Наноматериали в проектирането и прилагането на методи за
откриване на SARS-CoV-2

Резюме

В борбата с настоящата пандемия от COVID-19, наноматериалите могат да бъдат отлични кандидати срещу вирусни инфекции, особено срещу коронавирусни. Това се дължи на възможността им лесно да пенетрират клетката, да взаимодействат с вирусите и да инхибират възпроизвеждането на вирусния геном. В допълнение, използването на наночастици позволява детектиране на инфекциозни агенти в малки обеми проби. Те представляват чувствителна, прецизна и бърза форма за откриване на инфекциозни частици, при това с по-малко разходи от сега използваните технологии. Този напредък в ранната детекция позволява точно и бързо лечение.

Ключови думи/фрази: наноматериали, COVID-19, детекция

1. Въведение

Продължаващата експлозивно разпространени на новата коронавирусна болест COVID-19 привлича внимание в световен мащаб поради удължения си инкубационен период и значителна инфекциозност. Бързото разпространение на пандемията в световен мащаб, инициирано от SARS-CoV-2, създаде належаща необходимост от диагностика и лечение на заболяването. В резултат на това много изследователи се стремят да намерят най-ефективните и подходящи методи за детекция и лечение на SARS-CoV-2. Полимеразната верижна реакция с обратна транскриптаза в реално време (RT-PCR) в момента се използва като един от най-надеждните подходи за откриване на новия вирус. Този процес обаче отнема време, трудоемък е и изисква обучен лабораторен персонал. Освен това, въпреки високата специфичност, са документирани фалшиво-отрицателни резултати, особено от неназофарингеални проби, които могат да имат по-ниско вирусно натоварване. Следователно, разработването и използването на по-бързи и по-надеждни методи изглежда има изключително значение. През последните години бяха направени много опити за производство на различни биосензори на базата на наноматериали, с цел детекция на вируси и бактерии в клинични проби [27, 46].

За да се справим със съществуващите и предстоящите глобални заплахи за здравето на човека е необходимо използването надежден начин за диагностициране на коронавирусното заболяване COVID-19. Наночастиците предлагат едно удачно приложение и значителни перспективи да функционират като платформа за бързо диагностициране на вирусна инфекция с висока чувствителност. За детекцията на SARS-CoV 2 могат да бъдат използвани златни наночастици, магнитни наночастици и графен (G). Прилагат се в молекулярната диагностика и в серологични подходи. Наночастиците съкращават времето, необходимо за диагностика. Те могат да бъдат приложени в малки устройства, които насърчават самодиагностицирането у дома или на места като летища и магазини. Методи, базирани на наночастици, могат да бъдат използвани за анализ на контаминирани с вируси проби от пациент, повърхност и въздух [1].

2. Съвременни методи за детекция на SARS-CoV-2

Конвенционални методи за откриване на SARS-CoV-2 са полимеразната верижна реакция с обратна транскрипция (RT-PCR), компютърната томография (CT) и секвенирането от следващо поколение (NGS) [1, 26, 40] (Фиг. 1). Типичните диагностични техники за откриване на COVID-19 са RT-PCR и CT на гръдния кош. В процес на разработка са и други диагностични методи, като CRISPR, SHERLOCK, RT-LAMP, ELISA и секвениране. Те могат да подобрят точността и да сведат до минимум времето за детекция на вируса [1, 9]. RT-PCR е признат като водещия и най-ефективен метод за коронавирусна детекция [1, 26].

Фигура 1. Конвенционални методи, използвани за детекцията на SARS-CoV-2. (A) Полимеразна верижна реакция с ензима обратна транскриптаза (RT-PCR). кДНК, комплементарна ДНК. (B) Компютърна томография. (C) ELISA анализ.

