Therapeutic efficacy of the small molecule GS-5734 against Ebola virus in rhesus monkeys. Nature, 531(7594), 381-385.
69. Wen W., Chen C., Tang J., Wang C., Zhou M., Cheng Y., Zhou X., et al. (2022). Efficacy and safety of three new oral antiviral treatment (molnupiravir, fluvoxamine and Paxlovid) for COVID-19: a meta-analysis. Ann Med, 54(1), 516-523.
70. Wu F., Zhao S., Yu B., Chen Y-M., Wang W., Song Z-G., Hu Yi., et al. (2020). A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature, volume 579, 265-269.
71. Wu J., Wang H. and Li B. (2020). Structure-aided ACEI-capped remdesivir-loaded novel PLGA nanoparticles, toward a computational simulation design for anti-SARS-CoV-2 therapy. Phys Chem Chem Phys, 22, 28434-28439.
72. Yeh Y-T., Tang Y., Sebastian A., Dasgupta A., Perea-Lopez N., Albert I., Lu H., et al. (2016). Tunable and Label-Free Virus Enrichment for Ultrasensitive Virus Detection Using Carbon Nanotube Arrays. Sci Adv, 2, e1601026.
73. Zarębska-Michaluk D., Jaroszewicz J., Rogalska M., Martonik D., Pabjan P., Berkan-Kawińska A., Bolewska B., et al. (2021). Effectiveness of Tocilizumab with and without Dexamethasone in Patients with Severe COVID-19, A Retrospective Study. J Inflamm Res, 14, 3359-3366.
74. Zhang H., Kang Z., Gong H., Xu D., Wang J., Li Z., Cui X., et al. (2020). Digestive system is a potential route of COVID-19, an analysis of single-cell coexpression pattern of key proteins in viral entry process. Gut, 69, 1010-1018.
75. Zhong H., Zhu Z., Lin J., Cheung C.F., Lu V.L., Yan F., Chan C.Y., et al. (2020). Reusable and Recyclable Graphene Masks with Outstanding Superhydrophobic and Photothermal Performances. ACS Nano, 14(5), 6213-6221.
76. Zhou Y., Liao X., Song X., He M., Xiao F., Jin X., Xie X., et al. (2021). Severe Adaptive Immune Suppression May Be Why Patients With Severe COVID-19 Cannot Be Discharged From the ICU Even After Negative Viral Test. Front Immunol, 12, 755579.

Резюме

Новото поколение наносистеми за транспорт и доставка на лекарства осигурява ефективна доставка на лекарства и ваксини до техните прицелни тъкани и органи със значително по-нисък риск от възникване на нежелани ефекти в сравнение с конвенционалните терапии. Този тип лекарствени препарати дават също така и възможност за модулиране на имунните реакции на организма към чужди и собствени антигени и за разработване на високочувствителни технологии за образна диагностика с цел ранно откриване на болести при човека. COVID-19 се оказа сериозно предизвикателство както за изследователската дейност, така и за клиничната медицина. медицината, така и за науката. Арсеналът за борба с тази „модерна” пандемия включва биосензори, диагностични устройства, антивирусни лекарства и ваксини, основани на нанотехнологични разработки – както предходно съществуващи, така и разработени специално за целта. Масовото разпространение и поразяващата мощ на SARS-CoV-2 създаде необходимост от тясна колаборация между секторите, занимаващи се с научноизследователска и развойна дейност. Това доведе до създаване на нови ефективни начини за предотвратяване и лечение на усложненията на COVID-19. Тези нови подходи по всяка вероятност ще продължат да се развиват и след потушаването на настоящата пандемична ситуация, за да бъдат прилагани и при други заболявания при човека.

Ключови думи/фрази: COVID-19, антивирусни средства, моноклонални антитела, ваксини, нанотехнологии

1. SARS-CoV-2 и COVID-19 – преглед на произхода на една „модерна” пандемия и ефектът й върху начина на мислене в областта на научните изследвания и в клиничната медицина

Счита се, че инфекцията със SARS-CoV-2 при човека е възникнала като зооноза през седмиците и месеците, предшествали първия документиран случай (който беше докладван в началото на декември 2019 г.) [69]. На 31. декември 2019 г. Световната здравна организация (СЗО) беше сезирана за бързо нарастващ брой случаи на атипична пневмония с неустановен причинител в град Ухан, Китай. На 7. януари 2020 г. причинителят беше идентифициран от местните здравни власти като неизвестен до този момент член на семейството на бета-коронавирусите. В края на януари 2020 г. генералният директор на СЗО д-р Тедрос Аданом Гебрейесус обяви, че новата епидемия от коронавирус е извънредна ситуация за общественото здраве от международно значение [https://www.who.int/news/item/30-01-2020-statement-on-the-second-meeting-of-the-international-health-regulations-(2005)-emergency-committee-regarding-the-outbreak-of-novel-coronavirus-(2019-ncov)]. Заслужава си да се отбележи, че по времето на това изявление броят на случаите общо беше около 100 и смъртни случаи сред инфектираните все още не бяха регистрирани, но вирусът беше успял да се разпространи в още около 20 страни освен Китай. Незабавно започнаха изследвания с цел разработване на методи за превенция на инфекцията и етиологично лечение. За тази цел се наложи да се обединят усилията на изследователи, клиницисти, биотехнологични и фармацевтични компании, като първите резултати под формата на изпитания на лекарства и ваксини се появиха още в следващите няколко месеца.

COVID-19 беше при възникването си (и все още е) предизвикателство както за изследователската дейност, така и за клиничната медицина. Неговата поява ни напомни отново за това, че еволюцията е процес, протичащ в реално време, както и ни представи за пореден път спектъра на разнообразие от еволюционни механизми и причинно-следствената връзка между промените, настъпващи на нано- и микрониво, и величината на ефектите от това върху макросвета. Тази „модерна” пандемия създаде необходимост от тясна колаборация между секторите, занимаващи се с научно-изследователска и развойна дейност с цел създадаване на нови, по-ефикасни начини за предотвратяване и лечение на заболяванията при човека. Показателен пример за тази колаборация е разработването на векторни и иРНК ваксини против инфекция със SARS-CoV-2. До края на 2019 г. одобрена за употреба при хора беше всичко на всичко една векторна ваксина (rVSV-ZEBOV или Ervebo на Merck, срещу инфекция с вируса Ебола). Въпреки че първите клинични изпитания на иРНК ваксина срещу бяс започнаха още през 2013 г., към момента на появата на SARS-CoV-2 нямаше одобрена нито една такава. Първата иРНК ваксина срещу SARS-CoV-2 (Comirnaty на Pfizer BioNTech) беше одобрена за спешна употреба на 11.12.2020 г., т.е. малко по-малко от година след началото на пандемията. Това наистина много бързо развитие в областта на ваксинопрофилактиката беше изтълкувано от широката публика като нередно или недостатъчно проверено и с това беше свързана голяма част от протестите срещу ваксинирането. Действително, за неспециалистите в областта вероятно е трудно да се оцени, че в областта на ваксинопрофилактиката на инфекциозните заболявания има много натрупани предходни данни – както по принцип, така и в областта на заболяванията, предизвикани от бета-коронавируси. Поради голямото количество предходно съществуваща информация, процесът на разработка на нови ваксини или адаптиране на налични ваксини може да бъде наистина много бърз и това не се отразява на тяхната ефикасност или безопасност на използване. Същото важи и за разработването на безопасни и ефективни лекарства срещу COVID-19. Използваните в момента антивирусни средства, за които има доказана значителна ефикасност в лечението на пациенти с COVID-19 (ремдесивир, фавипиравир и други) в по-голямата си част са лекарства, които преди това са претърпели дълги изпитания за използването им при лечението на други вирусни заболявания. Така че съвременните терапии на COVID-19 лечения не се основават на принципно нов механизъм на действие и може да се счита за експериментално доказано, че имат достатъчно добър профил на безопасност. Новостта в тези „нови“ ваксини се основава на използваните в тях нови подходи за въздействие на ваксинналния препарат върху прицелните молекули – нуклеинови киселини или белтъци.

2. Базови презумпции при развитието на платформи за насочен транспорт и доставка на лекарства, основани на нанотехнологии

По-голямата част от лекарствата навлизат в живите клетки чрез лиганд-рецепторно взаимодействие. Утвърдените консервативни терапии, най-общо казано, се основават на обогатяване на жизнената среда на прицелните клетки с лекарство, което да увеличи шанса за свързването му с мишената му на действие (напр. клетъчен рецептор). Рецептори от един и същи тип може да се експресират върху повече от един тип клетки и едно и също лекарство – лиганд може да се свърже с повече от един вид рецептор. Поради това, възможно е едно лекарство да въздейства върху повече от една прицелна тъкан, което води до плейотропни ефекти. Те могат да бъдат както положителни (благоприятно повлияване на повече от едно ниво), така и отрицателни (повишен риск от неблагоприятни ефекти, свързани с ефектите на лекарството върху тъкани и органи, различни от прицелните). Плейотропните ефекти са особено изразени при цитостатиците и лекарствата, използвани в психиатрията.

Безопасността и ефикасността на лекарствата (а също така и на ваксините) не зависят единствено от активната съставка на лекарството, но и от биологично неактивния компонент, отговорен за транспорта, доставката и освобождаването на лекарството – т.нар. вехикулум. Ролята на вехикулума се състои основно в регулация на взаимодействието на лекарството и прицелната тъкан.
Съгласно дефиницията, предоставена от Центровете за контрол и превенция на заболяванията (Centers for Disease Control and Prevention, CDC) в Атланта, САЩ, нанотехнологиите представляват: „…манипулиране на материята на близко до атомното ниво с цел производство на нови структури, материали и устройства… като се използват материали с най-голямо лонгитудинално измерение 1 – 100 нанометра… при който размер материалите започват да проявяват уникални свойства, които засягат [технитe] физически , химическr и биологични свойства.” https://www.cdc.gov/niosh/topics/nanotech/default.html#:~:text=Nanotechnology%20is%20the%20manipulation%20of,new%20structures%2C%20materials%20and%20devices.&text=Nanotechnology%20refers%20to%20engineered%20structures,between%201%20and%20100%20nanometers.

Наноматериалите се отличават със значително съотношение повърхност-обем, което значително повишава тяхната разтворимост във водна или липидна фаза (в зависимост от локацията на прицелните молекули и желания ефект) и е основа на тяхното използване за модулиране на разпределението на биоактивни вещества в различни прицелни клетки и тъкани. Размерът на частиците им е сравним с размера на биологичните макромолекули. Новото поколение нано-вехикулуми за фармацевтични продукти за хуманна употреба осигурява ефективна доставка на активното вещество до целта със значително по-нисък риск от неблагоприятни ефекти. Нанотехнологиите предоставят нови начини за преодоляване на природните бариери за навлизане на ксенобиотици, което води до подобряване на проникването на лекарствата в иначе трудно достъпни прицелни места (напр. кръвно-мозъчната бариера). Те могат да се използват за модулиране на имунните реакции към чуждите и собствените антигени и като инструмент за подпомагане на развитието на високочувствителни технологии за образна диагностика за ранно откриване на заболявания при човека. Разработени са и много други приложения на нанотехнологиите за целите на съвременната изследователска дейност. По-важните от тях са представени на на фиг. 1.

Фиг. 1. Някои от приложенията на нанотехнологиите в съвременната изследователска и развойна дейност.

Размерите на повечето вируси попада в диапазона между 20 и 250 нанометра. Това означава, че нанотехнологиите притежават много добър потенциал за използване с цел създаване на антивирусни средства.

SARS-CoV-2 притежава много висок инфекциозен потенциал (сравним с този на грипния вирус и вируса, причиняващ морбили). Лабораторните изследвания (включително молекулярно-биологични), рентеновата диагностика и компютърната томография се използват рутинно за диагностика на инфекция със SARS-CoV-2 и в клиничната диагностика на COVID-19. Находките от ренгенографското изследване и от компютърна томография, които се считат за „типични“ за COVID-19 (дифузни промени тип „матово стъкло”), обаче, се появят със значително изоставане след началото на първите симптоми и може да персистират дълго време след настъпването на подобрение в клиничния статус. Освен това провеждането им е свързано със значителна доза облъчване. Поради това, те трудно биха могли да се използват за рутинен скрининг и за диагностика на ранни етапи на заболяването. Първият лабораторен тест, разработен за целите на скрининга за COVID-19 беше основан на полимеразна верижна реакция със синтез на първа верига чрез обратна транскрипция (reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR). Това е донякъде парадоксално, тъй като този метод на изследване има много висока чувствителност, но има сравнително дълго технологично време, включващо подготовка на пробите, анализ и интерпретация на крайния резултати. Изпълнението му изисква специализирана апаратура и обучен персонал. Това го прави сравнително скъп и времеотнемащ диагностичен метод, т.е. неподходящ за рутинен скрининг. Впоследствие в практиката бяха въведени и т.нар. „бързи тестове”, каквито обикновено са рутинните скринингови тестове за инфекциозни причинители.

PCR-базираните тестове за откриване на болести при човека и животните са по дефиниция базирани на нанотехнологии (въпреки че принципът им на работа датира от 90-те години на ХХ век). Антигенните тестове за SARS-CoV-2 (които са друг пример за аналитични средства, базирани на нанотехнологии) бяха разработени по-късно с цел да се намали технологичното време за диагностика, да се намали сложността на изпълнение и да се направи лесно достъпна за пациентите и техните близки. Тези „бързи“ тестове, обаче, като допълнение към общите ограничения, свързани с нивото на инвазивност, имат и допълнителни проблеми, свързани с голямата вариация от марка до марка в чувствителността и специфичността на теста. Серологичните тестове (откриващи наличие на антитела – IgG, IgM в серум и понякога IgA в други биологични течности) могат да дадат информация за в момента протичащи и предходно случили се инфекции със SARS-CoV-2, но са по-малко приложими за пресимптоматично откриване на инфекции. Това е свързано с техния принцип на действие – тъй като развитието на имунен отговор изисква време, серологичните тестове трябва да се извършват със значително забавяне след самия акт на инфектиране и, нерядко, след началото на симптомите. Тъй като ваксините също пораждат антителен отговор, серологичните тестове често са ненадеждни при предходно ваксинирани симптоматични пациенти.

Биосензорите (друг тип устройства, базирани на нанотехнологии) бяха разработени за целите на диагностиката на инфекции със SARS-CoV-2 на сравнително ранен етап (първите статии, посветени на тази тема бяха публикувани през м. юни 2020 г.) [76]. Понастоящем, биосензори се използват в диагностиката на инфекции със SARS-CoV-2, но са все още предимно за изследователска употреба поради високата им цена.

Вирусната частица на SARS-CoV-2 е с размер около 100 nm, което е в средата на диапазона, характерен за вирусите, причиняващи инфекции при човека, както и в рамките на нанодиапазона. Потенциалът за приложение на лечения, базирани на нанотехнологии беше подложен на сериозно проучване от самото начало на пандемията. До настоящия момент са разработени и пилотно изпитани редица нанотехнологични подходи за целите на превенцията на инфекцията, диагностиката и лечението на COVID-19.

Вече съществуват няколко базирани на нанотехнологии устройства за детекция на SARS-CoV-2 с висока чувствителност и специфичност. Понастоящем те не заместват напълно, а по-скоро допълват рутинно използваните подходи за детекция, базирани на RT-PCR и антигенни тестове. Наскоро беше представен нов биосензор на базата на златни наночастици за откриване на SARS-CoV-2 в издишван въздух [75, 78, 27]. Ефективността на екстракцията на нуклеинови киселини за целите на детекцията на SARS-CoV-2 значително се подобрява с използване на магнитни наночастици [81, 97]. Нанокристалите с полупроводникови свойства (т.нар. квантови точки) бяха успешно използвани за изготвяне на биосензор за детекция на нуклеокапсидния антиген на SARS-CoV [70]. Подобни устройства бяха изготвени и за за откриване на SARS-CoV-2 [40 ]. Порази бързото развитие в областта, може да се очаква, че базираните на наноматериали устройства за детекция, лекарства и ваксини в близко бъдеще ще съставляват основната на управлението на пандемията [65, 50].

3. Наносистеми за доставка на антивирусни лекарства

3.1. Наноформулации за транспорт и доставка на лекарства – типове и потенциалните им приложения при лечение на вирусни инфекции

По дефиниция, нанофармацевтикът (наричан понякога и нанолекарство) представлява лекарство с размер на частиците в нанодиапазона. Наночастиците в този лекарствен продукт могат да имат различна форма и химичен състав. Тази част на нанофармацевтика, която отговаря за съхранението, транспорта и освобождаването на активната съставка се нарича нановехикулум (или наноносител). Активната съставка в състава на нанофармацевтика може да бъде разтворена, опакована, капсулирана, адсорбирана, конюгирана или свързана посредством химически връзки с частиците на нановехикулума.
Нановехикулумите могат да бъдат най-разнообразни. Схематично представяне на разработените досега основни видове нановехикулуми е показано на фиг. 2.

Фиг.2. Видове нановехикулуми

Най-често срещаните видове нановехикулуми са описани накратко по-долу. Повече внимание е отделено на липозомите, тъй като те бяха първите нановехикулуми, използвани за насочена доставка на лекарства и в момента са най-често използваният тип.

3.1.1. Наноформулации, основани на използване на липиди

От гледна точка на биобезопасността, липидите са най-подходящи за изработване на нановехикулуми. Те са като цяло биоразградими, биосъвместими, нетоксични и притежават много ниска имуногенност. Технологията им за производство е сравнително лесна и имат ниска себестойност [61]. В липидните наноформулации липидите се използват заедно с други вещества – повърхностноактивни вещества, разтворители, и др. Най-често използваните наноформулации на липидна основа включват липозоми, твърди липидни наночастици (ТЛЧ, solid lipid nanoparticles, SLN), наноемулсии и наносуспензии.

Липозоми

Липозомите са затворени мехурчета (везикули), съставени от две фази – водна и липидна. Водната фаза обикновено е във вътрешността на мехурчетата (сърцевина) и е изцяло обкръжена от един или повече липидни бислоя, съставен от естествени или синтетични фосфолипиди, подредени подобно на липидите в клетъчната мембрана. Липозомите, в зависимост от предназначението си и от технологията на получаване, могат да са еднослойни или многослойни (моно-, олиго- и мултиламеларни). Диаметърът на везикулата може да варира в относително широки граници – между 10 и 1000 nm.

Първото поколение (конвенционални) липозоми, разработени за целите на клиничната медицина, съдържаше хидрофилна биоактивна съставка във водната сърцевина на липозомите. Липозомите от по-късно поколение могат да съдържат в сърцевината си и липофилни съединения и могат да имат допълнителни модификации, предназначени да се увеличи времето на циркулация in vivo на липозомата и да се осигури насочено и контролирано по време навременно доставяне на лекарствения агент [37]. Схематично, различните типове липозоми са представени на фиг. 3.