2.1. 2.1. Полимеразна верижна реакция с ензима обратна транскриптаза (RT-PCR)

RT-PCR се използва широко за детекцията на COVID-19. Базира се на синтеза на кДНК от геномна РНК, последвано от амплификация [26, 38]. Амплификацията на минимални количества вирусен генетичен материал в смес с други нуклеинови киселини се извършва ефективно чрез RT-PCR. Понастоящем тази техника е златният стандарт за откриване на SARS-CoV-2 в проби, взети от горните дихателни пътища. В няколко проучвания са използвани проби от серум, очи и изпражнения за осъществяване на RT-PCR-базирана детекция. Друг метод използва самостоятелно взети проби от слюнка като една неинвазивна и сигурна техника за медицинския персонал преди извършване на RT-PCR. При този метод, обратната транскриптаза първо превръща вирусния РНК геном в ДНК, като използва къса последователност от нуклеотиди – праймер и генерира комплементарна ДНК (кДНК). След това чрез флуоресцентно багрило или флуоресцентно белязана специфична последователност от ДНК се проследява амплификацията на ДНК в реално време. И накрая, чрез флуоресцентен или електрически сигнал се детектира вирусната кДНК след няколко последователни амплификационни цикъла [1, 9, 22].

Конвенционалните RT-PCR анализи включват едноетапни или двуетапни подходи. Едноетапните методи използват една епруветка, съдържаща както компонентите за обратната транскрипсция, така и за амплификацията. Двуетапната процедура разделя двата процеса. Тя осигурява по-предпазливи и гъвкави условия за работа. Също така, при този метод кДНК може да бъде съхранена за количествено определяне на различни цели с по-малко изходни материали. Въпреки това, стандартният метод за откриване на SARS-CoV-2 е едноетапният подход, тъй като е по-бърз, изисква по-малко манипулиране на пробите, намалява времето за анализ и намалява грешките при пипетиране [9, 43].

Детектирането, базирано на RT-PCR, също е свързано с фалшиво-отрицателни резултати, което може да се дължи на нисък вирусен товар в гърлото на пациентите, неправилно боравене с РНК пробите или липса на достатъчно вътрешни контроли [8, 9, 16]. Основният проблем на RT-PCR е неговата ниска чувствителност към анализиране състоянието на белите дробове. Друга пречка е ниската чувствителност при анализ на кръвни проби поради малките количества вирус в кръвта [26].

2.2. Компютърна томография (CT)

AДруг метод за детектиране и справяне със заболяването COVID-19 е компютърната томография на гръдния кош. При нея се използва рентгеново изображение на гръдния кош на пациента под различни ъгли. Според радиологичните доклади, всички необичайни характеристики на изображението от компютърната томография може да се дължат на заразяване с COVID-19. Типично наблюдаваните характеристики при сканиране на гръдния кош на пациент с COVID-19 са изменения, наречени „непрозрачност тип матово стъкло“ (GGO), особено на периферните и долните лобове, консолидации (повишаване на непрозрачността на паренхима, което води до покриване на подлежащите съдове), промени тип „crazy-paving“ (GGO с интралобуларно и интерлобуларно септално удебеляване) и линейни непрозрачности. CT с висока разделителна способност може да помогне при детектиране на GGO в ранните етапи на инфекцията [9, 26, 40].

CT чувствителността е по-висока при пациенти с положителен RT-PCR (86–97% в различни проучвания) и по-ниска при пациенти с общи и нереспираторни симптоми (около 50%). Ултразвукът също се използва като диагностичен инструмент в малък брой случаи. Ултразвукът има много ниска специфичност и въпреки че се влияе от заболяването, теглото на пациента и сръчността на оператора, чувствителността при този метод се оценява на около 75%. Въпреки това, ултразвукът може да играе роля в наблюдение на напредването на заболяването чрез детекция на характеристики на интерстициална белодробна болест [26].

2.3. SHERLOCK

В допълнение към RT-PCR и CT, за детекцията на SARS-CoV-2 са разработени и други техники. Както е описано от Gupta et al., SHERLOCK е разработен от Zhang et al. [45] „за детектиране на РНК фрагменти на SARS-CoV-2 с концентрация 10–100 копия/μl. Основният принцип на SHERLOCK- базираната диагностика е детектиране, базирано на CRISPR. Този тест може да бъде извършен за < 60 минути, без необходимост от специфични инструменти. Те избират два целеви гена, S гена и Orf1ab гена, от генома на SARS-CoV-2. За да се сведе до минимум кръстосаната реактивност с други респираторни вирусни геноми, те избират и специфични насочващи секвенции.“ [9].

2.4. RT-LAMP

Оптимизираният метод за детекция, базиран на RT-LAMP, има по-голяма чувствителност от традиционните RT-PCR методи и изисква по-малко време (фиг. 2). В резултат на това този процес може да се използва за бързо диагностициране на коронавирусни заболявания и увеличаване на капацитета за тестване с 2–2,5 пъти [9, 13].

Фигура 2. . Сравнение на работния процес при RT-LAMP и qRT-PCR анализи при спешни случаи (амбулаторни пациенти) и болнични пациенти. RT-LAMP анализа е 2–2,5 пъти по-бърз от qRT-PCR анализите и пробата може да бъде транспортираа при стайна температура

Gupta et al. обобщават настоящите техники за детекция на инфекция от SARS-CoV-2 във Фиг. 3 [9].

Фигура 3. Техники, използвани за детекция на тежък остър респираторен синдром коронавирус 2 (SARS-CoV-2).

3. 3. Наноматериали за детекция на SARS-CoV-2

Настоящият метод за детекция на COVID-19 инфекция е тестване на нуклеинова киселина чрез полимеразна верижна реакция и обратна транскрипция (RT-PCR). Въпреки че RT-PCR се използва широко за откриване на COVID-19, при този метод има няколко проблема [3, 14, 29, 35].

1. Фалшиво-отрицателни резултати;
2. Отнема много време;
3. RT-PCR не е способен да детектира асимптомни пациенти, тъй като е необходимо присъствие на SARS-CoV-2 в събраните проби;
4. Слаба аналитична чувствителност;
5. Трудоемък;
6. Здравните центрове в извънградски условия нямат адекватна PCR инфраструктура, която да поеме големи количества проби;
7. Скъп;
8. Наличието на RT-PCR китове и реагенти не може да отговори на нарасналото търсене.

Настоящата ситуация изисква разработване на техники за детекция, които са бързи, рентабилни и лесни за работа. За да се преодолеят ограниченията на традиционните методи, е необходим подобрен мултидисциплинарен подход. Технологичните решения, базирани на наноматериали, предоставят различни възможности за борба с вируса [10, 32].

3.1. Свойства на наноматериалите

Уникалните характеристики на наночастиците играят решаваща роля в справянето с пандемията и смекчаването на бъдещи епидемии. Наночастиците показват отличителни свойства като:

• малък размер;
• разтворимост;
• мултифункционалност;
• възможност да се насочват към желана цел;
• реагиращи на стимул;
• голяма повърхностна площ;
• повърхностна адаптивност

Поради това те се използват широко за приложения в различни области като аналитична химия, фармация, като сензори/биосензори, в биотехнологиите, наномедицината, за доставяне на лекарства, за биологична детекция, трансфер на гени, в оптиката, при заздравяване на рани, намират енергийни, селскостопански и екологични приложения. Наночастиците подобряват тези приложения, като предоставят повишена производителност със значителна перспектива за внедряване в миниатюрна техника, включително преносима електроника. Следователно, те показват огромен потенциал за подобряване на качеството на живот чрез регулиране на вирусното разпространение чрез навременна детекция. Наночастиците имат поне една размерност в нанометровия диапазон (1 nm =10-9) (Фиг. 4) [1, 15, 30, 36].

Фигура 4. Скала на наночастиците с някои примери.

Високото съотношение повърхност към обем на наночастиците, високата адсорбция, квантовите ефекти и високата реактивоспособност позволяват ефективно взаимодействие с аналитите на пробата. Освен това, те имат изключителни мултиплекс способности, което ги прави подходящи за включване в най-съвременните технологии за детекция на вируси. Наночастиците предлагат и лесна повърхностна функционализация, което предполага, че множество лиганди могат да бъдат прикрепени чрез ковалентни или нековалентни връзки. Това допълнително подобрява селективността и намалява времето за детекция. В допълнение, наноматериалите могат да се използват и като маркери за увеличаване на детектирания сигнал, което помага за детектиране на сигнали с много нисък магнитут [32].