Фиг. 3. Представяне на различните видове липозомни системи за доставка на лекарства.

Липозомите се получават от лесно достъпни и евтини изходни материали – най-често воден разтвор на фосфолипиди, който се подлага на обработка чрез различни методи: ултразвук (соникация), дехидратация-рехидратация, обратнофазово изпаряване, повтарящи се цикли на замразяване-размразяване, екструзия и др. [31]. Желаният размер и ламеларността на липозомите обикновено се постига чрез екструзия, като се използват филтри с пори с определен размер. Ефективността на улавяне на активни съставки може много да се различава при липозоми, получени чрез различни технологии. Точното насочване на терапевтичните липозоми към желаното място на доставка на лекарството най-често се постига чрез добавяне на лиганди към повърхността на везикулата [37].

Въпреки многото си предимства като нановехикулуми, липозомите имат и своите недостатъци. Сред тях са тяхната сравнително ниска стабилност, налагаща използване на специални модификации за повишаване на циркулационното време in vivo и техният относително нисък капацитет на поемане на лекарства. Производството на липозомите трудна се стандартизира и трудно се адаптира до големи промишлени обеми. Също така, независимо, че липидите рядко предизвикват имунологично-обусловени реакции, някои добавки в наноформулациите имат вътрешно присъщ риск да предизвикат имунни реакции (напр. PEG3350) [11].

Към настоящия момент в клиничната медицина се използван няколко липозомни препарата – за насочено доставяне на цитотоксични агенти, за вътреочно приложение, като адювантно пост-ирадиационно лечение с препарати на Т4 ендонуклеаза V при пациенти с екстремна чувствителност към ултравиолетова светлина, и други [95, 13, 49].

Липозоми, конюгирани с полиетиленгликол (PEG) понастоящем се използват във ваксините Comirnaty (Pfizer BioNTech) и Spikevax (Moderna).

Твърди липидни наночастици (ТЛЧ)

Твърдите липидни частици съдържат липиден матрикс, който при стайна температура (или при желаната температура) е в твърдо агрегатно състояние (триглицериди, стероиди, мастни киселини, восъци и др.). За разлика от липозомите, производството на ТЛЧ може да бъде лесно адаптирано до промишлени мащаби. Твърди липидни частици досега са били употребявани като вехикулуми за различни антивирусни лекарства (ритонавир, маравирок, дарунавир, ефавиренц, зидовудин, лопинавир, долутегравир и други – за подробности виж по-долу).

Следващото поколение ТЛЧ са т.нар. наноструктурирани липидни носители (nano-structured lipid carriers, NSLC). Там липидите са в течно агрегатно състояние, което придават повишена стабилност на структурата и по-добър контрол над освобождаването на лекарството.

Наноемулсии

Наноемулсиите са глобуларни еднофазни системи, състоящи се от емулгирани масла, вода и повърхностноактивни вещества. Те могат да поемат и транспортират сравнително голямо количество лекарство и се характеризират с висока хидрофилност и висока бионаличност на освободеното лекарство. До скоро наноемулсиите се използваха предимно и изключително за разработване на иновативни формулации на някои анти-HIV препарати, напр. протеазни инхибитори (саквинавир, индинавир) [90].

Самоемулгиращите се системи за доставяне на лекарства (self-emulsifying drug delivery systems, SNEDDS) представляват друг вид еднофазни системи, съдържащи липиди, вода и повърхностноактивни вещества. Те се използват като вехикулуми на липофилни лекарства, каквото е, например, анти-HIV лекарството невирапин (виж по-долу) [Selvam and Kulkarni, 2014].
Към днешна дата са разработени и наноемулсия [68] и суспензия от твърди липидни наночастици [87], съдържащи антивирусното лекарство фавипиравир, с цел насоченото му доставяне до белодробния епител при пациенти с COVID-19. Получените до момента резултати от in vitro проучвания са обнадеждаващи.

3.1.2. Наноформулации, основани на използване на полимери

За изготвяне на полимерни наноформулации могат да се използват най-различни естествени и синтетични полимери. Често използвани хидрофилни полимери са, например, желатин, албумин, алгинова киселина, декстран, хитозан, агароза и други. От липофилните полимери, използвани за изготвяне на наноформулации, могат бъдат споменати полимерите на млечната киселина (polylactic acid, PLA), кополимери на млечната и гликоловата киселина (polylactide-co-glycolic acid, PLGA), полистирен, поликапролактон (polycaprolactone, PECL), полиметакрилат (polymethacrylate, PMMA) и други. Към полимерния скелет могат да бъдат добавени повърхностни модификации с цел подобряване на фармакокинетиката и намаляване на потенциалната имуногенност. Други специални модификации се използват, за да се осигури тригерирано (предизвикано от конкретен стимул) освобождаване на лекарството – например в отговор на промени в киселинността на средата, температурата и други стимули. За целите на онкологията бяха разработени специални полимери, инхибиращи P-gp и други белтъци, свързани с множествената лекарствена резистентност (multidrug resistance, MDR).

Използваните до момента полимерни наноформулации включват полимерни мицели, полимерни твърди наночастици, нанокапсули и наносфери.

Полимерни мицели

Полимерните мицели са наноструктури, изготвени от амфифилни кополимери, като всяка структура (унимер) се състои от хидрофобна и хидрофилна субединица. Унимерите се свързват и образуват структури с хидрофобна сърцевина ​​и хидрофилна обвивка – т.нар. мицели. В хидрофобната сърцевина могат да бъдат поети и транспортирани лекарства с лоша водоразтворимост, а хидрофилната обвивка е отговорна за транспортирането и насоченото освобождаване на лекарството. Като липофилни полимери на сърцевината могат да се използват полиестери, поликапролактон, полиаминокиселини и др. Основният компонент на хидрофилната обвивка е полиетиленгликолът, върху която могат да се въведат различни модификации в зависимост от желания ефект – напр. добавяне на остатъци от сиалова киселина. Сиализация на външната хидрофилна обвивка на наномицели беше използвана в едно проучване, в което се изследваха възможностите за предотвратяване на инфекция с грипния вирус. По-точно, сиализираните наномицели бяха предназначени за свързване на хемаглутинина на грипния вирус, за да се предотврати навлизането на вируса в клетката [1]. Засега това и подобните му проучвания са на ниво изследователска дейност.

Полимерни наночастици

Полимерните наночастици могат да бъдат произведени от различни естествени или синтетични полимери. Типични представители са т. нар. нанокапсули, които подобно на мицелите улавят и задържат лекарството в сърцевината си. Възможен е и друг вариант – лекарството се адсорбира върху повърхността или е вградено в матрицата на наночастицата. Тогава структурата се нарича наносфера. Полимерни наночастици са използвани за разработване на иновативни формулации на рутинно използвани анти-HIV лекарства – напр. ефавиренц, лопинавир, ритонавир и други.

Полимерни лекарствени конюгати

Полимерните лекарствени конюгати съдържат полимер и ковалентно свързано с него лекарство. Лекарството обикновено е с малка молекула, но може да бъде и по-голяма молекула, напр. белтък. Повечето приложения на полимерни лекарствени конюгати в момента са в клиничната онкология (даунорубицин, доксорубицин, метотрексат, мелфалан и др.) и офталмологията (даунорубицин) [62, 20]. Полимерни конюгати се прилагат и в антивирусната терапия. Например, конюгираните с ПЕГ (ПЕГилирани) интерферони бяха доста време единственото високоефективно лечение за HCV [17]. Конюгатите на зидовудина имат по-дълъг плазмен полуживот от конвенционалния препарат [38]. През 2018 г. Andersen et al. използваха кополимер на N-(2-хидроксипропил)метакриламид и албумин за подобряване на доставката на комбинация от анти-HIV лекарства до първични човешки Т клетки. Резултатите от това проучване бяха много обещаващи, и в момента този и подобните му кополимери се изследват активно с цел насочена доставка на други лекарства.

Нанокапсули

Както описаните по-горе структури, нанокапсулата също се състои от сърцевина ​​(съдържаща лекарството) и обвивка. Нанокапсулите, обаче, могат да бъдат заредени със значително по-големи количества лекарство, отколкото липозомите, което може да се насочва към желаната тъкан и да се освобождава контролирано. За целите на анти-HIV терапията са проектирани нанокапсули с полиизо-бутилцианоакрилатна сърцевина, съдържащи зидовудин и обвивка от полиетиленимин.

Наносфери

Наносферите са сферични структури, в които лекарството не е затворено в сърцевината, а се намира в обвивката или е диспергирано в липидния матрикс. Наносферите имат по-малък размер от нанокапсулите, съответно съдържат по-малко количество от лекарството и могат да бъдат бързо елиминирани от циркулацията. Разработени са формулации за локално приложение на ацикловир в наносфери от хитозан за лечение на инфекции, причинени от вируса на херпес симплекс.

Липид-полимерни хибридни наноформулации

Нерядко, при лечението на вирусни инфекция едно лекарство не е достатъчно и се налага да се приложи комбинирана терапия. От друга страна, рискът пациентът да не взима предписаните му лекарства нараства, когато му се налага да приема повече от два препарата. Това налага повече от едно лекарство (често с различни физикохимични свойства) да бъдат доставени в една и съща лекарствена форма. Едновременна доставка на повече от едно лекарство може да се постигне с помощта на липидно-полимерни хибридни наночастици. Разработени са няколко различни типа хибридни липид-полимерни системи – наночастици с полимерна сърцевина и липидна обвивка, наночастици с обвивка от липиди и полимер и куха сърцевина, полимерни наночастици с двуслойно покритие от липиди, наночастици с полимерна клетка и др. Най-общо казано, хибридните липидно-полимерни наноформулации се състоят от полимерна сърцевина, обградена от един или повече външни слоеве, изградени от липиди или от липид и друг полимер. Наночастиците с полимерна клетка са малко по-различни, тъй като те включват и липозоми, чиято повърхност е модифицирана чрез кръстосано свързване с полимери. Липид-полимерните хибридни наноформулации се характеризират с много висок капацитет за поемане на лекарства.

Биомиметичните липид-полимерни хибридни наноформулации са вариант на липид-полимерните. При тях повърхността на наночастиците е модифицирана така, че да наподобява белтъци от клетъчната повърхност. В тази категория се включват вирусоподобните частици (virus-like particles (VLP) и вирозомите виж по-долу).

Тригерираните (стимул-асоциирани) липид-полимерни хибридни наночастици са способни да освобождават капсулираното лекарство в отговор на различни стимули като промени в рН на средата, температура, магнитно поле и пр., като по този начин лекарството се доставя на желаното място и в желаното време. През 2012 г. бяха докладвани резултати от използване на естер на стеариновата киселина с метилцелулоза като термочувствителен вехикулум за бавно интравагинално освобождаване на антиретровирусното лекарство тенофовир [38]. По подобна технология по-късно беше разработен хибриден термочувствителен хидрогел за едновременно доставяне на теафлавин (хидрофилен антиоксидант) и нифевирок (хидрофобен антивирусен агент) за интравагинално приложение като пре-експозиционна профилактика на ХИВ. Термочувствителните хидрогелове се проучват и във връзка с потенциала им за интраназално доставяне на антивирусни лекарства.

Наночастиците могат да имат различни размери (в нанодиапазона) и различна форма. Съществуват един специфичен тип липид-полимерни хибридни наноформулации, при които се използва експериментално установеният факт, че формата на частица с наноразмери може да има значително влияние върху междуклетъчните взаимодействия и, съответно, върху биоразпределението на лекарството, с което е натоварена [8]. Например, установено е, че натоварените с цитостатици наночастици с форма, различна от сферичната осигуряват по-висока терапевтична ефикасност в сравнение със сферичните частици [74]. Това налага изследване на различни варианти, за да се подобрят фармакокинетичните свойства на конкретното лекарство.

3.1.3. Дендримери

Дендримерите са синтетични, силно разклонени триизмерни наноструктури с диаметър 2–10 nm. Те се състоят от сърцевина, вътрешна обвивка и външна обвивка, която може да носи върху себе си различни модификации [83]. Дендримерите се синтезират чрез последователно добавяне на субединици към инициираща молекула. Схема на един относително просто изграден полиетилениминов дендример е представена на фиг. 4.

Външната обвивка на дендримера може да бъде ковалентно модифицирана (напр. естерифицирана, гликозилирана и т.н.) или конюгирана с протеини, пептиди и т.н. Дендримерите имат дълго време на циркулация in vivo, добра стабилност, водоразтворимост и поради функционалните групи на повърхността си могат да взаимодействат със специфични прицелни молекули. В сърцевината на дендримера могат да се поместят различни субстанции.
Към момента основната изследователска и развойна дейност се извършва с дендримери, направени от полиамидоамини, полипропиленимин и поли-L-лизин. Дендримери с добавена странична тиолова група, използвани като топикално средство, осигуряват удължено освобождаване на ацикловир за защита срещу първично заразяване със вируса на Herpes simplex или срещу ерупция на характерния обрив при индивиди, които са носители на вируса [83]. Полианионни карбосиланови дендримери бяха използвани като вехикулум в топикално средство за локална защита срещу проникване на вирусите на HIV. Оказа се, че самият полимер притежава свойството да инхибира интернализацията на HIV-1 в епителните клетки и навлизането му в мононуклеарните клетки на периферната кръв [83].

Фиг. 4. Дендример от полиетиленимин

3.1.4. Въглеродни наноформулации

Въглерод-базираните наноформулации включват въглеродни нанотръбички, наночастици от графенов оксид и фулерени.

Графен

Графенът е алотропна форма на въглерода, в която атомите са подредени така, че да образуват двумерна структура от правилно подредени, свързани помежду си клетки – т.нар. листове. Материалите на основа графен, предназначени за изследователски или клинични цели, често биват модифицирани чрез прибавяне на различни функционални групи с цел за подобряване на биосъвместимостта и намаляване на потенциалната токсичност. Функционалните групи формират места за прикрепване на различни биологични молекули. Графен-базираните наноструктури могат да поемат както хидрофилни, така и липофилни лекарства.

Въглеродни нанотръбички (carbon nanotubes, CNT)
Въглеродните нанотръбички са кухи цилиндрични наноструктури със стени, направени от един или повече графенови листа. Отворите на цилиндъра могат да бъдат „запушени“ с друга структура (напр. фулерен) откъм единия или откъм двата края. Въглеродните нанотръбички имат отличен потенциал за поемане на лекарства и контролираното им освобождаване. Засега, обаче, техните приложения в медицината са ограничени поради високата им липофилност и доказаната им белодробна токсичност. Разработват се по-нови, подобрени видове въглеродни нанотръбички с по-ниска токсичност и по-висока биоразградимост.

Фулерени

Фулерените са тримерни въглеродни структури, образуващи кухи клетки с размери в нанодиапазона. Установено е, че някои фулерени инхибират репликацията на HIV, HCV и грипния вирус чрез пространствено пречене, а също така инхибират и експресията на вирусни белтъци.

3.1.5. Неорганични наноформулации

Квантови точки (Quantum dots, QT)
Квантовите точки са нанокристали с полупроводникови свойства. Те се състоят от неорганична сърцевина, отговорна за електропроводимостта ​​(силиций, кадмиев селенид, кадмиев сулфид, индиев арсенид и др.), хидрофилна обвивка и различни лиганди. Квантовите точки намират своите приложения за медицински цели предимно в образната диагностика, тъй като могат да абсорбират и излъчват светлина при предварително зададени дължини на вълната. Като лекарствени вехикулуми, модифицираните квантови точки имат потенциал за приложение при лечението на HIV [42].

Метали и наночастици от метални оксиди

Някои метали и метални оксиди имат вътрешно присъща микробицидна и антивирусна активност. Такива са сребърните, златните, медните, титановите, цериевите оксиди и др. Към тях могат да бъдат конюгирани различни биологично активни субстанции. Повърхността на металните наночастици може да бъде функционализирана чрез ковалентно свързане с различни функционални групи с цел подобряване на междумолекулните взаимодействия, бионаличността на лекарството и освобождаването му. Напмример, малки интерфериращи РНК са били конюгирани със златни наночастици и получената наноформулация е показала висока активност за инхибиране на репликацията на вируса на денга, както на и освобождаването на новосглобени вирусни частици. Установено е, че сребърните наночастици инхибират хемаглутинацията и индуцираната от H1N1-грипен вирус апоптоза в клетъчни култури. Сребърни наночастици, конюгирани с танинова киселина подтискат инфекцията с HSV-2 както in vitro, така и in vivo [43]. В миши модели на вагинални инфекции с HSV-2 използването на наночастици от цинков оксид показва обещаващи резултати по отношение на потискането на вирусната активност.

Използването на неорганични наночастици е до голяма степен ограничено поради опасения за токсичност [43]. Разработват се по-нови формулации с по-ниска токсичност, но клиничните изпитания при хора все още са силно ограничени.

3.1.6. Нанотехнологии, базирани на използване на нуклеинови киселини

Аптамери

Аптамерите са къси фрагменти от нуклеинови киселини (олигонуклеотиди) или от белтъчни последователности (пептиди), които могат специфично да се свързват с други нуклеинови киселини и белтъци [34]. Х-аптамерите са специфична отделна категория. Те представляват комбинация от естествени и изкуствено създадени или химически модифицирани ДНК или РНК олигонуклеотиди. Вместо характерния за естествените нуклеинови киселини пентозофосфатен скелет, аптамерите могат да имат тиофосфатен скелет, който се отличава с повишена резистентност към нуклеазни активности и по-висок афинитет на свързване [45].

Терапевтичният потенциал на аптамерите е известен от над 20 години. Препарат от ПЕГилирани аптамери се използва и в момента за насочено подтискане на пролиферацията на съдовия ендотел в окото. Полученият препарат (пегаптаниб, Macugen на Bausch & Lomb) е одобрен за употреба като интравитреална инжекция при дегенерация на макулата [85]. Аптамери, насочени към ключови молекули от коагулационната каскада като напр. Фактор IXa, тромбин и фактор на фон Вилебранд в момента се изпитват за приложение като потенциални антикоагуланти при разстройства на кръвосъсирването [57].

Онкологията е благодатна област за разработване на аптамери с терапевтично приложение. Аптамери, насочени срещу нуклеолин, простатно-специфичен мембранен антиген (prostate-specific membrane antigen, PSMA), карциноембрионален антиген (carcinoembryonic antigen, CEA), муцин 1 (MUC1), ErbB-2 (молекулярен таргет на моноклоналното тяло trastuzumab (Herceptin), използвано при лечение на карцином на млечната жлеза) и други белтъци, играещи роля в хода на карциногенезата са били последователно обект на изпитване като антиракови средства [72, 43, 22, 86]. Към момента все още няма одобрено онкологично лекарство, базирана на аптамери.

Установено е, че аптамерите инхибират различни етапи на HIV инфекцията чрез свързване с обратната транскриптаза и интегразата на вируса [19, 71]. Разработени са аптамери срещу хемаглутинина на грипния вирус [53]. Базирани на аптамери биосензори бяха създадени за целите на детекция на SARS-CoV и, впоследствие, на SARS-CoV-2 [16, 70; 63]. През 2021 г. аптамери бяха използвани от Sun et al. за предотвратяване на свързването на шиповия протеин на вируса към мембранно-свързаната форма на ангиотензин-конвертиращия ензим тип 2 (т.нар. АСЕ рецептор) на клетката-гостоприемник, която е основната входна врата на вируса в белодробния епител и други тъкани [82].

Антисенс олигонуклеотиди (antisense oligonucleotides, ASO)

Антисенс олигонуклеотидите са изкуствени къси едноверижни нуклеинови киселини, които са проектирани специално да свързват и инхибират иРНК. ASO, предназначени за използване при борбата с вирусни заболявания таргетират тези иРНК, които кодират ключово важни за инфекцията белтъци на вируса. Първият официално одобрен за употреба ASO беше фомивирсен (Vitravene на Novartis). Той представлява олигодеоксирибонуклеотид с дължина 21 нуклеотида, комплементарен на последователността, кодираща ранните белтъци на цитомегаловируса. Vitravene беше изтеглен „по търговски причини“от пазара през 2002 г. [Public Statement on Vitravene (fomivirsen) (europa.eu)].Подробно обяснение на причината за изтеглянето не беше дадена.

До момента са описани три поколения ASO, които се различават по своите химични характеристики, фармакокинетика, ефикасност и токсичност. ASO от първо поколение имат тиофосфатен скелет, което води до повишена устойчивост на хидролиза. Фомивирсен беше ASO от първо поколение. ASO от второ поколение са модифицирани на позиция 2 в пентозния остатък, което им позволява да създават стерично пречене при междумолекулните взаимодействия. Един от по-известните ASO от второ поколение, мипомирсен (Kynamro, от Genzyme) беше забранен за употреба от Европейската агенция по лекарствата скоро след излизането му на пазара поради тежки нежелани ефекти [http://www.fiercebiotech.com/regulatory/ema-committee-shoots-down-sanofi-s-cholesterol-drug-mipomersen]. ASO от трето поколение имат много висока нуклеазна резистентност, повишен афинитет към прицелните молекули и подобрена фармакокинетика в сравнение с предишните поколения. Такъв е, напр. напр. Етерлипсен – предлаган на пазара като препарата ExonDys на AVI BioPharma International за лечение на мускулна дистрофия на Дюшен)

През 2004 г., малко след началото на първата епидемия от човешки бета-коронавирус, беше съобщено за разработването на няколко ASO от второ поколение срещу причинителя на SARS-CoV [56]. Те таргетират, най-общо казано, отворената рамка за четене на основния полипротеин на вируса (ORF1) и неговата 5′-нетранслирана регулаторна последователност. In vitro те демонстрираха значителна антивирусна активност. След това бяха проектирани ASO, насочени към мястото за иницииране на транслацията на ORF1 и мястото, където се извършва изместването на рамката за четене, за да може от една последователност да се транскрибира повече от един полипротеин (т.нар. „псевдовъзел“) [1]. По-късно AVI Biopharma разработи ASO, насочени към 3’-нетранслираната последователност на вирусната РНК [AVI BioPharma’s NeuGene antisense drugs inhibit SARS coronavirus (pharmabiz.com)]. През 2020 г. беше съобщено за разработването на бърза и високочувствителна система за откриване на наличието на РНК на SARS-CoV-2 [51]. Тя е базирана на ASO, конюгирани със златни наночастици. Детекцията се извършва чрез колориметричен анализ. Тези ASO са от първо поколение и са специфични за гена, кодиращ нуклеокапсидния фосфопротеин на SARS-CoV-2. Според авторите на цитираното проучване, тяхната методология позволява чрез цветна реакция, неизискваща специална апаратура, да бъдат открити много ниски количества на РНК на SARS-CoV-2 (няколко копия на вирусния геном).

Малки интерфериращи РНК (small interfering RNAs, siRNA)

Малките интерфериращи РНК са изкуствено създадени къси двуверижни РНК молекули, които имат свойството да подтискат експресията на специфични гени. Някои от тях се използват (сравнително отскоро) в клиничната медицина. По-важни техни представители са патисиран и живосиран, които в момента намират приложение в специфичното лечение на генетични заболявания. И двете имат статут на „първо по рода си“ лекарство [9]. Според дефиницията на FDA, „първо по рода си“е лекарство, което действа чрез „нов и уникален механизъм на действие“за лечение на определено заболяване или състояние [FDA approves first-of-its kind targeted RNA-based therapy to treat a rare disease | FDA].

Патисиран (Onpattro на Alnylam) е одобрен за лечение на полиневропатия при пациенти с наследствена транстиретинова амилоидоза (причинена от мутации в транстиретиновия (TTR) ген при човека) [Onpattro | European Medicines Agency (europa.eu)]. Лекарството таргетира специфично иРНК на мутантната форма на hTTR гена. Мутантният алел кодира белтък, който се конформира неправилно, поради което се метаболизира неправилно и продуктите от неговото разграждане се отлагат в много тъкани и органи. Лекарство за лечение на транстиретинова амилоидоза от същия клас, но от по-ново поколение, е ревусиран, който се произвежда от същата компания. Живосиран (Givlaari на Alnylam) е друго siRNA лекарство, използвано при лечението на остра чернодробна порфирия (генетично заболяване, причинено от мутации в гена ALAS1). Установено е, че живосиран намалява честотата на пристъпите на остра порфирия при пациентите-носители на мутации в този ген и намалява хроничната болка, която е основният симптом при това заболяване [Balwani et al., 2020].

И трите лекарства на Alnylam, съдържащи малки интерфериращи РНК, се основават на нанотехнологии. Патисиран се доставя насочено до черния дроб (където се експресира прицелният ген), опакован в липидни наночастици. По този начин се повишава резистентността на препарата към разграждане от нуклеази. РНК в живосиран и ревусиран също е опакована в липидни наночастици и е ковалентно свързана с лиганд, съдържащ остатъци от сиалова киселина, което осигурява по-добро свързване с прицелните клетки в черния дроб. Проникването на малките интерфериращи РНК в клетката се извършва чрез трансфекция и се осигурява от полимерни или липидни нановехикулуми (липозоми или липидни наночастици).

Една от по-ранните ваксини срещу инфекции с вируса Ебола (TKM-Ebola на Arbutus Biopharma Corporation) се основаваше на siRNA, капсулирана в липидни наночастици. Тази ваксина, обаче, не стигна до по-напреднали фази на клинични изпитания поради повишен риск от алергични реакции при пациентите.
Към момента, данните от експерименти върху животински модели показват, че, малки интерфериращи РНК, специфични за висококонсервативните участъци на генома на SARS-CoV-2 и опаковани в твърди липидни наночастици, могат да бъдат много ефикасни [4, 33]. Наноформулацията позволява фармацевтичният продукт да се достави преференциално в белия дроб, който е основно място за репликация на SARS-CoV-2. Авторите на цитираните проучвания, обаче, показаха експериментално, че натоварените с лекарство наночастици могат, с неголеми модификации, да се насочат и към други таргетни органи – черен дроб, слезка, и, вероятно и на други места. Това е изключително ценно при COVID-19, който е мултисистемно заболяване и може да увреди практически всяка тъкан и орган, а не само белите дробове. Към януари 2022 г.в базата данни за малките интерфериращи РНК, насочени към SARS-CoV-2, се съдържаха над 100 000 siRNA с дължина от18 до 21 нуклеотида [47] и броят им непрекъснато нараства. Очаква се това да допринесе за ускоряване на процеса на създаване на нови базирани на siRNA лекарства срещу COVID-19.

3.2. Наноформулации, разработени специално с цел доставка на антивирусни лекарства

Съвременните антивирусни лекарства имат висока ефикасност, но имат и своите ограничения. При немалка част от пациентите се налага прием на повече от едно лекарство, но антивирусните лекарства могат да взаимодействат помежду си, както и с други лекарства. Антивирусните лекарства често имат ниска бионаличност и кратък полуживот, което води до необходимост от многократно дозиране и, съответно, рискът пациентът да не взима лекарствата точно както е предписано се повишава. Прилагането на по-високи дози от лекарствата в опит да се компенсира ниската бионаличност може да доведе до токсични ефекти, особено при пациенти с генетично обусловени особености на метаболизма. Много вируси могат да проникнат в места, които са недостъпни за повечето лекарства (т.нар. „вирусни убежища“ – такива са, например, централната нервна система, лимфната система и синовиалната течност. При някои пациенти се налага продължително лечение. COVID-19 е сред инфекциозните заболявания, които могат да имат дълго протичане (честотата на синдрома на продължителен COVID достига 40-50% в някои проучвания) [54]. Развитието на лекарствена резистентност е често срещано при пациенти, които се нуждаят от лечение, което продължава повече от няколко дни или седмици. Накрая (но не по важност) е фактът, че тъй като вирусът използва клетъчния апарат на гостоприемника за синтез на своите белтъци и нуклеинови киселини, селективността на антивирусните агенти спрямо вируса и целевите клетки може да бъде критично важна. Новите платформи за доставка на лекарства, базирани на нанотехнологии могат да помогнат при намирането на решения на много от тези проблеми.

Допреди появата на SARS-CoV-2, най-честите заболявания при човека, причинени от РНК-съдържащи вируси бяха грип, хепатит С и HIV-свързаните състояния. Поради това, по-голямата част от информацията в тази връзка касае лечението на тези заболявания. Много лекарства, използвани успешно за лечение на инфекции с HIV и HCV, са изпитани или са в момента в изпитания за активност срещу SARS-CoV-2, като няколко от тях вече си използват успешно при лечението на COVID-19.

Поради това за целите на изложението може да се използва стандартната класификация на антивирусните средства, одобрени за лечение на HCV и HIV. Най-общо казано, по място на действие и патогенетичен механизъм тези лекарства могат да бъдат:

1. Интерферони;
2. Лекарства, инхибиращи навлизането на вируса в клетката (entry blockers);
3. Нуклеозидни/нуклеотидни аналози, инхибиращи репликацията на вируса (nucleoside reverse transcriptase inhibitors, NRTI);
4. Лекарства, инхибиращи репликацията, които не са нуклеозиди (non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors, NNRTI);
5. Лекарства, инхибиращи хидролизата на полипротеините на вируса (протеазни инхибитори, protease inhibitors, PI);
6. Лекарства, инхибиращи интеграцията на копия от вирусния геном в генома на клетката – гостоприемник (интегразни инхибитори, integrase inhibitors, II);
7. Антисенс нуклеотиди (ASO);
8. Малки интерфериращи РНК;
9. Други.

Антисенс нуклеотидите и малките интерфериращи РНК с активност при COVID-19 вече бяха разгледани по-горе.

Последната група, „Други“, се състои от различни лекарства, които обикновено се използват в клиничната медицина при други заболявания, като антималарици (напр. хидроксихлорохин), антихелминтни агенти (левамизол, ивермектин), антидепресанти (флувоксамин) и др. Тяхната активност при COVID-19 се дължи на това, че действат на принципа на действие на лекарствата от някоя от описаните по-горе групи (инхибитори на репликацията, протеазни инхибитори и др.). Някои от тях, като ивермектин, имат документирана антивирусна активност in vitro, но резултатите in vivo все още не са налице или не са обнадеждаващи [39]. Други (като бромхексин хидрохлорид, за който се предполага, че има протеазно-инхибиторна активност) са показали в експериментални условия известна активност in vivo по отношение на предотвратяване на симптоматично заболяване, но ефектите не са били достатъчно значими, за да оправдаят повече изследвания в областта или клиничните изпитвания в ранната фаза още не са приключили [48]. Експериментално е демонстрирано, че хлорохинът подтиска навлизането на вируса по ендозомния механизъм в клетката при SARS-CoV, инхибира гликозилирането на ACE2 рецепторите [93, 94] и има противовъзпалително действие поради инхибиране на активността на фосфолипаза А2 и блокиране на производството и освобождаването на цитокини [2]. Засега, обаче, при изпитанията при болни със SARS-CoV-2, значителни антивирусни ефекти не са наблюдавани. Флувоксаминът е антидепресант от групата на селективните инхибитори на обратния захват на серотонин (SSRI), който първоначално беше считан за обещаващо лечение при пациенти с COVID-19. Засега, обаче, данните от клиничните изпитания не са обнадеждаващи, макар че теоретически е възможно да са необходими по-обширни проучвания, за да се изясни дали приложението на флувоксамин има ефект върху тежестта на заболяването [91]. През 2019 г. беше докладвано за разработване на нова наноформулация на флувоксамин, основана на твърди липидни наночастици, която осигурява ефикасно насочено освобождаване на лекарството [35]. Все още, обаче, на пазара няма флувоксамин- съдържащ препарат с тези свойства.

Повсеместното разпространение на COVID-19 доведе до значително повишаване на нивата на стрес за всички – засегнатите от вируса, техните близки, хората с висок риск от развитие на усложнения при евентуално заразяване, както и напълно здрави хора с нисък риск, които се опасяват от потенциалните последствия на една инфекция. Както е типично в подобни ситуации, още от самото начало на пандемията се появиха „чудотворни лекарства“, широко рекламирани от медиите. Повечето от тях не показаха никакви значителни ползи за тези, които ги приемаха. Вместо това, при много пациенти се развиха потенциално предотвратими усложнения поради факта, че са пропуснали момента да потърсят подходящо лечение. Хидроксихлорохин, ивермектин, бромхексин, както и други лекарства, имаха на своите кратки периоди на (все още) незаслужена слава. Нито едно от тях досега не е показало значителни клинични ползи. Приложението им при пациенти с COVID-19 не бива да се окуражава, поне докато добре организирани и проведени големи проучвания не докажат категорично, че употребата им намалява нивата на хоспитализация и смъртност. Засега проучванията не показват такива резултати.

3.2.1. Интерферони

Интерфероните са сигнализационни белтъци, които се произвеждат от имунната система на заразения организъм-гостоприемник и пречат, т.е. интерферират (откъдето е и името им) на репликацията на вируса в клетката. Интерфероните бяха много използвани в близкото минало в терапията на вирусен хепатит, но тъй като рискът от нежелани ефекти беше висок, индикациите им бяха силно ограничени. Понастоящем интерферони се използват предимно при лечението на множествена склероза и различни видове тумори. Използваните в клиничната практика интерферони често се подлагат на ПЕГилиране с цел удължаване на времето на циркулация, за да може да се осигури време да се свържат с прицелните клетки и тъкани [89]. PegIntron (на Merck) беше търговски препарат на пегилиран интерферон алфа-2b, който се използваше в лечението на хепатит B и C до 2016 г., след което беше спрян от производство. Към настоящия момент, Pegasys (на Genentech) е единственият ПЕГилиран интерферон, одобрен за употреба от и от FDA, и EMA за лечение на хепатит В при възрастни [https://www.natap.org/2005/HBV/051605_02.htm; https://www.ema.europa.eu/en/documents/product-information/pegasys-epar-product-information_en.pdf]. PEG-интерферон алфа-2а (Roferone на Roche) е друго лекарство, което беше използвано при лечението на левкемия, злокачествен меланом, полицитемия вера, есенциална тромбоцитемия и др. и наскоро беше спряно поради тежки нежелани реакции и наличието на лекарства с по-добър профил на безопасност за тези заболявания [https://pharmac.govt.nz/medicine-funding-and-supply/medicine-notices/interferon-alfa-2a/]. Интерферон бета-1а (Rebif на Merck и Pfizer) понастоящем е одобрен за лечение на пациенти с множествена склероза с чести пристъпи [https://www.pfizer.com/news/press-release/press-release-detail/emd_serono_and_pfizer_announce_fda_approval_of_rebif_rebidose_interferon_beta_1a#:~:text=announced%20today%20that%20the%20U.S.,of%20multiple%20sclerosis%20(MS).].

Свързването на ПЕГ не е единственият нанотехнологичен подход, използван спрямо интерфероните. Златни наночастици бяха изследвани като потенциален вехикулум на интерферон алфа за лечение на инфекции с HCV [36]. Наноформулация с удължено освобождаване на интерферон бета-1а, основана на полимерни наночастици от кополимер на млечната и гликоловата киселина, беше разработена и тествана in vitro през 2020 г. [24]. По отношение на COVID-19 засега проучванията показват, че приложението на интерферон алфа при пациенти намалява отделянето на вируса в околната среда и потискат възпалението, докато приложението на интерферон бета е асоциирано с по-бързо очистване на организма от вируса [46]. В едно проучване беше показано, че приложението на пегилиран интерферон алфа 2b като допълнение към стандартната терапия за COVID-19 подобрява клиничния статус на пациента и води до по-бързо очистване на организма от вируса [12]. Проучванията на групата на Sodeifian върху животински модели, обаче, показват, че приложението на интерферони в ранната фаза на COVID-19 или при леко до умеренотежко протичащо заболяване може да има положителен ефект, но приложени по време на по-късни фази или при тежко заболяване могат да доведат до сериозни нежелани ефекти за пациента [80]. Резултатите от различните проучвания по отношение на ефекта на интерфероните при пациенти с COVID-19 засега изобщо са противоречиви. Едно рандомизирано контролирано проучване за употребата на интерферон бета при пациенти с тежка форма на COVID-19 съобщава за по-ниска смъртност в групата, получаваща интерферон. Самите автори, обаче, отбелязват, че пациентите, които са получили интерферон, са получавали в същата терапевтична схема и други лекарства, включително стандартни антивирусни средства (лопинавир/ритонавир или атазанавир/ритонавир) [44]. Друго проучване съобщава, че употребата на интерферон бета при пациенти с COVID-19 не води до значителна разлика в смъртността между изследваната за ефект на лекарството група и контролната група [21]. Противоречивите резултати от използването на интерферони при COVID-19 засега възпират изследователите и клиницистите от разгръщането на обширни клинични изпитания.