3.2. Категории наноматериали

Създадени са различни наноматериали за детекция и проследяване на вируси, като [11]:

• Метални наночастици, например златни наночастици (Au NPs), сребърни наночастици (Ag NPs);
• Наночастици от метален оксид, например магнитни наночастици от железен оксид (Fe3O4 NPs);
• Въглеродни наноматериали, включително 0-измерни (0D, например фулерени (C60), въглеродни точки (C-точки)), 1D (въглеродни нанотръби (CNTs), 2D (например графен (G), графенов оксид (GO), и 3D (например графит);
• Квантови точки (KT): CdS KT, CdTe KT, въглеродни KT;
• Порести материали: метало–органични рамки (MOFs), ковалентни органични рамки (COFs);
• Полимери: естествени полимери (например хитозан, целулоза), и синтетични (например политиофен, полипирол);
• Липидни наночастици (LNPs): триглицериди, мастни киселини, стероиди и восъци

Фигура 5..Схема, показваща различни примери за CoV детекция чрез методи, базирани на наноматериали. (a) Флуоресцентни Zr KT и магнитни наночастици се свързват с антитела, които свързват специфично CoV. При наличие на CoV се формира магнитен флуоресцентен комплекс. Той бива магнитно изолиран и детектиран чрез флуоресцентни измервания. (b) Нанокапаните се използват за концентриране на CoV и подобряване на неговата стабилност, като по този начин се улеснява детекция му. (c) PCR с обратна транскрипция при наличието на наночастици подобрява ефективността на полимеразната верижна реакция, подобрявайки чувствителността на този метод. (d) Метод за детекция на CoV, базиран на взаимодействието между комплементарна ДНК от CoV и acpnPNA сонда на повърхността на Ag NP. Това взаимодействие води до разделяне на Ag NP и получаване на жълт цвят, асоцииран с луминесценция на добре диспергирани Ag NP, допълнително разкриващи присъствието на CoV.

Фигура 6. Различни наночастици.

Наноматериалите могат да бъдат използвани за различни цели при COVID-19. Rasmi et all обобщават функциите и основната роля на наноматериалите в таблицата по-долу (Фиг. 7) [30].

Фигура 7. Обобщение на ролята на наноматериалите при COVID-19.

3.2.1. Златни NPs (Au NPs)

Златните наночастици (AuNP) се използват все повече в платформите за откриване на SARS-CoV-2 поради техните забележителни оптични свойства, като повишени коефициенти на екстинкция и регулируем локализиран повърхностен плазмонен резонанс (LSPR), позволяващ различно цветно отчитане с просто оборудване или с невъоръжено око. За откриване на антитела срещу SARS-CoV-2 (IgG, IgM или IgA) са предложени анализи на базата на AuNP и флуоресцентни наночастици [17].

Златните наночастици (AuNP) са един от най-често използваните наноматериали за бърза диагностика. Златната наночастица са използва за детекция на двойноверижна ДНК (двДНК) на таргетни вируси. По-конкретно, едноверижна ДНК (евДНК) или едноверижна РНК може да взаимодейства с цитратни йони на повърхността на AuNP. Добавянето на сол към разтвора може да стабилизира частиците и да промени цвета. Прилага се и прост колориметричен хибридизационен анализ за детектиране на двДНК, получена от евРНК на SARS-CoV. Този анализ може да свърже целта при 4,3 nM за 10 минути, без да е необходимо никакво устройство [18, 30].

Подход при който се променя цвета

Друг анализ предоставя метод за визуално откриване на вируса на COVID-19, без необходимостта от сложни инструменти. Проектирана е колориметрична детекция с помощта на AuNPs, покрити с тиол-модифицирани антисенс олигонуклеотиди (ASOs). Тиол-модифицираните ASO-cap AuNP селективно агрегират в присъствието на таргетната РНК последователност на SARS-CoV-2 и променят повърхностния плазмонен резонанс. Резултатът може да бъде наблюдаван след 10 минути при детекционна граница от 0,18 ng/μL [23, 30].

Фигура 8: Схема на селективна детекция с невъоръжено око на SARS-CoV-2 РНК, опосредствана от подходящо проектирани ASO-cap AuNP

Разработен е ефективен метод за детекция на COVID-19 чрез имобилизиране на белтъци върху повърхността на Au с помощта на Au-свързващи полипептиди. Чрез зелен флуоресцентен белтък, SARS-CoV-E белтъка и стрептавидин от Streptomyces avidinii имобилизират Au-свързващ полипептиден фузионен белтък върху AuNP. Тези комплекси взаимодействат с антитялото, което води до абсорбция и промяна на цвета [25, 30].