3.2.2.Нуклеозидни/нуклеотидни инхибитори на обратната транскриптаза (nucleoside reverse transcriptase inhibitors, NRTI)

Нуклеозидните инхибитори на обратната транскриптаза подтискат репликацията на вирусната нуклеинова киселина, като предоставят като градивен материал за синтез нуклеозиден аналог, който при добавяне към растящата полинуклеотидна верига би прекратил удължаването на веригата. Инхибиторите на обратната транскриптаза са подробно изследвани лекарства, тъй като са едни от основните лекарства за лечение на HIV-свързани състояния. Понастоящем, протоколите за антиретровирусна терапия (antiretroviral therapy (ART), доскоро наричана високо активна антиретровирусна терапия (highly active antiretroviral therapy, HAART)) предлагат анти-HIV терапията от първа линия да се състои от комбинация от няколко лекарства: два (или повече) NRTI, един представител на групата на ненуклеозидните инхибитори на обратната транскриптаза (NNRTI) и един протеазен или интегразен инхибитор. В зависимост от характеристиките на пациента към тази комбинация може да се добави и инхибитор на навлизането на вируса в клетката, но те не са подходящи за всеки пациент, повечето са доста скъпи, могат да имат сериозни неблагоприятни ефекти и често се налага да се прилагат повече от един път на ден, понякога парентерално. Това намалява обхвата на действие на тези лекарства и повишава риска пациентите да не вземат всичките предписани им лекарства.

Най-често използваните в момента лекарства от групата на NRTI са ламивудин, ставудин, зидовудин, емрицитабин, залцитабин, тенофовир, както и други.

NRTI (както и, впрочем, NNRTI) са много ефикасни лекарства. Разбира се, те имат и своите недостатъци – кратък полуживот, ефект на първо преминаване при орално приложение (бързо инактивиране на активната съставка при преминаването й през черния дроб), което води до ниска бионаличност; както и вариации в серумните нива, дължащи се на генетично обусловените индивидуални вариации на активността на CYP системата при различните хора. Поради тези причини, до настоящия момент за подобряване на доставката и стабилността на нуклеозидните аналози са изпитани много и различни технологии. Нанотехнологиите осигуряват набор от вехикулуми за ефикасно и насочено доставяне на лекарства за лечение на HIV инфекция – липозоми, дендримери, мицели, твърди липидни наночастици, наносуспензии и полимерни наночастици [73, 29].

Данните за използването на нанотехнологии за подобряване на доставката на антивирусни средства срещу COVID-19 в организма все още са оскъдни, но тази област се развива бързо. Повечето антивирусни лекарства, използвани при COVID-19 в момента, са от групата на NRTI. Такива са: фавипиравир (гуанозинов аналог); молнупиравир (аналог на пиримидиновите рибонуклеозиди) и ремдесивир (аденозинов аналог). По-голямата част от лекарствата от групата на NRTI са одобрени за пациенти с лека до умерена форма на COVID-19, при които има висок риск от усложнения. Поради тове тяхното приложение трябва да започне рано в хода на заболяването, преди развитието на усложненията. Само ремдесивирът беше одобрен за лечение на хоспитализирани пациенти с тежко заболяване и дихателна недостатъчност [https://www.covid19treatmentguidelines.nih.gov/management/clinical-management/hospitalized-adults–therapeutic-management/], въпреки че по-късно беше одобрен за използване и при селектирани групи амбулаторни пациенти [https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-takes-actions-expand-use-treatment-outpatients-mild-moderate-covid-19]. В едно проучване от 2020 г. беше показано, че HIV-позитивните пациенти, получаващи комбинацията тенофовир/емрицитабин, имат по-нисък риск да развият COVID-19 след заразяване със SARS-CoV-2 и да бъдат хоспитализирани за това в сравнение с тези, които получават други терапии [5]. Към настоящия момент, се провеждат изпитания на наноформулации, които доставят ремдесивир и други антиретровирусни лекарства директно до белодробния епител. Такива са: натоварени с ремдесивир полимерни нановезикули, наноемулсии на фавипиравир, заредени с фавипиравир твърди липидни частици, и други. Засега изпитанията се провеждат in vitro [68, 92, 87], а проучванията in vivo в областта тепърва предстоят.

3.2.3. Ненуклеозидни инхибитори на обратната транскриптаза (NNRTI)

Ненуклеозидните инхибитори на обратната транскриптаза се използват главно в терапията на HIV-свързани състояния. Те инхибират директно обратната транскриптаза на HIV-1 чрез свързване по обратим и неконкурентен начин с ензима. Понастоящем най-използваните NNRTI са невирапин (Viramune на Boehringer Ingelheim), делавирдин (Rescriptor на ViiV Healthcare) и ефавиренц (генеричен на Mylan и Sustiva на Bristol Myers Squibb). Проблемите с бионаличността са подобни на тези при NRTI. В опит да се подобри бионаличността и да се осигури контролирано освобождаване на лекарството, Manyarara et al. през 2018 разработиха наноемулсия на невирапин за приложение в педиатрията. Впоследствие беше разработена и самоемулсифицираща се система, натоварена с невирапин с цел повишаване на бионаличността на лекарството [60]. От проведените до момента изследвания чрез моделиране и in vitro, NNRTI засега не показват клинична ефикасност срещу SARS-CoV-2 [15, 25].

3.2.4. Инхибитори на навлизането на вируса в клетката

Инхибиторите на навлизане предотвратяват навлизането на вируса в клетката, като намаляват пропускливостта на обичайното входно място на вируса, напр. предпочитаният от него за свързване и проникване повърхностен рецептор. Инхибиторите на навлизането в клетката като маравирок (Celzentry на GlaxoSmithKline), енфивуртид (Fuzeon на Genentech), булевиртид (Hepcludex на Gilead Sciences) и др. се използват при лечението на инфекции с HIV и хепатит D. През 2015 г. наночастици от железен оксид, покрити с амфифилен полимер бяха използвани за доставяне на енфивуртид до „вирусни убежища“ при миши модели на HIV [23]. През 2020 г. полимерно-липидни хибридни наночастици, натоварени с комбинация от енфивуртид и ненуклеозиден инхибитор на обратната транскриптаза (ефавиренц) бяха използвани за доставяне на лекарствата до Т-клетки и макрофаги, изолирани във вирусни убежища. Експериментите по отношение на насочена доставка на лекарства от този клас при COVID-19 предстоят.

3.2.5. Протеазни инхибитори

Протеазните инхибитори подтискат активността на протеазата, която хидролизира вирусния полипротеин, за да се образуват отделните вирусни белтъци. Протеазните инхибитори, подобно на описаните по-горе нуклеозидни аналози, са много добре проучени поради честата им употреба в лечението на HIV. Също както нуклеозидните аналози, протеазните инхибитори, приети през устата, са обект на метаболизъм при първо преминаване и са субстрати на CYP. Това води до значителна вариация на нивата на едно и също лекарство, приемано в една и съща доза при различните индивиди. Това се преодолява отчасти чрез съвместното им прилагане с лекарства, които инхибират активността на CYP3A и по този начин водят до повишаване на серумното ниво на протеазните инхибитори. Такива лекарства са, например, ритонавир и кобицистат. Разработени са нанотехнологични подходи с цел подобряване на бионаличността на най-често използаните протеазни инхибитори. Такива са, например, твърди липидни наночастици и наночастици на полимерна основа, натоварени с лопинавир, наноемулсии и наносуспензии на атаназавир, липидни наночастици, натоварени с дарунавир, полимерни наночастици, натоварени с нелфинавир, и други [55, 66, 88, 28, 79, 7, 18]. Установено е, че бионаличността на саквинавир във вирусни убежища се повишава значително чрез използване на квантови точки [42].

Протеазните инхибитори са един от заменимите компоненти на антиретровирусната терапия за HIV, тъй като към задължителните в протокола ART инхибитори на обратната транскриптаза може да се добави или протеазен, или интегразен инхибитор, в зависимост от особеностите на пациента и опита на лекаря. При COVID-19, обаче, протеазните инхибитори имат потенциал (поне засега) да се окажат специфично и незаменимо лекарство. През 2020 г. групата на Beck използва математически модел за предсказване на взаимодействие между лекарството и прицелните молекули, за да оцени потенциалната активност при COVID-19 на група лекарства от различни класове, които рутинно се използват за лечение на HIV и други инфекции с РНК вируси – ремдесивир, ефавиренц, ритонавир и долутегравир [10] ]. Резултатите им показаха, че атазанавирът има много висок афинитет към вирусната протеаза на SARS-CoV-2. Това потенциално действие на атаназавир се изследва в момента с цел клинични приложения при пациенти с COVID-19. Paxlovid на Merck е ново лекарство за перорално приложение при пациенти с COVID-19 и риск от тежки усложнения, което съдържа като активна съставка протеазен инхибитор. То беше одобрено за употреба през декември 2020 г. Съдържа протеазния инхибитор нирматрелвир и споменатия по-горе ритонавир като инхибитор на CYP3A [59]. След като бъдат събрани достатъчно данни за ефикасността на пероралния препарат, вероятно ще бъдат разработени и наноформулации на същото лекарство.

3.2.6. Интегразни инхибитори

Интегразните инхибитори подтискат инсертирането на ДНК копие на РНК на вируса в генома на клетката гостоприемник. Интегразните инхибитори, напр. долутегравир (Tivicay на ViiV Healthcare), елвитегравир (част от фиксираната комбинация Stribild на Gilead Sciences) или ралтегравир (Isentress на Merck) са ключови компоненти в ART за HIV инфекции. Както повечето антиретровирусни лекарства, и интегразните инхибитори имат като недостатък слаба водоразтворимост и ниска бионаличност. Разработват се различни наноформулации на интегразни инхибитори с цел да се увеличи тяхната разтворимост и за контрол на доставката до таргетните клетки и тъкани. Още през 2006 г. беше постигнато значимо удължаване на времето на полуживот на долутегравир чрез миристоилиране и беше пусната на пазара форма с удължено действие [90]. През 2015 г. въз основа на наблюдението, че златните наночастици лесно се интернализират от лимфоцити и макрофаги беше разработен конюгат на ралтегравир със златни наночастици, който може да инхибира репликацията на HIV в периферните мононуклеарни клетки [26]. През 2020 г. беше установено, че долутегравирът има значим ефект за подтискане на активността на вирусната протеаза на SARS-CoV-2 [10]. Проучванията в областта продължават.

4. Изкуствени вирусоподобни частици, използвани за доставка на лекарства

Вирусоподобните частици (virus-like particles, VLP) са самосглобяващи се частици, които се образуват при смесване на вирусни протеини от капсида или вирусната обвивка с различни естествени белтъци като феритин или бактериалния белтък енкапсулин. От тази смес спонтанно се сглобяват структури, съдържащи както вирусните, така и невирус белтъци. Белтъците обикновено се произвеждат в хетероложни системи. Белтъците в състава на вирусоподобните частици могат да бъдат модифицирани или конюгирани с пептиди, токсини, химиотерапевтици, малки интерфериращи РНК, квантови точки и т.н., за да се постигне насочване към специфично прицелно място и/или да се контролира по време освобождаването на активната съставка.

VLP имат потенциал да се използват в широк спектър от приложения, включително разработване на лекарства, имунотерапии, ваксини, генни терапии, в образната диагностика, и др. Вирозомите са VLP, които имат допълнителен фосфолипиден двоен слой, който включва и гликопротеините на вирусната обвивка (напр. хемаглутинин). Схематично това е представено на фиг. 5.

Естествените вирусни частици имат свойството под действието на фактори от околната среда (промени в рН или в температурата на средата и пр.) да се саморазглобяват с освобождаване на вирусния геном или да отделят от обвивката си субединици от капсида или части от липидната обвивка, в които не присъства вирусна нуклеинова киселина. В разглобено състояние вирусните частици могат да се самосглобят отново във вирусоподобни частици при специфични условия [58]. Вирусоподобните частици наподобяват по своята морфология естествените вирусни частици и проявяват същия тропизъм към прицелните клетки, но не включват нуклеиновата киселина на вируса. На практика те са еквиваленти на вируси, но без геном. Когато бъдат натоварени с някакво активно вещество (лекарства, антитела, флуоресцентни багрила, контрастни вещества и пр.), то може да бъде доставено до специфични целеви клетки, използвайки взаимодействията вирус-клетка, характерни за естествения вирус. Свайствата на VLP се изучават активно и се използват за разработване на нови биоматериали с каталитична активност, биомиметични молекули или агенти за целите на образната диагностика със селективна насоченост [14, 58].

Фиг. 5. Схематично представяне на вирусоподобна частица (без фосфолипидната обвивка).

VLP се използват за проектиране на ваксини срещу човешки заболявания сравнително отскоро – по-точно от 2017 г., когато групата на Kanekiyo създаде фузионен белтък хемаглутинин-феритин, способен на спонтанно самосглобяване с образуване на наночастици, експониращи хемаглутининови тримери на повърхността си. На подобен принцип по-късно, през 2020 г. беше разработена ваксина срещу човешкия респираторно-синцитиален вирус (RSV), при която върху вирусоподобни частици е представен F-антигенът на RSV [30]. Тази ваксина (на компанията Novavax, която разработи и наскоро пусна на пазара ваксината Nuvaxovid срещу инфекция със SARS-CoV-2) все още е в период на клинични изпитания.

Вирусоподобните частици имат голям потенциал за подобряване на безопасността и ефективността на лекарствата. Използването на VLP засега се оказва с профил на безопасност, подобен на другите методологии, базирани на използване на вирусни компоненти, и по-добър от този на вирусните вектори. Един сериозен недостатък на VLP е тяхната висока потенциална имуногенност поради съдържанието на вирусни белтъци в тях. Все още не е напълно изяснено магнитудът на този проблем, тъй като вирусните белтъци се произвеждат в хетероложни системи (обикновено – бактериални) и съответно тяхната експресия не включва пост-транслационна обработка (напр. гликозилиране, което е един от основните източници на имуногенни епитопи) [3,58]. Тази особеност реално може да намали риска от имунен отговор от страна на гостоприемника, но са необходими много допълнителни изследвания в тази връзка, за да се оцени надеждно профилът на безопасност на вирусоподобните частици.

Счита се, че лекарства, които имат висока токсичност (каквито са, например, цитостатиците), биха могли сравнително безопасно и ефикасно да бъдат доставени до таргетните клетки с помощта на VLP. Ashley et al. още през 2011 г. използваха VLP за доставяне на доксорубицин до клетки на човешкия хепатоцелуларен карцином (Hep3B), за които се знае, че използват т.нар. Pgр-помпен механизъм за изхвърляне на химиотерапевтици [6]. Резултатите засега показват, че използването на вирусоподобни частици, натоварени с доксорубицин, цисплатина и 5-флуороурацил може да доведе до подтискане на деленето на раковите клетки при значително по-ниски серумни нива на химиотерапевтика, и, съответно, при много по-слабо изразени нежелани ефекти за пациента.

Въвеждането на допълнителни модификации (функционализация, наричана понякога в специализираната литература и „декорация“) на белтъците в състава на VLP повишава техния афинитет към прицелните клетки и подобрява освобождаването на лекарството. През 2007 г. беше съобщено за „декориране“ на VLP с биотин, осигуряващо насочване към прицелните места чрез взаимодействие авидин-биотин [67].

През 2020 г. бяха проведени изпитания в миши модели на три кандидат-ваксини срещу SARS-CoV-2, базирани на VLP. Те съдържаха иРНК на шиповия, мембранния и капсидния белтък на вируса. Най-общо казано, принципът на създаването и действието на тези VLP e следният: експресираните белтъци се опаковат в липидни наночастици и се трансфектират в култивирани клетки, след което VLP се отделят от клетките в културалната среда. Началните резултати бяха обнадеждаващи, въпреки че автори докладваха, че нивата на антителата при ваксинираните мишки бележат бърз спад скоро след ваксинацията [41]. През 2022 г. Yilmaz et al. докладва първите резултати от предклинично изпитание на базирана на VLP ваксина срещу SARS-CoV-2, предходно изпитана в култивирани клетки и върху животински модели. Тези VLP експресират всичките 4 структурни белтъка на SARS-CoV-2. Засега резултатите показват, че ваксината предизвиква мощен Т-клетъчен отговор и значително намалява вирусния товар при ваксинираните животни [96].

Covifenz (на Medicago и GSK) е ваксина, базирана на VLP. Нейните изпитания от фаза III приключиха в началото на февруари 2022 г. Според производителите, Covifenz вече е одобрен за употреба в Канада от местната регулаторна агенция Health Canada [Medicago’s Canada-made COVID-19 vaccine approved by Health Canada | Globalnews.ca].

Към м. февруари 2022 г. все още нямаше одобрени от FDA и EMA лекарствени форми на основата на вирусоподобни частици за лечение на COVID-19. Необходими са допълнителни, по-обширни изследвания за евентуалните приложения на VLP при лечението на инфекции със SARS-CoV-2, преди да бъдат одобрени продукти на тази основа.

---

Тест LO 4.2

---

Литература

1. Ahn D., Lee W., Choi J.K., Kim S.J., Plant E.P., Almazán F., Taylor D.R., et al. (2011).  Interference of ribosomal frameshifting by antisense peptide nucleic acids suppresses SARS coronavirus replication. Antiviral Res, 91(1), 1-10.
2. Al-Bari M. (2015). Chloroquine analogues in drug discovery: new directions of uses, mechanisms of actions and toxic manifestations from malaria to multifarious diseases. J Antimicrob Chemother, 70, 1608–1621.
3. Aljabali A., Hassan S., Pabari R., Shahcheraghi S., Mishra V., Charbe N., Chellappan D., et al. (2021). The viral capsid as novel nanomaterials for drug delivery. Future Sci OA, 7(9), FSO744.
4. Ambike S., Cheng C., Feuerherd M., Velkov S., Baldassi D., Afridi S.Q., Porras-Gonzalez D., et al., (2022). Targeting genomic SARS-CoV-2 RNA with siRNAs allows efficient inhibition of viral replication and spread. Nucleic Acids Res, 50(1), 333-349.
5. Del Amo J., Polo R., Moreno S., Díaz A., Martínez E., Arribas J., Jarrín I., et al., and The Spanish HIV/COVID-19 Collaboration. (2020). Incidence and Severity of COVID-19 in HIV-Positive Persons Receiving Antiretroviral Therapy: A Cohort Study Ann Intern Med, 173(7), 536-541.
6. Ashley C., Carnes E., Phillips G., Durfee P., Buley M., Lino C., Padilla D., et al. (2011). Cell-specific delivery of diverse cargos by bacteriophage MS2 virus-like particles. ACS Nano, 5(7), 5729-45.
7. Augustine R., Ashkenazi D.L., Arzi R.S., Zlobin V., Shofti R. and Sosnik A. (2018). Nanoparticle-in-microparticle oral drug delivery system of a clinically relevant darunavir/ritonavir antiretroviral combination. Acta Biomater, 74, 344-359.
8. Auría-Soro C., Nesma T., Juanes-Velasco P., Landeira-Viñuela A., Fidalgo-Gomez H., Acebes-Fernandez V., Gongora R., et al. (2019). Interactions of Nanoparticles and Biosystems: Microenvironment of Nanoparticles and Biomolecules in Nanomedicine.Nanomaterials (Basel), 9(10), 1365.
9. Balwani M., Sardh E., Ventura P., Peiró P., Rees D., Stölzel U., Bissell D., et al., and ENVISION Investigators. (2020). Phase 3 Trial of RNAi Therapeutic Givosiran for Acute Intermittent Porphyria. Clinical Trial N Engl J Med, 382(24):2289-2301.
10. Beck B., Shin B., Choi Y., Park S. and Kang K. (2020). Predicting commercially available antiviral drugs that may act on the novel coronavirus (SARS-CoV-2) through a drug-target interaction deep learning mode. Comput Struct Biotechnol J, 18, 784-790.
11. Bigini P., Gobbi M., Bonati M., Clavenna A., Zucchetti M., Garattini S. and Pasut G. (2021). The role and impact of polyethylene glycol on anaphylactic reactions to COVID-19 nano-vaccines. Nature Nanotechnol, 16, 1169-1171.
12. Bhushan B., Wanve S., Koradia P., Bhomia V., Soni P., Chakraborty S., Khobragade A., et al., and Study Investigators Group. (2021). Efficacy and safety of pegylated interferon-α2b in moderate COVID-19: a phase 3, randomized, comparator-controlled, open-label study. Clinical Trial Int J Infect Dis, 111, 281-287.
13. Chakarov S., Petkova R., Russev G. (2008). Rapid and efficient method for production of T4 endonuclease V by heterologous expression in E. coli. Biotechnol Biotechnol Equip, 22(4), 1011-1012.
14. Chakravarty M. and Vora A. (2021). Nanotechnology-based antiviral therapeutics. Drug Deliv Transl Res, 11(3), 748-787.
15. Chang Y., Tung Y., Lee K., Chen T., Hsiao Y., Chang H., Hsieh T., et al. (2020). Potential Therapeutic Agents for COVID-19 Based on the Analysis of Protease and RNA Polymerase Docking. Preprint. February 2020, DOI:10.20944/preprints202002.0242.v1.
16. Cho S., Woo H., Kim K., Oh J. and Jeong Y. (2011). Novel system for detecting SARS coronavirus nucleocapsid protein using an ssDNA aptamer. J Biosci Bioeng, 112(6), 535-40.
17. Davoudi-Monfared E., Rahmani H., Khalili H., Hajiabdolbaghi M., Salehi M., Abbasian L., Kazemzadeh H. and Yekaninejad M. (2020). A Randomized Clinical Trial of the Efficacy and Safety of Interferon β-1a in Treatment of Severe COVID-19. Antimicrob Agents Chemother, 64(9), e01061-20.
18. Desai J. and Thakkar H. (2018). Darunavir-Loaded Lipid Nanoparticles for Targeting to HIV Reservoirs. AAPS PharmSciTech, 19(2), 648–660.
19. Ditzler M., Bose D., Shkriabai N., Marchand B., Sarafianos S., Kvaratskhelia M., Burke D. (2011). Broad-spectrum aptamer inhibitors of HIV reverse transcriptase closely mimic natural substrates. Nucleic Acids Res, 39(18), 8237-8247.
20. Duncan R., Vicent M., Greco F. and Nicholson R. (2005). Polymer–drug conjugates: towards a novel approach for the treatment of endrocine-related cancer. Endocr Relat Cancer, 12(Suppl. 1), S189–S199.
21. Estébanez M., Ramírez-Olivencia G., Mata T., Martí D., Gutierrez C., de Dios B., Herrero M., et al., and COVID 19 Central Defense Hospital “Gomez Ulla” Team. (2020). Clinical evaluation of IFN beta1b in COVID-19 pneumonia: a retrospective study. Preprint from medRxiv, 19 May 2020, DOI: 10.1101/2020.05.15.20084293.
22. Ferreira D., Barbosa J., Sousa D.A., Silva C., Melo L.D.R., Avci-Adali M., Wendel H.P., et al. (2021). Selection of aptamers against triple negative breast cancer cells using high throughput sequencing. Sci Rep, 11(1), 8614.
23. Fiandra L., Colombo M., Mazzucchelli S., Truffi M., Santini B., Allevi R., Nebuloni M., et al. (2015). Nanoformulation of antiretroviral drugs enhances their penetration across the blood brain barrier in mice. Nanomedicine, 11(6), 1387-1397.
24. Fodor-Kardos A., Kiss A., Monostory K. and Feczkó T. (2020). Sustained in vitro interferon-beta release and in vivo toxicity of PLGA and PEG-PLGA nanoparticles. RSC Adv, 10, 15893.
25. Frediansyah A., Tiwari R., Khan S., Dhama K. and Harapan H. (2021). Antivirals for COVID-19: A critical review. Clin Epidemiol Glob Health, 9, 90-98.
26. Garrido C., Simpson C., Dahl N., Bresee J., Whitehead D., Lindsey E., Harris T., et al. (2015). Gold nanoparticles to improve HIV drug delivery. Future Med Chem, 7(9): 1097–1107.
27. Giovannini G., Haick H. and Garoli D. (2021). Detecting COVID-19 from Breath: A Game Changer for a Big Challenge. ACS Sens, 6(4), 1408–1417.
28. Ghosh A., Osswald H., Prato G. (2016). Recent Progress in the Development of HIV-1 Protease Inhibitors for the Treatment of HIV/AIDS. J Med Chem, 59(11), 5172–5208.
29. Gong Y., Chowdhury P., Nagesh P., Cory T., Dezfuli C., Kodidela S., Singh A., et al. (2019). Nanotechnology approaches for the delivery of cytochrome P450 substrates in HIV treatment. Expert Opin Drug Deliv, 16(8), 869–882.
30. Ha B., Yang J., Chen X., Jadhao S., Wright E. and Anderson L. (2020). Two RSV Platforms for G, F, or G+F Proteins VLPs. Viruses, 12(9), 906.
31. Huang L., Luo Y., Sun X., Ju H., Tian J. and Yu B.Y. (2017). An artemisinin-mediated ROS evolving and dual protease light-up nanocapsule for real-time imaging of lysosomal tumor cell death. Biosens Bioelectron, 92, 724-732.
32. Hung I., Lung K., Tso E., Liu R., Chung T., Chu M., Ng Y., et al. (2020). Triple combination of interferon beta-1b, lopinavir-ritonavir, and ribavirin in the treatment of patients admitted to hospital with COVID-19: an open-label, randomised, phase 2 trial. Lancet, 395(10238), 1695-1704.
33. Idris A., Davis A., Supramaniam A., Acharya D., Kelly G., Tayyar Y., West N., et al. (2021). A SARS-CoV-2 targeted siRNA-nanoparticle therapy for COVID-19. Mol Ther, 29(7), 2219-2226.
34. Kinghorn A., Dirkzwager R., Liang S., Cheung Y., Fraser L., Shiu S., Tang M., Tanner J. (2016). Aptamer Affinity Maturation by Resampling and Microarray Selection. Anal Chem., 88(14), 6981-5.
35. Kumar A., Mancy S., Manjunath K., Kulkarni S. and Jagadeesh R. (2019). Formulation and Evaluation of Fluvoxamine Maleate Loaded Lipid Nanoparticle. Int J Pharm Sci Nanotechnol, 12(4), 4593-4600.
36. Lee M., Yang J., Jung H., Beack S., Choi J., Hur W., Koo H. et al. (2012).  Hyaluronic Acid–Gold Nanoparticle/Interferon α Complex for Targeted Treatment of Hepatitis C Virus Infection. ACS Nano, 6(11), 9522–9531.
37. Li H., Tatematsu K., Somiya M., Iijima M. and Kuroda S. (2018). Development of a macrophage-targeting and phagocytosis-inducing bio-nanocapsule-based nanocarrier for drug delivery. Acta Biomater, 73, 412-423.
38. Li W., Wu J., Zhan P., Chang Y., Pannecouque C., De Clercq E. and Liu X. (2012). Synthesis, drug release and anti-HIV activity of a series of PEGylated zidovudine conjugates. Int J Biol Macromol, 50(4), 974-980.
39. Lim S., Hor C., Tay K., Mat Jelani A., Tan W., Ker H., Chow T., et al., and I-TECH Study Group. (2022). Efficacy of Ivermectin Treatment on Disease Progression Among Adults With Mild to Moderate COVID-19 and Comorbidities: The I-TECH Randomized Clinical Trial. JAMA Intern Med, 2022 Feb 18. doi: 10.1001/jamainternmed.2022.0189. (online ahead of print).
40. Liu S., Wang Z., Xie H., Liu A., Lamb D. and Pang D. (2020). Single-Virus Tracking, From Imaging Methodologies to Virological Applications. Chem Rev, 120, 1936-1979.
41. Lu J., Lu G., Tan S., Xia J., Xiong H., Yu X., Qi Q., et al. (2020). A COVID-19 mRNA vaccine encoding SARS-CoV-2 virus-like particles induces a strong antiviral-like immune response in mice. Cell Res, 30(10), 936-939.
42. Mahajan S., Roy I., Xu G., Yong K.T., Ding H., Aalinkeel R., Reynolds J., et al. (2010). Enhancing the delivery of anti retroviral drug Saquinavir across the blood brain barrier using nanoparticles. Curr HIV Res, 8, 396–404.
43. Kawata Mahlknecht G., Sela M. and Yarden Y. (2015). Aptamer Targeting the ERBB2 Receptor Tyrosine Kinase for Applications in Tumor Therapy. Methods Mol Biol, 1317, 3-15.
44. Malhani A., Enani M., Saheb Sharif-Askari F., Alghareeb M., Bin-Brikan R., AlShahrani S., Halwani R., et al. (2021). Combination of (interferon beta-1b, lopinavir/ritonavir and ribavirin) versus favipiravir in hospitalized patients with non-critical COVID-19: A cohort study. PLoS One, 16(6), e0252984.
45. Mann A., Somasunderam A., Nieves-Alicea R., Li X., Hu A., Sood A., Ferrari M., et al. (2010). Identification of thioaptamer ligand against E-selectin: Potential application for inflamed vasculature targeting. PLoS ONE, 5, e13050.
46. Mary A., Hénaut L., Macq P.Y., Badoux L., Cappe A., Porée T., Eckes M., et al. (2020). Rationale for COVID-19 Treatment by Nebulized Interferon-β-1b–Literature Review and Personal Preliminary Experience. Front Pharmacol, 11, 592543.
47. Medeiros I., Khayat A., Stransky B., Santos S., Assumpção P. and de Souza J. (2021). A small interfering RNA (siRNA) database for SARS-CoV-2. Nature Sci Rep, 11, 8849.
48. Mikhaylov E., Lyubimtseva T., Vakhrushev A., Stepanov D., Lebedev D., Vasilieva E., Konradi A., et al. (2022). Bromhexine Hydrochloride Prophylaxis of COVID-19 for Medical Personnel: A Randomized Open-Label Study. Interdiscip Perspect Infect Dis, 2022, 4693121.
49. Mishra S., Malhotra P., Gupta A.K., Singh P.K., Mishra A.K., Javed S. and Kumar R. (2014). Novel method for screening of radioprotective agents providing protection to DNA ligase against gamma radiation induced damage. Int J Radiat Biol, 90(2), 187-192.
50. Mohammed S. and Shaaban E. (2019). Efficacious nanomedicine track toward combating COVID-19. Randomized Controlled Trial. N Engl J Med, 381(24), 2293-2303.
51. Moitra P., Alafeef M., Dighe K., Frieman M. and Pan D. (2020). Selective Naked-Eye Detection of SARS-CoV-2 Mediated by N Gene Targeted Antisense Oligonucleotide Capped Plasmonic Nanoparticles. ACS Nano, 14, 7617-7627.
52. Monk P., Marsden R., Tear V., Brookes J., Batten T., Mankowski M., Gabbay F., et al., and Inhaled Interferon Beta COVID-19 Study Group. (2021). Collaborators, Safety and efficacy of inhaled nebulised interferon beta-1a (SNG001) for treatment of SARS-CoV-2 infection: a randomised, double-blind, placebo-controlled phase 2 trial. Clinical Trial Lancet Respir Med, 9(2), 196-206.
53. Musafia B., Oren-Banaroya R. and Noiman S. (2014). Designing anti-influenza aptamers: novel quantitative structure activity relationship approach gives insights into aptamer-virus interaction. PLoS One, 9(5), e97696.
54. Nasserie T., Hittle M. and Goodman S. (2021). Assessment of the Frequency and Variety of Persistent Symptoms Among Patients With COVID-19: A Systematic Review. JAMA Network Open, 4 (5), e2111417.
55. Negi J., Chattopadhyay P., Sharma A.K., and Ram V. (2013). Development of solid lipid nanoparticles (SLNs) of lopinavir using hot self nano-emulsification (SNE) technique. Eur J Pharm Sci, 48(1–2), 231-239.
56. Neuman B., Stein D., Kroeker A., Bestwick R., Iversen P., Moulton H., and Buchmeier M. (2006). Inhibition and Escape of SARS-CoV Treated with Antisense Morpholino Oligomers. In: The Nidoviruses, 581, 567–571.
57. Nimjee S., Povsic T., Sullenger B. and Becker R. (2016). Translation and Clinical Development of Antithrombotic Aptamers. Nucleic Acid Ther, 26(3), 147-155.
58. Nooraei S., Bahrulolum H., Hoseini Z., Katalani C., Hajizade A., Easton A. and Ahmadian G. (2021). Virus-like particles: preparation, immunogenicity and their roles as nanovaccines and drug nanocarriers. J Nanobiotechno, 19, 59.
59. Owen D., Allerton C., Anderson A., Aschenbrenner L., Avery M., Berritt S., Boras B., et al. (2021). An oral SARS-CoV-2 M(pro) inhibitor clinical candidate for the treatment of COVID-19. Science 374(6575), 1586-1593.
60. Panner Selvam R. and Kulkarni P. (2014). Design and Evaluation of Self Nanoemulsifying Systems for Poorly Water Soluble HIV Drug. J PharmaSciTech, 4(1).
61. Puri A., Loomis K., Smith B., Lee J-H., Yavlovich A., Heldman E. and Blumenthal R. (2009). Lipid-based nanoparticles as pharmaceutical drug carriers: from concepts to clinic. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 26, 523–580.
62. Rabowsky J., Dukes A., Lee D. and Leong K. (1996). The use of bioerodible polymers and daunorubicin in glaucoma filtration surgery. Clin Trial Ophthalmol, 103(5), 800-807.
63. Samson R., Navale G. and Dharne M.  (2020). Biosensors: frontiers in rapid detection of COVID-19. J Biotech, 10(9), 385.
64. Rahmani H., Davoudi-Monfared E., Nourian A., Khalili H., Hajizadeh N., Jalalabadi N., Fazeli M., et al (2020). Interferon beta-1b in treatment of severe COVID-19: A randomized clinical trial. Int Immunopharmacol, 88, 106903.
65. Rasmi Y., Saloua K., Nemati M., and Choi J. (2021). Recent Progress in Nanotechnology for COVID-19 Prevention, Diagnostics and Treatment.  Review Nanomaterials (Basel), 11(7), 1788.
66. Ravi P., Vats R., Dalal V., Nitin Gadekar N. (2015). Design, optimization and evaluation of poly-ɛ-caprolactone (PCL) based polymeric nanoparticles for oral delivery of lopinavir. Drug Dev Ind Pharm,41(1), 131–140.
67. Reches M. and Gazit E. (2007). Biological and chemical decoration of peptide nanostructures via biotin-avidin interactions.  J Nanosci Nanotechnol, 7(7), 2239-2245.
68. de M Ribeiro N. and Fonseca B. (2020). The role of pharmaceutical nanotechnology in the time of COVID-19 pandemic Review Future Microbiol, 15, 1571-1582.
69. Roberts D., Rossman J. and Jarić I. (2021). Dating first cases of COVID-19. PLOS Pathogens, June 24, 2021, https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009620.
70. Roh C. and Jo S. (2011). Quantitative and Sensitive Detection of SARS Coronavirus Nucleocapsid Protein Using Quantum Dots-Conjugated RNA Aptamer on Chip. J Chem Technol Biotechnol, 86, 1475-1479.
71. Rose K., Alves Ferreira-Bravo I., Li M., Craigie R., Ditzler M., Holliger P. and DeStefano J. (2019). Selection of 2′-Deoxy-2′-Fluoroarabino Nucleic Acid (FANA) Aptamers That Bind HIV-1 Integrase with Picomolar Affinity. ACS Chem Biol, 14(10), 2166-2175.
72. Rosenberg J., Bambury R., Van Allen E., Drabkin H., Lara P. Jr., Harzstark A., Wagle N., et al. (2014). A phase II trial of AS1411 (a novel nucleolin-targeted DNA aptamer) in metastatic renal cell carcinoma. Invest New Drugs, 32(1), 178-187.
73. Roy U., Rodríguez J., Barber P., das Neves J., Sarmento B. and Nair M. (2015). The potential of HIV-1 nanotherapeutics: from in vitro studies to clinical trials. Nanomedicine (London, England), 10(24), 3597–3609.
74. Sabourian P., Yazdani G., Ashraf S., Frounchi M., Mashayekhan S., Kiani S. and Kakkar A. (2020). Effect of Physico-Chemical Properties of Nanoparticles on Their Intracellular Uptake. Int J Mol Sci, 21(21), 8019.
75. Shan B., Broza Y.Y., Li W., Wang Y., Wu S., Liu Z., Wang J., et al. (2020). Multiplexed Nanomaterial-Based Sensor Array for Detection of COVID-19 in Exhaled Breath. ACS Nano, 14(9):12125-12132.
76. Seo G., Lee G., Kim M., Baek S., Choi M., Ku K., Lee C., et al. (2020). Rapid Detection of COVID-19 Causative Virus (SARS-CoV-2) in Human Nasopharyngeal Swab Specimens Using Field-Effect Transistor-Based Biosensor. ACS Nano, 14(4), 5135-5142.
77. Sercombe L., Veerati T., Moheimani F., Wu S.Y., Sood A.K. and Hua S. (2015). Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery. Front Pharmacol, 6, 286.
78. Shan B., Broza Y., Li W., Wang Y., Wu S., Liu Z., Wang J., et al. (2020). Multiplexed Nanomaterial-Based Sensor Array for Detection of COVID-19 in Exhaled Breath. ACS Nano, 14, 12125-12132.
79. Singh G. and Pai RS. (2016). Atazanavir-loaded Eudragit RL 100 nanoparticles to improve oral bioavailability: optimization and in vitro/in vivo appraisal. Drug delivery, 23(2), 532–539.
80. Sodeifian F., Nikfarjam M., Kian N., Mohamed K. and Rezaei N. (2022). The role of type I interferon in the treatment of COVID-19. J Med Virol, 94(1), 63-81.
81. Somvanshi S., Kharat B., Saraf S., Somwanshi S., Shejul S., and Jadhav K. (2020). Multifunctional Nano-Magnetic Particles Assisted Viral RNA-Extraction Protocol for Potential Detection of COVID-19. Mater Res Innov, 25, 169-174.
82. Sun M., Liu S., Wei X., Wan S., Huang M., Song T., Lu Y., et al. (2021). Aptamer Blocking Strategy Inhibits SARS-CoV-2 Virus Infection. Angew Chem Int Ed Engl, 60(18), 10266-10272.
83. Svenson S. and Tomalia DA. (2005). Dendrimers in biomedical applications-reflections on the field. Adv Drug Deliv Rev, 57(15), 2106-2129.
84. Tran S., DeGiovanni P-J., Piel B. and Rai P. (2017). Cancer nanomedicine: a review of recent success in drug delivery. Clin Transl Med, 6, 44.
85. Trujillo C., Nery A., Alves J., Martins A. and Ulrich H. (2007). Development of the anti-VEGF aptamer to a therapeutic agent for clinical ophthalmology. Clin Ophthalmol, 1(4), 393-402.
86. Tsogtbaatar K., Sousa D.A., Ferreira D., Tevlek A., Aydın H.M., Çelik E. and Rodrigues L. (2022). In vitro selection of DNA aptamers against human osteosarcoma. Invest New Drugs, 40(1), 172-181.
87. Tulbah A. and Lee W-H. (2021). Physicochemical Characteristics and In Vitro Toxicity/Anti-SARS-CoV-2 Activity of Favipiravir Solid Lipid Nanoparticles (SLNs). Pharmaceuticals (Basel), 14(10), 1059.
88. Venkatesh D., Baskaran M., Karri V., Mannemala S., Radhakrishna K. and Goti S. (2015). Fabrication and in vivo evaluation of Nelfinavir loaded PLGA nanoparticles for enhancing oral bioavailability and therapeutic effect. Saudi Pharm J, 23(6), 667–674.
89. Veronese F. and Mero A. (2008). The impact of PEGylation on biological therapies. BioDrugs, 22(5), 315-329.
90. Vyas T., Shah L and Amiji M. (2006). Nanoparticulate drug carriers for delivery of HIV/AIDS therapy to viral reservoir sites. Expert Opin Drug Deliv, 3(5), 613–628.
91. Wen W., Chen C., Tang J., Wang C., Zhou M., Cheng Y., Zhou X., et al. (2022). Efficacy and safety of three new oral antiviral treatment (molnupiravir, fluvoxamine and Paxlovid) for COVID-19：a meta-analysis. Ann Med, 54(1), 516-523.
92. Wu J., Wang H. and Li B. (2020). Structure-aided ACEI-capped remdesivir-loaded novel PLGA nanoparticles, toward a computational simulation design for anti-SARS-CoV-2 therapy. Phys Chem Chem Phys, 22, 28434-28439.
93. Vincent M., Bergeron E., Benjannet S., Erickson B., Rollin P., Ksiazek T., Seidah N., et al. (2005). Chloroquine is a potent inhibitor of SARS coronavirus infection and spread. Virol J, 2, 69.
94. Yang Z., Huang Y., Ganesh L., Leung K., Kong W., Schwartz O., Subbarao K., et al. (2004). pH-dependent entry of severe acute respiratory syndrome coronavirus is mediated by the spike glycoprotein and enhanced by dendritic cell transfer through DC-SIGN. J Virol, 78(11), 5642-5550.
95. Yarosh D. (2002). Enhanced DNA repair of cyclobutane pyrimidine dimers changes the biological response to UV-B radiation. Mutat Res, 509(1-2), 221-226.
96. Yilmaz I., Ipekoglu E., Bulbul A., Turay N., Yildirim M., Evcili I., Yilmaz N., et al. (2022). Development and preclinical evaluation of virus-like particle vaccine against COVID-19 infection. Allergy, 77(1), 258-270.
97. Zhao Z., Cui H., Song W., Ru X., Zhou W. and Yu X. (2020), A Simple Magnetic Nanoparticles-Based Viral RNA Extraction Method for Efficient Detection of SARS-CoV-2. bioRxiv, 2020, doi: 10.1101/2020.02.22.961268.