 Неинвазивен подход

ThПредложен е неинвазивен подход за детекция на COVID-19, използващ издишан въздух и AuNP-базиран сензор. Сензорът се състои от различни AuNP, прикрепени към органични лиганди и филм от неорганичен наноматериал. Неорганичният филм има електрическа проводимост. Следователно, когато е изложен на летливите органични съединения (ЛОС) от издишания дъх, органичният филм реагира с ЛОС, което води до подуване или свиване на неорганичния филм и промяна в електрическата проводимост. Следователно, този неинвазивен сензор може потенциално да се използва за бърз скрининг на COVID-19 [30, 32].

Подход с електрохимична хибридизация

Открит е AuNP-базиран електрохимичен хибридизационен метод, използващ генен сензор, състоящ се от тиолирана ДНК сонда, имобилизирана върху AuNPs въглероден електрод. Сондата хибридизира биотинилирана таргетна ДНК. Електрохимичен чип се свързва чрез въглеродния електрод, съставен от AuNP масив. Коронавирусният белтък се свързва върху AuNP-електрод и коронавирусният белтък и свободните вируси се конкурират за място на свързване при наличието на антитела. Има отлични линейни резултати на сензорен отговор и концентрация на коронавирус, вариращи от 0,001 до 100 ng mL−1. Анализът достига детекционна граница от 1,0 pg mL-1. Методът е едноетапен, чувствителен и прецизен (Фиг. 9) [17, 30].

Фигура 9. CоV имуносензорен чип (a), етапи на произвеждане на имуносензора (b), детекционния процес на конкурентния имуносензор за вируса (c).

Имунохроматографски подход

Чрез подхода на индиректната имунохроматография е предложен латерален поточен анализ за бърза детекция на IgM срещу COVID-19. Върху аналитична мембрана са разположени нуклеопротеинът SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2 НП) и античовешки IgM, конюгиран със AuNP, работещ като детекционен репортер. AuNP-ЛП анализа показа забележителна селективност при детекцията на IgM без интерференция от други вируси. Всеки анализ се нуждае само от 10–20 μL серум и резултат може да бъде получен в рамките на 15 минути [12, 30].

3.2.2. Квантови точки (КТ)

Квантовите точки (КТ) са още един механизъм, чрез който може да се борим с вируса COVID-19. Квантовите точки (КТ), известни също като „полупроводникови наноматериали“, играят жизненоважна роля в детектирането на COVID-19. КТ са признати като нова флуоресцентна сонда за молекулярна детекция. Размерът на КТ варира от 1 до 10 nm. Изключителните характеристики на КТ, включително страхотните им оптични и полупроводникови свойства, фотостабилност, висок квантов добив и тесен емисионен спектър, ги правят сериозен кандидат като флуоресцентни маркери. Поради тези изключителни свойства KT могат да се считат за чудесно средство за борба с вирусни инфекции. Освен това, чрез инкорпорирането на биосъвместими носители може да се осъществи интердисциплинарното проучване, което да позволи клинични подходи при борбата с вируса. Благодарение на техните превъзходни свойства, KT в момента са доминиращи сонди (хемосензори и биосензори) [21, 30].

Фигура 10. Описание на механизма на действие на AuNP-ЛП ленти.

КТ се използват поради тяхната проследимост под светлина с определена дължина на вълната. В допълнение, КТ могат да бъдат моделирани в желания размер (1–10 nm) и форма, която ефективно се насочва/прониква в SARS-CoV-2, с размери между 60 и 140 nm. Освен това положителният повърхностен заряд на КТ на основата на въглерод може да се използва за изолиране/деактивиране на S-белтъка на SARS-CoV-2. В допълнение, катионните повърхностни заряди на КТ, взаимодействат с отрицателната РНК верига на вируса, насочвайки към производството на реактивоспособни кислородни видове в SARS-CoV-2 [21].

Създаден е чип, базиран на КТ-конюгиран РНК аптамер, за чувствителна и бърза детекция на SARS-CoV N-белтък с граница на детекция от 0,1 pg mL−1. КТ-конюгираният РНК аптамер може да се свърже с SARS-CoV N-белтъка, имобилизиран върху чипа, създавайки оптичен сигнал. Използването на флуоресцентни КТ може да помогне на изследователите при проектирането на лесен, чувствителен и бърз диагностичен инструмент за COVID-19 [30, 31].