Резюме

Наномедицината е вероятно най-важната „ключова технология“ на бъдещето: на никоя друга област не се възлагат толкова много надежди и никоя друга област не е натоварена с толкова големи очаквания да стимулира промени в обществото ни, при това промени, които са сравними по машаб с надеждите. Приложението на РНК-технологиите се очаква да изиграе съществена роля за реализиране на революцията на терапевтичните, диагностичните и превантивните (имунологични) изследвания (било то под формата на иРНК, сРНК или дори „свободна РНК“). иРНК-ваксините са само първата стъпка по този път към бъдещето. И макар етичните проблеми, свързани с приложението на нанотехнологиите, да са все още на едно много първично ниво (особено при положение че същинските рискове ще станат ясни едва след изминаването на пътя на емпиричния опит, така че към момента не попадат във фокуса на биоетиката), кръгът от въпроси по отношение на (нано)етиката може да се разшири значително, когато РНК-технологиите започнат да се утвърждават и в други области на наномедицината, базирана на генното инженерство.

Ключови думи/фрази: Биоетика, наноетика, технологична оценка, принцип на предпазливостта, социална приемливост, сигурност на иРНК-ваксините, защита на данните

1. Въведение: Нанотехнологии и “наноетика”

Нанотехнологичните процеси и продукти имат множество приложения от години – до голяма степен незабелязани от широката публика¹  , включително в медицината, където, в диагностиката и терапията, се използват все повече генетично модифицирани продукти (напр. човешки инсулин, получен чрез генетично модифицирани бактерии). При т.нар. „соматична генна терапия“ става дума и за необходимост, тъй като терапевтично ефективните генни секвенции трябва да компенсират неправилното функциониране на „болните“ гени с помощта на генни носители (предимно вируси, които са неспособни да се възпроизвеждат), например чрез кодиране на жизненоважни протеини, които самият болен организъм или не е в състояние да произведе изобщо, или не е в състояние да произведе в достатъчно количество. В този случай организмите в наномащаб дори се използват два пъти: от една страна, под формата на „здрава“ генна последователност, а от друга, чрез използването на системи за вирусен трансфер (вектори).

Освен в някои по-скоро „екзотични“ области на приложение, значението на нанотехнологиите (и по-специално на онези, свързани с генното инженерство) се осъзнава за първи път едва когато възниква нужда от ваксини от нов клас: става дума за иРНК-ваксините, които бяха разработени и използвани в борбата с пандемията от COVID-19, причинена от вируса SARS-CoV2. Преди това продуктите на генното инженерство се прилагаха предимно в селското стопанство и в хранителната промишленост, като често привличаха критики, понякога и много сериозни, свързани с възможните рискове за околната среда и за човешкото здраве. Затова и никак не беше изненадващо, че много хора се отнесоха скептично към иновативните иРНК-ваксини, поне първоначално, тъй като продуктите на генното инженерство не се радваха на добра репутация. Малко се знаеше (и все още е така) за потенциалните странични ефекти от тези ваксини поради липсата на дългосрочни клинични проучвания преди началото на кампаниите за ваксиниране. Едва когато в хода на кампаниите за масова ваксинация се установи ефикасността и относителната безопасност на иРНК-ваксините, обществото започна да оценява по-благосклонно новата технологии. Възможно е успехът на новите ваксини да помогне за подобряване на репутацията и на приема на продуктите на генното инженерство, за да се повиши доверието в приложенията им и в други области отвъд медицината.² В никакъв случай обаче не бива да се приема, че всички “чувствителни” въпроси относно т.нар. “наномедицина”, базирана на генното инженерство, са изяснени – и това се отнася с особена сила за етичната част в дебата за генното инженерство, който очевидно ще продължи да занимава специалистите по биоетика и наноетика още дълго време.

Нуждата от яснота относно тези технологии е свързана и с приложението на нанотехнологиите в микроскопичен мащаб, т.е. извън полето на непосредствена видимост. Освен това тези технологии се намесват в изключително сложната система от клетки и организми, чиито структури и механизми също са микроскопични по размер и чиято структура и функции също все още не са докрай изяснени. Протеомиката, която се занимава с динамичното поведение на протеините, експресирани от гените в клетката, е все още в начален етап на развитие и никой не знае със сигурност дали една ДНК- или РНК-молекула, ако бъде въведена в организма, наистина ще действа само с желания ефект (ако изобщо има някакъв ефект), или може да има и неблагоприятни (и непредвидени) последици. Извън лабораторията, където ни ограничават условията за безопасност, и при директното приложение върху живи хора (както беше в случая с иРНК-ваксините) клиничната или дори ежедневната медицинска употреба на генно модифицирани лекарства е равносилна на „истински експеримент“ върху обществото [25]. Такива реални експерименти се случваха и досега при изграждането на новаторски атомни електроцентрали или уникални структури (напр. мостове, сметища или летища), чиято стабилност и динамика трудно или изобщо не могат да бъдат симулирани в лабораторни условия.

В този контекст е ясно, че трябва да сме много предпазливи, но с оглед на крайно негативните, често фатални последици от пандемията, новите ваксини трябваше да се разработят и приложат бързо (понякога и в режим на „одобрение по спешност“) и в достатъчно широк мащаб, за да се предотвратят още по-лошите въздействия от заболеваемостта. Макар резултатите от проучванията да бяха много несигурни (особено при продължителната липса на дългосрочни данни), одобрението на новите ваксини все пак бе предшествано от детайлна оценка от страна на отговорните институции и комисии (включително национални институционални органи по етика), които обърнаха внимание и на етичните аспекти: трябваше да се прецени дали, с оглед на сериозната пандемична ситуация, е допустимо да се съкрати периодът за провеждане на клинични проучвания. Същевременно одобрението не беше никак лесно и определено не беше извършено „на сляпо“. Научната общност от имунолози, епидемиолози, инфекционисти и вирусолози, както и лицата, отговорни за политиките, бяха добре запознати с всички етични проблеми. И все пак, поне за момента, иРНК-ваксините могат да се оценят като голям успех и пробив за наномедицината.

В какъв мащаб работят нанотехнологиите и за какво служат? За да отговорим на този въпрос, нека погледнем отвън конкретния казус и да разгледаме ситуацията в сферата на нанотехнологиите. Нанотехнологиите описват структури, които са 80 000 пъти по-малки по диаметър от човешкия косъм (1 нанометър = 10^-9 метра). Критериите за класификация на материала като наноматериал обаче са различни: например британското правителство приема размер до 200 нанометра, докато САЩ позволяват до 1000 нанометра [18]. Тези технологии ще позволят да се изследват фундаменталните връзки на молекулярно и атомно ниво и да се разработят нови материали с обещаващи приложни свойства. Затова и за нанотехнологиите се мисли като за „ключови технологии” на 21. век, те са нашите „билети“ за бъдещето [16].

Кои са медицински значимите нанотехнологии? Сред многобройните обещаващи области на приложение на нанотехнологиите специално място е запазено за медицината, тъй като именно натам са насочени и най-големите ни очаквания и надежди. Новите терапии за онкозаболявания вече преминават клинични изпитвания³ , а иновативните нанотранспортни системи за приложение на лекарствени продукти помагат за по-ефективно лечение с по-малко активни вещества, така че нежеланите странични ефекти да бъдат ограничени. В период на изпитване са и миниатюрни мобилни диагностични апарати за бързи тестове в лекарските кабинети, както и образни методи за диагностика на заболявания, които са по-малко стресиращи за пациентите. Иновативните покрития за импланти и новите материали в денталната технология ще подобрят поносимостта и издръжливостта, което пък ще понижи разходите за тези процедури.

Тези няколко примера за приложенията на нанотехнологиите в медицината показват огромния им потенциал.⁴ . Редица анализатори вече обявиха, че идва „промяна на парадигмата в здравеопазването“. Европейският съюз беше отделил около 100 милиона евро за проекти в областта на наномедицината за периода 2007 – 2013 г. по Седма рамкова програма, а обемът на финансиране вероятно ще се увеличи още повече в бъдеще с оглед на успеха на иРНК-ваксините. В САЩ Проектът за нововъзникващи нанотехнологии и Националният институт по рака [24] разработиха цялостни програми за финансиране на изследвания, свързани с приложението на нанотехнологиите. Политиките и в национален, и в международен план се фокусират върху научните изследвания и насърчаването на иновациите и приложенията на нанотехнологиите в медицината.

2. Наноетиката като нова биоетична дисциплина

Когато говорим за биоетика, не става дума само за насърчаване на фундаменталните изследвания и разработването на продукти, тъй като в своя Етичен кодекс за отговорни нанотехнологии и изследвания в областта на нанотехнологиите [12] ЕС изисква всички изследователски проекти да вземат предвид възможните рискове и социалните и етичните въпроси. Реалните възможности за преминаване на границите на настоящите форми на терапия повдигат и въпроса дали не са нужни нови граници. И тук се намесва практическото поле на действие на етиката (или практическата философия), която обикновено се нарича “биоетика”, с многото си подобласти.

С напредъка на развитието на нанотехнологиите в биоетиката се появява нова област на изследване и теоретизация: така наречената „наноетика“, която се занимава с ефектите от новите нанотехнологии от гледна точка на устойчивостта и с цел оценка на резултатите по отношение на благосъстоянието на обществото. Наноетичните експертни знания поставят акцент върху „интереса за общото благо“ в смисъл на подобряване на качеството на живот на общността.

За да поставим наноетикатата в по-подходящ контекст, на първо място трябва да изясним целите и задачите на биоетиката. Наноетиката е подобласт на биоетиката, а биоетиката е подобласт на оценката на технологията (OT) в областта на прилагането на биотехнологични процеси. Това важи най-вече за случаите, в които оценката на технологията е свързана с прилагането на процесите на генното инженерство в биомедицината, хранителните технологии, селското стопанство. В този контекст оценката на технологията разглежда не само етични проблеми в по-тесен смисъл, но и въпроси, свързани с надеждността и безопасността, както и с редица социални и политически аспекти на приложението на тези технологии. Такъв например е въпросът доколко социалните ефекти от дадена нова технология могат да се оценят като политически и социално приемливи. Ако един ден стане възможно да се удължи човешкият живот далеч отвъд нормалната продължителност с помощта на генното инженерство, дали това изобщо би било желателно? Не тръгваме ли по фундаментално „хлъзгав наклон“, с потенциални катастрофални последици за обществото? А ако се окаже, че имаме възможност да изкореним всички наследствени болести с помощта на генното инженерство или да оформим или оптимизираме генетичния профил на човешките същества по желание, как това би повлияло върху представите ни за човека и човечността?

С други думи, биоетиката или биоетично чувствителната оценка на технологията обхваща всички етични, правни и социални последици (съкратено ЕПСП), произтичащи от прилагането на биотехнологични процеси. И само чрез локализиране в контекста на по-широките ЕПСП на оценката на технологията, въпросите на биоетиката могат да получат адекватен отговор, така че етичната оценка да не се дава във „вакуум“, т.е., независимо от другите практически въпроси. Налице е комплекс от основни етични принципи, които възникват при всяко едно приложение на технологията, но тяхното смислено приложение в определени области (като наномедицината) не бива да се разглежда отделно от спецификата на конкретната област на технологията.

Целта на биоетиката или оценката на технологията не е да възпрепятства или дори да предотвратява появата на нови биотехнологични разработки просто защото са нови и неясни по отношение на възможните рискове, а да служи като вид „система за ранно предупреждение“, която привлича вниманието навреме към нежелани развития или възможни етично и социално чувствителни приложения на новите биотехнологични методи. Ето защо е важно биоетичната аргументация да участва от самото начало на изследванията и разработването на нови биотехнологии, поне доколкото е възможно (в смисъл на придружаващи изследвания, които да са включени в изследователския процес). По този начин не само ще могат да се предотвратят етично съмнителни разработки, но ще се избягват и ненужните разходи и ще се запази обществената репутация на биотехнологиите. В идеалния случай етичната аргументация може да допринесе за предварителната оценка още на нивото на дизайна на технологията, а не само като „последващ“ ефект [17]. Тук етичният анализ и оценка трябва да се съсредоточат основно върху: (1) целите и задачите на технологичната иновация; (2) инструментите и средствата (напр. изпитване върху животни или “на терен“); и (3) непредвидени странични ефекти (т.е. установяване на рисковия профил, напр. по отношение на възможна токсичност и следване на принципа на предпазливостта при липса на достатъчно знания).

3. Защо ни е нужна етиката при въвеждането на новите технологии?

В основата на всяка етика стои определена ценностна система. Без позоваване на ценностните определения и идеали, които са решаващи за дадено общество, не могат да се вземат обществено защитими решения за действия. Всяко отговорно действие се случва в рамките на хоризонта на легитимирани ценностни системи, които могат да бъдат използвани като аргументи за конкретно решение. Много от тези ценности са намерили място в правните разпоредби (закони и разпоредби), така че да служат на съда като нормативни критерии за решаване на правни конфликти или за отсъждане при предявяване на искове. В западната култура хуманната етика, често в съчетание с християнските ценности, служи като основа за намиране и обосноваване на решения – неин израз е и Общата декларация за правата на човека, както и демократичните права и свободи (като правото на защита срещу държавата).

Въз основа именно на аргументацията на ценностната система етиката задава въпроси като какво трябва или какво може да направи човек в дадена ситуация. Тук може да става въпрос за спазването на определени фундаментални ценностни принципи, които трябва да се спазват безусловно (без изключение) (например според “деонтологичната етика” дори т.нар. „благородни лъжи” не са позволени), или за възможни нежелани последици от определено поведение (“консеквенциалистката етика” се опитва да оцени потенциалните ефекти от всяко действие). В този контекст етиката служи предимно за разрешаване на конфликтите на ценности (което обаче невинаги е успешно или възможно) чрез рационално претегляне на аргументите за или против определено решение за действие. И накрая, в етиката често само несъзнателно валидните ценностни понятия се експлицират, така че да е възможно установяване на ценностен стандарт (или ценностен канон), спрямо който хората да се ориентират. Етиката може да е “етика на отношението” за налагане на “идеологически” ценностни нагласи, които отразяват определен образ на човека или социален идеал (“утопия”), или “етика на отговорността”, която отчита емпиричните особености на съответната ситуация за целите на действието, като подлага на оценка всички обстоятелства и възможни последствия. Все пак етиката е науката, която отговаря на въпросите за справедливостта (напр. за справедливото разпределение на оскъдни блага или възможности и награди) и за избягването на евентуална вреда (напр. за живота и тялото) или за ограничаването на свободите чрез преценка и претегляне на различни интереси, правни претенции и очаквания на отделните участниците един към друг.