Фигура 11. Схема на действието на КТ върху SARS-CoV-2. КТ, квантова точка; S-белтък, шипчест белтък; SARS-CoV-2, тежък остър респираторен синдром коронавирус тип 2

Въглеродни квантови точки

Въглеродните квантови точки (CКТ) могат да се използват като биосензори за микроорганизми, биомолекули и инфекции. В допълнение, те могат да се използват в биосъвместими системи за инактивиране на патогенни човешки коронавирусни инфекции като доминантни сонди за визуализация (хемосензори и биосензори) с антивирусна активност. CКТ имат размери около 10 nm и могат да се разтварят добре във вода. Те се синтезират чрез хидротермална карбонизация на въглеродни прекурсори. Някои иновативни подходи за детектиране на коронавируси са фокусирани върху прилагането на CКТ. При един от методите антивирусната активност на седем вида CКТ е използвана за лечение на човешки коронавирусни инфекции. Използвани са различни видове CКТ, получени чрез хидротермална карбонизация и конюгиране на боронова киселина. Описано е, че инхибирането на вируса вероятно се дължи на обмена на химични групи между CКТ и рецепторите на вируса [10].

Циркониеви квантови точки (Zr КТ)

Цирконият, благодарение на свойства като механична стабилност, термична устойчивост и улавяне на UV светлина, се използва в много биомедицински направления. Освен това, наноразмерът на Zr има уникални физични и химични аспекти, дължащи се на голямата му повърхностна площ и електронни състояния [10].

Като цяло използването на КТ срещу коронавируса е един от най-подходящите избори поради изключителната му медицинска ефективност. Освен това, КТ могат да се използват като стабилна сонда за визуализация и сензор в диагностиката и прогнозирането. В допълнение, повърхността на КТ може да бъде покрита с лекарства за таргетиране на COVID-19. Въпреки това, те трябва да бъдат прилагани внимателно, за да бъдат избегнати бъбречна инфилтрация и допълнителни странични последици.

3.2.3. Въглеродни наноматериали

Въглеродните материали са функционални във всеки аспект от нашето ежедневие, защото те са многобройни и леки тъкани, които могат да бъдат използвани в множество приложения. Базираните на въглерод наноматериали могат да бъдат категоризирани въз основа на техните размерности (D) като например нула измерни (0D) (въглеродни точки), едно-измерни (1D) (при CNT) и дву-измерни (2D) (в графеновите наноструктури). Тези наноматериали поддържат по-широк диапазон на работна температура и по-широк обхват на трансдуциращ сигнал дори в екстремни ситуации на околната среда [24].

Въглеродните наноматериали са широко използвани при разработването на методи за детекция на COVID-19. Техните изключителни физикохимични и антивирусни характеристики показват, че наноматериалите играят жизненоважна роля в борбата срещу COVID-19. Тези наноматериали (графен и графенов оксид, въглеродни квантови точки, въглеродни нанотръби и фулерен) с отлични свойства, главно като биосензорност, антивирусни и антимикробни свойства, представляват една по-добра алтернатива за потенциални приложения като биосензори за диагностика, антивирусно покритие, филтриране на вируси разпространявани по въздушно-капков път, маски за лице и целево освобождаване на лекарства в организма [10, 24, 30].

 Графен и графенов оксид

Наноматериалите графен и графенов оксид имат две размерности, както и антимикробни и антивирусни свойства. Поради това те привличат голямо внимание и са обект на много изследвания. Разработени са графен-базирани полеви транзистори (FET) като сензори за анализиране на COVID-19 вирусен товар в клинични назофарингеални проби, използвайки антитела срещу неговия шипчест белтък. Разработените FET сензори могат да уловят SARS-CoV-2 шипчестия белтък във фосфатно буфериран физиологичен разтвор и 100 fg mL−1 медицинска течна транспортна среда, при концентрация 1 fgm L−1 и граница на детекция ~1,6 × 101 pfu mL-1 и ~2,42 × 102 pfu mL-1 съответно за култивирана проба и медицински тест. Този сензор показва, че е силно чувствителен към скрининг и диагностика на новото коронавирусно заболяване от 2019 г. и за него не е необходима предварителна обработка на пробите. Употребата на графен води до подобрено съотношение сигнал/шум [10].