Всички тези аргументи влизат в употреба при политическата аргументация на драстичните мерки за социална „изолация“ в условията на пандемията от коронавирус: правото на свобода на икономическа дейност и на придвижване се оказва в конфликт с правото на физическа неприкосновеност и защита срещу инфекциозно заболяване, които са сред най-висшите законови права и най-важните отговорности на демократичната държава. Макар в конституциите да не е заложена йерархия на основните права – например в Конституцията на Федерална република Германия – с оглед на пандемията трябваше да се вземе решение на кое основно право да се даде приоритет. В крайна сметка като етичен приоритет беше издигната защитата на здравето и живота на хората, тъй като тежкоболни или дори починали хора не могат да упражняват останалите си човешки права. Допълнителен аргумент в полза на ограничаването на други граждански свободи чрез налагане на т.нар. „затваряне“ („локдаун“) или налагането на задължение за носене на маски и спазване на карантина гласеше, че не само трябва да защитаваме правото на самозащитата на хората, но преди всичко трябва да защитим трети лица, които биха могли да бъдат неволно заразени. От друга страна, налагането на общо задължение за ваксиниране, което да се отнасят и за онези, които отказват ваксинация, е по-трудно, тъй като такова задължение би нарушило сериозно правото на самоопределение. Ето защо, етичната оценка на допустимостта на новите иРНК-ваксини засяга не само аспектите на безопасността на тези ваксини, но и взема предвид социалния контекст, в който те ще бъдат използвани: независимо дали е доброволно, или по силата на правно задължение: Как може да бъде оправдано задължението за ваксинация, ако няма достатъчно яснота нито за възможните рискове от ваксинирането, нито за дългосрочния защитен ефект на новите ваксини?

4. Наноетични проблеми: Приемане и рискове, свързани с безопасността на нанотехнологиите

Както вече беше споменато, все повече нанотехнологични методи и продукти се използват в ежедневната медицинска практика. Това се дължи главно на нарастващите приложения на генното инженерство в медицинската диагностика⁵  , терапия и профилактика; иРНК-ваксините са елемент от превантивната медицина, тъй като се използват за превенция и противодействие на епидемично заболяване. Разработването на тези ваксини не би било възможно без предварителното молекулярно-генетично изолиране и проучване на вирусния патоген, така че генното инженерство, приложено в наномащаб, се използва както при описателното секвениране на вирусната РНК, така и за разработване на ваксините (особено при положение че имунологично активната иРНК секвенция също трябва да бъде “опакована” в обвивка от нанолипидни частици, за да може безопасно и стабилно да навлезе в човешкия организъм). Следователно биоетичната перспектива към новите ваксини далеч не е достатъчна: от една страна, целият изследователски и производствен процес, а, от друга, съвкупността на ефектите от ваксинацията трябва да бъдат част от аргументацията, включително за възможните физиологични странични ефекти, както и за социалните и икономическите последици от широкото използване на ваксините, като същевременно трябва да се подчертае и какви биха били последствията от неизползването им. Етиката, свързана с приложението на технологиите, трябва винаги да се стреми да преценява и оценява рисковете, от една страна, и възможностите, от друга, на иновативните технологии (затова дисциплината е най-добре да се разглежда като подобласт на оценката на технологията, както беше предложено по-горе) .

Етичните спекти, произтичащи (1) от прилагането на иРНК-ваксините в медицинската практика в рамките на широкообхватна ваксинационна кампания, могат да бъдат разграничени от онези етичните аспекти на приложението на ваксините, произтичащи (2) от прилагането на процедурите на генното инженерство в нанотехнологичен мащаб. По-долу и двата въпроса ще бъдат разгледани по-подробно, като етичните аспекти, споменати в (2), са от особено значение в контекста на нашия проект „Нанокод“ (Nanocode).

4.1. Медицински и социално-етични аспекти на ваксинационните кампании

Дебатите и дори конфликтите в обществата, засегнати от пандемията от коронавирус, по въпроса кога и за кои групи ваксинирането с иРНК-ваксини е подходящо, не са приключили, но все пак беше постигнато някакво съгласие, че т.нар. „уязвими групи“ би следвало да се възползват от иРНК-ваксините: това се отнася особено за възрастни хора, чиято имунна система е значително отслабена, както и за хора с предшестващи заболявания, при които може да се очаква тежко (и дори фатално) протичане на болестта. Бременните жени, от друга страна, получават аргументирани съвети да не се ваксинират. Известно е също, че при хора с определени ревматични заболявания не може да се очаква кой знае какъв (или в най-добрия случай дори умерен) успех от ваксинацията. И накрая, трябва да се прецени дали може да има неблагоприятни ефекти на взаимно влияние при приложение на ваксина и прием на лекарства, които са изписани на пациента за терапия на активни или хронични заболявания. Всичко тези въпроси обаче не са от областта на етиката, а са чисто медицински или фармакологични и могат да бъдат изяснени само емпирично, както и според индивидуалния случай (т.нар. анамнеза). Следователно обичайните изисквания за клинично изпитване на всяко ново лекарство (тук влизат и ваксините) следват обичайните процедури: само след като “кандидатът” премине успешно всички клинични тестове за ефикасност и безопасност, може да получи защитено с патент разрешение за търговия за използване в медицинската практика. И в този процес може да се окаже, че едно ново лекарство получава само ограничено одобрение, ако не е ефективно или безопасно за всеки възможен пациент. Точно по тази причина клиничните изпитвания трябва винаги да се провеждат върху различни групи субекти: жени и мъже, юноши и деца, бременни, диабетици и др., за да могат да се установят всички възможни рискове. По правило такива клинични изпитвания (дори проведени върху лабораторни животни в първа предклинична фаза) продължават с години, като повечето „кандидати“ не успяват да ги преминат и разработването им бива прекратено, така че дори не достигат пазарна зрялост.

В случая с иновативната иРНК-ваксина обаче беше избрана съкратена процедура за клинично изпитване поради спешността и изключителната опасност от пандемията, като беше разрешено да не се чакат резултатите от дългосрочните изпитвания, за да не се губи време. Приложението на ваксината първоначално беше ограничено до уязвими групи и много възрастни хора, за да се натрупа достатъчно опит (т.е. данни), въз основа на които след това да бъдат направени допълнителни препоръки за ваксинация за пациенти от други възрастови групи. Такова приоритизиране или диференциране на популацията от пациенти (от всички потенциални бенефициенти) е необходимо както от медицинска, така и от етична гледна точка, за да се сведат до минимум потенциалните неблагоприятни ефекти. Но дали това важи например за юноши или дори деца – те също ли трябва да бъдат ваксинирани? Степента на защитния ефект на ваксинацията при деца и юноши или лекотата на протичане на заболяването при липса на ваксинация може да се определи само чрез емпирични изследвания. Следователно това не е етичен въпрос. Затова и може да се определи само емпирично дали при деца и юноши вероятността за тежко преболедуване и повишен риск от усложнения в случай на инфекция е достатъчно голяма, за да преодолее риска от потенциалните странични ефекти от ваксинацията (включително тежестта на симптомите при прилагането на ваксината). Може би е по-добре да оставим на „природата“ на обикновено здравата имунна система на децата и юношите да се справи сама с коронавирусната инфекция. От друга страна, децата и юношите могат да са преносители на вируса и да заразяват възрастните, така че ваксинирането на децата и юношите може поне да намали вирусния товар, така че при предаването на патогените на неваксинирани възрастни значително да се намали рискът от тежко протичане на заболяването.

От етична гледна точка трябва да се отбележи, че ваксинирането на деца и юноши с цел защита на неваксинираните възрастни (и в по-малко степен за тяхна собствена защита) е допустимо само ако възможните вредни странични ефекти от ваксинирането на деца и юноши не са по-значими, отколкото ползите за здравето, които самите деца и юноши могат да извлекат от ваксинацията. Децата и юношите не бива да се излагат на ненужни потенциални рискове само за да защитят по-ефективно неваксинираните възрастни от инфекция.⁶ . Всъщност възрастният, който отказва да бъде ваксиниран, трябва да поеме на собствена отговорност риска от инфекцията, а следователно и от потенциално тежък ход на заболяването.

Валидността на този аргумент обаче зависи от наличието на достатъчно емпирични доказателства, че ваксинирането с новите иРНК-ваксини е както достатъчно ефективно, така и безопасно по отношение на дългосрочните ефекти. Проблемът е, че това е напълно нов клас ваксини, за които медицината все още не е натрупала достатъчно опит и данни. В крайна сметка всичко зависи от клиничните изследвания, които трябва да докажат, че защитният ефект на иРНК-ваксината е висок и че (освен статистически незначимите вредни реакции на ваксината⁷ ) не се очакват късни ефекти от ваксинацията (напр. в това, че молекулите на иРНК могат да се задържат трайно върху човешкия геном, да предизвикат рак или деменция в даден момент, да влошат фертилността или да причинят трайно увреждане на имунната система). Засега изглежда обнадеждаващо, че изследователите могат да потвърдят както високата ефикасност, така и безопасността за здравето при приложението на иРНК-ваксините. В тази оценка се включват и възможни дългосрочни закъснели ефекти, тъй като все още не е открит физиологичен механизъм, който би могъл да ни даде сериозна причина за безпокойство, че иРНК молекулата не само служи на имунната система като план за производството на вирусен антиген (за да генерира след това антитела срещу него), но може и да стимулира нежелани метаболитни процеси или промени в клетъчната тъкан. Това е така, защото молекулата на иРНК очевидно нито навлиза в ядрото на клетката, нито остава в организма известно време, преди да се разгради отново, т.е. да се разпадне на своите нуклеотидни бази и по този начин да стане неефективна.

В момента е на дневен ред разгорещеният дебат относно това колко често и на какви интервали трябва да се повтаря ваксинацията, за да се осигури и увеличи защитният ефект⁸ : това отново са въпроси, на които може да се отговори само въз основа на имунологични изследвания и статистически данни и оценка на успеха на ваксинацията. От етична гледна точка може да се добави само, че трябва да се направи всичко възможно, за да се увеличи максимално защитният ефект на една иначе безвредна ваксина. Това важи и за по-нататъшното развитие на ваксината: например нейната модифицираща адаптация към нови вирусни варианти.⁹ .

Както вече беше посочено, въпросите за ефикасността и безопасността не са етични, а чисто научни. Ситуацията е малко по-различна обаче, когато решаваме дали винаги трябва да се прилага “принципът на предпазните мерки”, като се настоява безопасността на всяко ново лекарство да бъде тествана предварително. Това условие вече е въведено като част от изискването за многофазни клинични изпитвания, т.е. целият процес е подробно регламентиран във фармацевтичното законодателство. Ето защо, този аспект няма да бъде обсъждан подробно тук, а ще бъде разгледан в рамките на учебния модул „Правни и обществени аспекти“, в който ще посочим кой (и в какво отношение) следва да носи отговорност в случай на настъпило увреждане от ваксината (лекуващият лекар, производителят или здравните власти).

Въпреки това „принципът на предпазните мерки“ е свързан с казуса дали трябва да се поддържаме по-големи резерви от ваксини и дали производството на жизненоважни ваксини трябва да бъде гарантирано и защитено в рамките на националното законодателство, за да може, от една страна, да се осигури, при това контролирано, качеството на самите вещества, а, от друга страна, да се ограничи рискът от нарушения във веригите на доставка. От етична гледна точка здравните грижи, които държавата следва да полага за своето население, включват и известна степен на самодостатъчност в доставките на лекарства, така че преместването на производството в чужбина (например в Индия или в Китай) по чисто логистични и икономически причини (като например с цел спестяване на разходи) се оценява като рисково. Само в рамките на национално и по този начин относително автономно снабдяване с лекарства могат да бъдат предотвратени ситуации на недостиг, които биха могли да принудят лекарите да вземат спорни от етична гледна точка решения за „триаж“ (терминът е познат от военната медицина, където в екстремни ситуации често трябва да се вземе решение за кои ранени пациенти да се използват най-ефективно лекарствата, които не достигат, и за кои пациенти – да не се използват, така че да бъдат запазени определени количества). Това обаче се отнася не само до наличното количество високоефективни лекарства, но и до инфраструктурата за осигуряване на медицински грижи, тоест тук се включват компоненти като брой на разполагаемите легла за интензивно лечение в болниците, капацитет на медицинския и сестринския персонал, необходим за осигуряване на работата на медицинската апаратура (като вентилатори например) и за осигуряване на физически грижи за пациентите. Това обаче са общи въпроси на медицинската етика, които се отнасят до организацията на медицинските грижи и надхвърлят обхвата на етично правилното използване на иРНК-ваксините, така че няма да ги обсъждаме тук.

Друг момент засяга въпросите на справедливостта на разпределението и достъпа до новите постижения на наномедицината: например при първоначалния недостиг на иРНК-ваксини се оказа, че по-богатите страни ще получат по-лесно достъп до тях от по-бедните. Световната здравна организация (СЗО) се опита да отдели определена квота ваксини за страните от т.нар. “Трети свят”, които обаче се оказаха крайно недостатъчни. По-голямата част от производителите на новите ваксини също отказаха, по икономически причини, да позволят на по-бедните страни сами да произвеждат ваксините, без да заплащат патентни такси, т.е. да създадат свои собствени производствени съоръжения. Това също постави развиващите се страни в много неизгодно положение. Дори в началото имаше ожесточена конкуренция между по-богатите страни за закупуване на все още редките ваксини – тази ситуация беше оценена силно негативно от етична гледна точка, тъй като по-съгласуваният подход би осигурил по-справедливо разпределение. Възниква и въпросът как скъпите нанотехнологии могат да бъдат направени по-достъпни и за по-бедните бенефициенти, напр. за предотвратяване на феномена на т.нар. “второкласна медицина”.

Същевременно само емпиричните проучвания могат да ни дадат информация за ефикасността и безопасността на ваксините, базирани на иРНК. Етиката има думата в този контекст само доколкото се налага да установим по какви критерии трябва да се оцени ползата от дадена ваксина: предотвратяването на сериозно, може би дори смъртоносно заболяване със сигурност е решаващ критерий, но при условие че е изпълнен. Срещу сериозни заболявания като едра шарка и чума в миналото или зика или ебола днес съществуващите ваксини със сигурност са „средство на избор“. Появи се обаче и мнение, макар и от малцинството, че твърде масовото и твърде прибързаното ваксиниране (например и срещу сезонния грип) претоварва (и стресира) „естествената“ ни имунна система и оттам възпрепятства създаването на условия за реакция на спонтанно „излекуване“. Големите успехи на ваксинационните кампании – особено в случай на по-малко застрашаващи болести – биха могли да се окажат “Пирови победи“, тъй като сме разчитали твърде много на съвременната фармацевтика и апаратна медицина и сме пренебрегнали други (“по-меки”) начини за поддържане и подобряване на здравето. В случая с COVID-19 обаче изглежда, че няма начин да се заобиколи ваксинацията, особено след като все още липсват наистина ефективни терапевтични средства, които да ни позволят да посрещнем евентуално заболяване с известно хладнокръвие. Може да има много начини за укрепване на вродената ни имунна система (като здравословна диета, достатъчно движение и сън и начин на живот, намаляващ стреса), но срещу наистина сериозно инфекциозно заболяване вероятно само подходящата ваксинация ще помогне превантивно.

От друга страна, особено в случая с епидемията от коронавирус, може да се помисли дали епидемиите и пандемиите, причинени от зоонози, не могат да бъдат предотвратени чрез ограничаване на случаите, когато вирус (или всеки друг опасен патоген като бактерия или паразит) може да се прехвърли от животни към хора. Патогенът на COVID-19 е „зооноза“ (най-малкото може да се предполага, че вирусният патоген е неволно изпуснат от лаборатория в Китай¹⁰ ), чието разпространение вероятно е било улеснено от факта, че панголини или някои прилепи са били предлагани за консумация на пазар в Ухан. Прилепите са отлични гостоприемници за множество вируси, които могат да бъдат потенциално опасни за хората, ако им бъдат предадени. Това означава, че промяната на хранителните ни навици също може да предотврати епидемиите от сериозни инфекциозни заболявания. Идеята е, че в зоната на обмен между човешката цивилизация и природата трябва да ограничим или поне да контролираме риска от предаване на болестни патогени, доколкото е възможно. (Незаконната) търговия с диви животни например, както и новите форми на технологично интензивно управление на горите увеличават вероятността от човешки контакт с неизвестни досега патогени, тъй като се нахлува в до голяма степен недокоснати зони на дивата природа. От особен социологически интерес е и близкото домашно съжителство със селскостопански животни (като домашни птици) и често неадекватните хигиенни стандарти (например при контрола на качеството на питейната вода или на изхвърлянето на отпадъци). Човешките поселища и свързаното с тях пътно строителство навлизат все по-навътре в пустинните зони; и обратно, дивите животни (вкл. птици и насекоми) биват прогонвани от естествените си местообитания и се заселват в човешките поселища.
За да се избегне опасността от зоонозите, все по-наложително става да се изгради организация за “епидемично управление” на разнопосочните взаимоотношения между човека и природата на границата с дивата природа. Освен научното наблюдение на възможното разпространение на диви видове със зоонотичен потенциал, са необходими и правни и практически мерки, напр. в областта на заселването и развитието на инфраструктурата, икономическата експлоатация на тропическите гори, подобряването на хигиената, (ориентирано към природата) производство на храни и здравно образование. И точно тук медицинската биоетика се среща с екологичната етика. Тези въпроси обаче засягат все по-широки области и до известна степен са сред основните стимули при изграждането на стратегиите за използване на иРНК-ваксините срещу пандемията: след като пандемията избухне обаче, всички идеи за превантивни мерки срещу зоонозите са твърде закъснели, така че трябва да се опитаме, от една страна, да ограничим по-нататъшното разпространение на инфекцията, доколкото е възможно (напр. чрез носене на защитни маски, използване на защитно облекло, дезинфекция на ръце и повърхности, проветряване на закрити помещения, временна карантина и дори временно „затваряне“) и, второ, чрез широкообхватни кампании за ваксиниране. Имаме късмет, че иРНК-ваксините бяха разработени до оперативна готовност толкова удивително бързо – тази подготвеност на индустрията спаси безброй животи.

4.2. Наноетични аспекти на иРНК-ваксините като продукти на генното инженерство

След краткия преглед на медицинските и социално-етичните последици от практическото използване на новите иРНК-ваксини ще разгледаме възможните проблеми, свързани с генно-инженерния им характер, т.е. с факта, че тези агенти са, от една страна, резултат от конструктивни операции (“РНК инженерство”) в молекулярно-генетичен мащаб, а, от друга страна, се намесват в биологичните функции на клетките или в имунната система на живия организъм (т.е. на човешкия организъм). Както вече беше споменато, в тази учебна единица дебатът за наноетиката ще се ограничи до хуманната медицина, а ако стесним още повече полето ни на интерес, основният (но не и единствен) акцент ще е върху разработването на иРНК-ваксините. Всъщност всички „манипулации“ на РНК и ДНК молекули, т.е. всички конструкции на генни секвенции (а иРНК молекулата кодира специфичен шипов протеин върху обвивката на вируса COVID-19, т.е. вирусен ген) могат да се приемат за нанотехнологични. Разработването на ваксини, базирани на иРНК, е само един от случаите на приложението им, но тъй като именно в този случай възникват и етични въпроси, които се появяват и във връзка с процедурите на генното инженерство и медицинското приложение на продуктите от тях, има смисъл да се разшири фокусът на етичната аргументация, т.е. да се включи в етичната оценка целият спектър от разработки в областта на хуманната медицина, които използват методите и технологиите на генното инженерство. В конкретния случай са налице и почти всички етични въпроси, които засягат и останалите приложения на продуктите на генното инженерство в здравния сектор.¹¹ .

Спорен въпрос е дали е необходимо да се отдели “наноетиката” като специална дисциплина, тъй като тя може да се приеме и за приложение на “биоетиката“ или “генната етика”, тоест въпросите, свързани с развитието на нанобиотехнологиите, вече са известни от дебатите в други контексти в рамките на дисциплината етика. Не бива да се оценява погрешно и интердисциплинарното естество на етичната аргументация, тъй като дори (нано-)технологиите, които оценяваме като напълно различни по същността си, често се сблъскват със сходни етични и социални предизвикателства.

Използването на методите на генното инженерство за борба с (инфекциозни) болести е надеждна посока на развитие. При производството (конструирането) на иРНК-ваксини чрез методите на генното инженерство и манипулирането им при трансфера в човешкото тяло обаче възникват не само проблеми с безопасността, но и се появяват различни въпроси за социалното им приемане, доколкото генното инженерство (както като процес, така и по отношение на своите продукти) не се радва на особено добра репутация: често се твърди, че човекът се намесва в „Божието творение“, дори че „си играе на Бог“, като променя „пътя на живота/съдбата“ (което обаче едва ли е така при иРНК молекулите, тъй като те просто предоставят на човешката имунна система шаблони за собствената ѝ дейност). Дори екологичната съвместимост на генно модифицираните лекарства понякога се поставя под въпрос (въпреки че човешкият инсулин, получен чрез генно модифицирани бактерии, се приема по-лесно от диабетиците). Трудно е да се отхвърли конструкцията на иРНК молекули за борба със сериозни инфекции, тъй като предимствата им са по-силни от страховете ни. Човек трябва да е противник на технологиите като такива или поне „идеологически“ убеден враг на генното инженерство, за да не може да види и оцени ползите за здравето от точно тези приложения на генното инженерство. При селскостопанската употреба на генно модифицирани растения ситуацията е малко по-различна, тъй като безопасността и съвместимостта с околната среда при “полеви условия” все още не са ясни от гледна точка на последствията; не всички рискове и етични въпроси са докрай проучени и при репродуктивното клониране на селскостопански животни, както и при „реконструкцията“ на организми с помощта на методите на „синтетичната биология“ или „редактиране на генома“ (ще се върнем към този въпрос по-късно).

Интересното е, че при “специализираните” (произведени по поръчка) иРНК-ваксини, всъщност имаме работа с две наноструктури: от една страна, самата иРНК, т.е. активното вещество, а от друга, липидните наночастици, в които иРНК се “опакова” и впоследствие се въвежда в човешкия организъм.¹² Така нанотехнологичната процедура протича на две различни нива на конструиране в един изключително сложен процес.

Макар акцентът в настоящото изложение да е върху ваксините срещу коронавируса в различните им варианти (както и етичната оценка на разработването и приложението им), медицинските приложения на специално създадените иРНК гостоприемници не се ограничават до борбата с инфекциозни заболявания: оправдани са надеждите, че изкуствените иРНК продукти могат успешно да се използват и за създаване и приложение на иновативни методи в областта на генната терапия, при лечението на онкологични и на сърдечно-съдови заболявания.¹³ За да се намесим в генния материал на “болните” клетки прицелно с помощта на иРНК, са ни нужни подходящи процедури за вмъкване („изтриване и поставяне“). И тук влиза в действие технологията CRISPR-Cas за „редактиране на генома“. Освен това, поне индиректно, секвенциите на иРНК могат да изиграят важна роля в разработването на диагностични методи в бъдеще (например при анализ на генома, за откриване на туморни маркери и т.н.). Тези области на приложение ще бъдат разгледани по-нататък, тъй като цялостна етична оценка на иРНК нанотехнологиите може да бъде направена само ако тази техника се разглежда в по-широкия контекст на други РНК- и ДНК-базирани приложения на генното инженерство. Разширяването на обхвата на аргументацията е оправдано и от това, че иРНК технологията може да намери нови области на приложение в генната онкотерапия и в диагностика. Когато това се случи, фокусът на етичните съображения ще трябва да се разшири, за да включи етични аспекти, които не се отнасят само до използването на технологията за целите на ваксинирането – само тогава огромният потенциал на този метод ще стане ясен. Тъй като всеки етичен дебат относно социалните последици от новата технология трябва да се проведе на възможно най-ранен етап, има смисъл да се опитаме да оценим последиците в различните области на приложение на иРНК технологията още на сегашния етап. Предимството на „изпреварващата“ оценка на наноетиката е в изготвянето на „проактивно“ ориентирана технологична политика, в чиито рамки да се преценят възможните рискове или недостатъци на новата нанотехнология на ранен етап на развитие.

Очакваните медицински приложения на (базираното на РНК) генно инженерство повдигат конкретни научни (емпирични) и етични проблеми в зависимост от обхвата на приложение и степента на намеса в организма или в зависимост от целите. Вариантите и тежестта на проблемите зависят, например, от нивото на изграждане, достигнато чрез манипулиране на онези молекулни структури или организми, които са предназначени да произвеждат фармакологично ценни протеини (напр. при бактериалното производство на човешки инсулин) или да функционират като “носители” (вектори) за въвеждане на терапевтични средства в човешкото тяло. Дори генетичните медицински процедури обаче, които вече се прилагат в наномащаб с диагностични цели, ни дават данни, които са стриктно лични (напр. генни данни за конкретен човек, които го правят частично „генно видим“) и с които може да се злоупотреби (напр. от страна на застрахователните компании, ако събраните данни насочват към бъдещи заболявания на индивида, които се дължат на определени генетични предразположения; от държавните органи за идентификация на определени лица, която не е нужна за целите на правоприлагането). Затова трябва да се въведат подходящи предпазни мерки съгласно Закона за защита на (личните) данни: напр. чрез приложение на процедури за анонимизиране или поне псевдонимизиране на данните (както и поставяне на високи бариери за достъп или осигуряване на условия за защита на данните за ограничен период от време). Използването на генетични данни, например за епидемиологични цели, не трябва да се извършва без изричното съгласие на донора на данни (т.нар. „информирано съгласие“) (това се отнася и за колекции от клинични тъкани или изследователски биобанки, в които се съхраняват и оценяват генетично значими тъканни проби).

В този контекст развитието на иРНК технологиите трябва да се разглежда в по-широкия контекст на разработването на молекулярно-генетични инструменти, които са или ще станат ефективни в наномащаб:

(а) за диагностични цели (напр. при геномен анализ за откриване на предразположения към наследствени заболявания);

(б) за терапевтични цели (напр. при генна терапия с интерференция на соматична или зародишна линия);

(в) за имунологични цели (напр. при конструирането на иРНК последователности, които са “манипулирани” за борба със специфични патогени);

(г) за биоконструктивни цели, когато целта е да се проектират цели организми (едноклетъчни организми) така, че да могат да бъдат използвани за производството на диагностично или терапевтично ефективни лекарства (напр. чрез „редактиране на генома“ в полето на “синтетичната биология”, за да се включат например нови метаболитни пътища в даден организъм; възможно е и създаването на изцяло нов жив организъм с нуклеинови бази в своята ДНК или РНК, които не се срещат в природата).

За съжаление, не е възможно в рамките на ограничения обем на този материал да представим всички области на приложение на генното инженерство в медицината. Затова в заключение ще разгледаме само векторите, с помощта на които иРНК ваксините се въвеждат в човешкия организъм. Тези транспортни системи представляват второто приложение на нанотехнологични методи за целите на противодействието на COVID-19.

5. Наносистеми: функции и рискове

Безопасното транспортиране на иРНК агента в човешката имунна система е от решаващо значение за успеха на ваксинацията, така че първо ще разгледаме този аспект. Вече беше споменато, че активната съставка на иРНК трябва да бъде “опакована” в обвивка от липидни наночастици, за да може да навлезе достатъчно стабилно в човешката имунна система, за да послужи като матрица (антиген) за производството на на антитела срещу COVID-19. И това е само един пример за многото т.нар. “системи за доставка” в наномащаб, които изпълняват различни транспортни функции.

Наноматериалите се използват по различни начини в човешкото тяло. Две от обещаващите области на приложение ще бъдат представени в следващия раздел. Първо ще бъдат разгледани различните нанотранспортни системи („наносистеми за доставка“), които разпределят активните вещества в тялото. От друга страна, различни метални наночастици се използват в терапията на рак, където променливите магнитни полета позволяват нагряване и унищожаване на туморните клетки (при т.нар. хипертермия). Тук ще разгледаме по-подробно само първия случай.

Наномащабните системи се използват за транспортиране на активни съставки в тялото (например на лекарства). Наноматериалите обхващат активното вещество с малки защитни обвивки, които се определят като капсулирани системи или мицели. Те позволяват активните вещества да бъдат защитени или прикрити чрез биологична мимикрия [6], така че да могат да бъдат транспортирани до специфичните места на приложение. В зависимост от структурата си те могат да преодолеят биологичните бариери като клетъчните стени, стените на чревния тракт или кръвно-мозъчната бариера [19]. Точно кръвно-мозъчната бариера е тази, която до момента пречи на фармацевтичните методи за ефективно лечение на заболявания като болестта на Алцхаймер, което обяснява и големите надежди, възлагани на наноматериалите. В зависимост от целта и желаното място на приложение нанотранспортните системи изпълняват различни задачи: например могат да „обгръщат” слабо водоразтворими или мастноразтворими витамини и активни съставки [2], за да ги направят по-лесно достъпни за използване от организма.

Други процеси позволяват освобождаването на активни съставки да бъде насрочено за определено време или веществата, които биха се усвоили твърде бързо в тялото, да бъдат освободени само в подходящото място на приложение или да бъдат равномерно разпределени в рамките на дълъг период от време. Съществува цял набор от системи за капсулиране, които намират приложение в козметиката, в производство на нови фармацевтични продукти или контрастни вещества. Много системи използват естествени материали, които лесно се разграждат в тялото, но наноформата им дава повече стабилност или ги прави по-лесно усвоими от тялото, например малки мастни капчици (нанолипидни структури), естествени протеинови съединения като тези, които могат да бъдат получени от екстракти от миди (хитозан) или желатин. Много системи копират природата, например разградимите полилактоглюконати (съединения протеин-захар) или дендримерите (подобни на дърво полимерни структури), които се използват в терапии на онкозаболявания, херпесни и гъбични заболявания.

Някои системи работят с елементи като въглерод. Те образуват неразградими структури, подобни на футболна топка с наноразмер (фулерени) или малки въглеродни нанотръби, в които активните вещества могат да се транспортират [7, 22]. Друга стъпка в развитието, върху която работят изследователите, са системи за прицелно доставяне, оборудвани със специфични рецептори за типове клетки, вируси или други патогени, за да „разпознаят“ целевото място в организма [30, 13]. Това би гарантирало, че активните вещества действат на подходящото място, напр. в органи като черния дроб или в специфични туморни клетки, но не и в други части на тялото. Обикновено се използват моноклонални антитела, които се прикрепят към туморните клетки. Общото между различните видове системи за доставяне е, че подобреното или по-целенасоченото усвояване може значително да намали количеството лекарство и нежеланите странични ефекти [1].

Обществените ползи от наносистемите за доставяне на лекарства са свързани с по-ефективни медицински терапии и повишено качество на живот на пациентите [11]. Други ползи включват потенциалното намаляване на разходите за здравеопазване, а оттам и възможни положителни ефекти върху икономиката. По-долу обобщаваме различните опити за количествено определяне на тези ползи.

На първо място са терапиите за лечение на онкозаболявания, които са една от водещите причини за смърт в световен мащаб – близо 7,6 милиона смъртни случая през 2005 г. В индустриализираните нации ракът е втората водеща причина за смърт. СЗО прогнозира, че смъртните случаи, свързани с онкозаболявания, ще нараснат до 9 милиона през 2015 г. и до 11,4 милиона до 2030 г. [32]. Всеки терапевтичен напредък може да означава спиране или забавяне във времето на развитието на заболяването за милиони страдащи, а по-голямата ефективност на методите на лечение може потенциално да доведе до намаляване на разходите за здравеопазване.

Авторите на доклада „Нанотехнологии за здраве: възможности и рискове“, публикуван през 2004 г. по поръчка на Министерството на образованието и научните изследвания на Федерална република Германия [3], цитират американски проучвания [14], които, като се позовават на вирусни карциноми, изчисляват възможното намаляване на разходите вследствие на използването на наноматериали, тъй като по-слабите странични ефекти изискват и по-малко последващи лечения. Това важи най-вече за по-възрастните пациенти с по-висока чувствителност към страничните ефекти. Докладът обаче съдържа предупреждение, че към предвижданията за потенциално намаляване на разходите трябва да се отнасяме предпазливо поради липсата на подходяща база за сравнение на различните методи на лечение и здравни системи, както и възможните тенденции при цените на лекарствата и процедурите [3].

Нежеланите странични ефекти са сериозен проблем. В САЩ например те са отговорни за приблизително 100 000 смъртни случая в рамките на една година, тоест страничните ефекти от терапиите са десетата най-честа причина за смърт [33].

Повечето количествени оценки за ползите от наноматериалите във фармацевтичната индустрия са свързани с прогнозите за растеж на пазара. В един момент се прогнозираше увеличение от около 50% годишно в периода от 2005 до 2012 г. В същото време се очаква постоянно нарастващ дял на нанотехнологиите в общия фармацевтичен пазар. Прогнозата за пазарен обем от 4,8 милиарда щатски долара през 2012 г. е оптимистичната оценка на пазарния потенциал на нанотехнологиите в тази област [23]. Остава обаче открит въпросът дали високите цифри на растежа са свързани с високите цени на лекарствата, което реално би намалило част от икономиите на разходи в здравеопазването.

Не може да се направи обща оценка на риска при наносистемите за доставка с оглед на широкия набор от приложения и използвани материали. Изявленията относно опасността или безопасността на наноматериалите винаги са свързани с казуистика. Трябва да се вземат предвид не само формите на използваните наноматериали, но и възможните процеси на свързване или разлагане (агломерация и деагломерация) [4].

В медицината се прилагат специфични тестове за безопасност, преди даден продукт да бъде одобрен. Това се отнася и за продукти, съдържащи наноматериали като активни съставки или като ексципиенти, както и за подобни медицински изделия. Под активни съставки се разбират естествени или синтетично произведени химични елементи, техните съединения и смеси или разтвори, които имат фармакологичен ефект. Те трябва да бъдат тествани в предклинични изпитвания, за да се определи дали имат дългосрочен токсичен ефект върху животни или хора (остра и хронична токсичност), дали причиняват онкозаболявания (канцерогенност), дали засягат генетичния материал (мутагенност), дали имат отрицателни ефекти върху неродените деца (тератогенност). По правило се изисква и допълнителна оценка на риска за въздействие върху околната среда. Помощни са онези вещества, които са необходими, за да придадат на лекарството определена форма, да го направят трайно, да го ароматизират, да го оцветят, т.е. да го подобрят с оглед на употребата му. Фармацевтичната асоциация Interpharma изброява нишесте, захар, желатин, мазнини, масла, вода и алкохоли като примери за ексципиенти [20].

В зависимост от контекста на приложение наноматериалите могат да попаднат както в активните вещества, така и в ексципиентите, ако се използват само като транспортна система. Германският Закон за лекарствата (AMG; 14-то изменение и допълнение) и Наредбата за прилагане на добри клинични практики при провеждане на клинични изпитвания на лекарствени продукти за хуманна употреба (Наредба GCP) определят степента, в която да се извършват тестове за безопасност за активни вещества и помощни вещества. Това се отнася до процедурите за консултация и клиничните изпитвания преди одобрението, самите процедури за одобрение и текущото наблюдение и докладване (фармакологична бдителност) след одобрението, което документира появата на странични ефекти. В процедурите са предвидени консултации от комисиите по етика, които трябва да одобрят клиничните изпитвания.

В момента в експертните среди се дебатира доколко наноматериалите като транспортни системи са достатъчно тествани чрез процедури за одобрение на ексципиенти. От 2002 г. обаче е в сила т.нар. Известие за разрешение за търговия съгласно раздел 21 от германския Закон за лекарствата, което изисква информация за бионаличността и биоеквивалентността на лекарствата. Подобрената бионаличност в резултат на използването на наноматериали в ексципиентите трябва да бъде посочена в новите одобрения, дори ако действащите формули бъдат модифицирани.

Научните статии, в които се разглеждат системите за доставяне на лекарства, обикновено включват подробни описания на функциите и ползите, но само няколко препратки към възможните рискове. Прави се разграничение между разградими и неразградими системи за доставяне. Повечето експерти приемат, че разградимите транспортни наносистеми като гореописаните мазнини, протеини или захарни съединения се обработват от тялото по същия начин като по-големите съединения и не представляват наноспецифичен риск [7]. Изразените опасения са свързани с възможно предозиране и ефектите на увличане на токсични вещества от околната среда, които биха могли да попаднат в организма със системите за доставяне на лекарства на принципа на контрацепцията. Все пак това са въпроси, които трябва да получат емпиричен отговор и които имат само косвено значение за етичната оценка.

Неразградимите (устойчиви) наноматериали се оценяват като много по-проблемни. Различни проучвания показват отрицателните ефекти върху здравето, например при фулерените [26] и въглеродните нанотръби, за които не се препоръчва да се използват в транспортните системи в медицината [34]. Последните проучвания върху нанотръбите обаче показват, че оценката на риска е силно зависима от избраната форма и приложение и може да се извършва само спрямо всеки отделен случай. Въпроси относно рисковете за околната среда възникват и по отношение на неразградимите, устойчиви наноматериали, дори и да са безвредни за хората. Трябва да се проучи как се държат те след попадането им в околната среда, т.е. какви въздействия могат да имат върху водата, почвата и въздуха. Изследванията тук обаче