Фигура 12. Схема на определени алотропни форми на въглеродни наноматериали за разработване на нанобиосензори

Въглеродни нанотръби

Въглеродните нанотръби (CNTs) биват широко използвани в биологични и биомедицински проучвания поради следните характеристики, с които отварят нови хоризонти за научно развитие [10]:

• 10− 100 nm в диаметър;
• антивирусна и антимикробна активност;
• добра ефективност на преобразуване на светлината в топлина;
• голямо съотношение повърхност/обем;
• ниска плътност;
• малък размер на порите;
• гъвкавост;
• резистентност към киселини и основи;
• добра механична здравина;
• способност за създаване на реактивоспособни кислородни видове;
• резистентност към респираторни капки;
• биологична съвместимост с няколко лекарства.

Въглеродните точки са открити през 2004 г. Те обикновено притежават фотолуминесцентни свойства и са биосъвместими и силно устойчиви. Тези характеристики ги правят подходящи за прилагане в различни сфери, включително биосенсинг и биовизуализация. Въглеродните нанотръби (CNT), графенът и въглеродните точки (CТ) могат да бъдат класифицирани като нула- (0D), едно-(1D) и дву-(2D) измерни въглеродни наноматериали [10, 30].

Фигура 13. Бъдещи перспективи на въглеродните нанотръби в профилактиката, диагностиката и лечението на SARS-CoV-2 инфекции.

Голямо пространство за съхранение, голяма повърхностна площ, висока биосъвместимост, отлично преминаване през биологични мембрани, относителна степен на биоабсорбция, и целева модификация на биомолекули са отлични свойства на CNT, които предоставят нови възможности за взаимодействие с COVID-19. CNT се използват като системи за диагностика и филтриране и като средство за инактивиране на вируси [10].

Проектирано е микроустройство с регулируем размер на CNT (CNT-STEM), което има за цел да концентрира вируси от сурови проби. CNT могат да се използват за диагностициране на респираторни вируси, включително SARS-CoV-1 и SARS-CoV-2. Страничната стена на канала в микроустройството е произведена от легирани с азот многостенни CNT, където интратубулното пространство между CNT е оптимизирано, за да съответства на размера на различни вируси. С помощта на това устройство беше определен щамът на вируса на птичия грип. CNT-STEM значително подобрява честотата на изолиране на вируса и детекционната чувствителност. Поради лесното приложение и надеждността на тази техника, тя може да бъде модифицирана за откриване на SARS-CoV-2 РНК или белтъци [30, 34].

Фигура 14. Принцип на работа на вирусно обогатяване и концентриране от полеви проби. (A) Пробата, съдържаща вируси (лилави сфери), се взема с помощта на памучен тампон или като тъканна проба. (B) Супернатантата от полевата проба преминава през CNT-STEM и вирусите се концентрират в устройството. Вмъкване (вдясно): Илюстрация на базирано на размера вирусно обогатяване от подравнените N-MWCNT. Вмъкване (долу вдясно): SEM изображение на H5N2 AIV вириони, уловени от N-MWCNT. Вмъкване (долу вляво): TEM изображение на концентриран H5N2 AIV, след като N-MWCNT структурите биват отделени от CNT-STEM.

Нанодиаманти

Поради високата им стабилност и ниска цитотоксичност, към нанодиамантите има значителен интерес за диагностика на COVID-19. Флуоресцентни нанодиаманти се използват като ултрачувствителни маркери в латерален поточен имуноанализ на COVID-19. Тези нанодиаманти са имобилизирани върху тестовата подложка и чрез микровълново поле селективно техния флуоресцентен сигнал се отделя от фоновия сигнал. Това значително подобрява чувствителността на детекция. Този анализ е 105 пъти по-чувствителен от традиционния латерален поточен анализ със златни наночастици. Въглеродните наноматериали могат да се използват като антивирусно терапевтично средство за COVID-19 [30].

3.2.4. Магнитни наночастици (MNPs)

Mагнитните NP (MNP) обикновено се използват за детектиране на SARS-CoV-2, имунен отговор на гостоприемника и разделяне на нуклеинови киселини. Доказано е, че NP от железен оксид със силикатно покритие се свързват с РНК на SARS-CoV-2, след като вирусът бива лизиран. За изолиране на свързаните с РНК NP от разтвора се използва магнит. Този метод е икономичен и лесен, позволявайки ефективна екстракция на РНК от проби [15, 30].

Прецизната детекция изисква ефективна екстракция и разделяне на нуклеиновите киселини от пробата, позволявайки целево пречистване. В едно проучване са използвани суперпарамагнитни наночастици (80 nm), конюгирани със сонда, комплементарна на таргетната последователност в SARS-CoVs. Чрез магнит, функционализираните суперпарамагнитни наночастици могат да екстрахират таргетната кДНК от пробата. Количеството на екстрахираната ДНК се увеличава чрез PCR, използващ флуоресцентни наночастици със силико-покритие, конюгирани с комплементарната последователност. Флуоресцентните наночастици със силико-покритие отделят флуоресцентен сигнал, пряко свързан с концентрацията на целевата кДНК [30].

Повърхностно функционализираните MNP адсорбират нуклеиновата киселина от лизиращия разтвор и биват отделени от повечето контаминанти с помощта на външно магнитно поле. След тази кратка процедура, нуклеиновата киселина може да бъде допълнително пречистена, като се отдели от функционализираната повърхност на MNP чрез процес на десорбция в елуента. Въпреки че този процес е много по-лесен и по-кратък от традиционните процедури, MNP асистирания екстракционен процес все още се състои от няколко етапа, неподходящи за практическа детекция. Наночастиците от цинков ферит се синтезират чрез продължително изпарение, а повърхността на наночастиците е функционализирана със силициев диоксид и карбоксил-модифициран поливинилов алкохол. Тази платформа демонстрира способност за бързото и лесно премахване на вирусната РНК от различни видове проби. Този метод намалява функционалните стъпки, което предоставя значителна перспектива за диагностика на COVID-19 на молекулно ниво [30, 34].

Наличен е по-опростен съвременен протокол за MNP асистирана РНК екстракция и RT-PCR-базирана диагностика на COVID-19. MNP от цинков ферит (ZNF) могат да бъдат синтезирани по рентабилния зол-гел самовъзпламенителен метод. След това повърхността им се функционализира чрез полимери, съдържащи карбоксилни групи (CPoly). От магнитните съединения е избран цинковият ферит поради неговата висока химическа устойчивост, добро магнитно поведение, лесна подготовка и биосъвместим характер. Благодарение на здравата връзка между нуклеиновите киселини и карбоксилните групи, повърхностно функционализираните MNP промотират бърза и ефективна адсорбция на вирусна РНК. Тази рентабилна и опростена техника може да осигури квалифицирана алтернатива на конвенционалните методи [34].

Фигура 15. Схема на протокол за РНК екстракция чрез повърхностно функционализирани MNP

Съществува и едноетапна процедура за екстракция на нуклеинови киселини, която използва поликарбоксил-функционализирани MNP с добавени аминогрупи, (PC-покрити NH2-MNP). Нуклеиновите киселини биват събрани с помощта на магнитно поле и след това освободени от MNPs чрез добавяне на промиващ буфер. При свързване на COVID-19-псевдовируси, поликарбоксил-функционализираните MNPs показват перфектна абсорбция и парамагнитни свойства, чрез бързото свързване (30 s магнитно свързване) към целта [30, 46].

Фигура 16: Схематично представяне на pcMNP-базиран метод за екстракция на вирусна РНК

3.2.5. Нанозими

Нанозимите са ензими, които не се срещат естествено в природата. Те са съставени от наноматериали и имат ефективност, подобна на тази на естествено срещащите се ензими. Нанозимите имат по-добра каталитична активност и способност за самосглобяване. Те биват широко използвани за диагностика и лечение на заболявания. Нов нанозим-базиран хемилуминесцентен хартиен анализ за бърза детекция на SARS-CoV-2 шипчест антиген съчетава нанозимен и ензимен хемилуминесцентен имуноанализ с латерален поточен тест.

Фигура 17: (A) Схема на нанозим хемилуминесцентен хартиен тест за SARS-CoV-2 S-RBD антиген. Разпознаване, разделяне и каталитична амплификация.

Конвенционалната хемилуминесцентна имунодиагностика използва естествени протеази, като HRP или алкална фосфатаза, които имат някои ограничения като това, че не са достатъчно устойчиви при съхранение, имат сложни методи за изготвяне и висока цена. Предложеният биосензор използва имитиращ пероксидаза Co-Fe@hemin нанозим, вместо естествена пероксидаза от хрян (HRP), който може да повиши значително хемилуминесцентния сигнал, достигайки граница на детектиране от 0,1 ng/mL. Доказано е, че нанозимът Co-Fe@hemin е по-устойчив на температура и алкалност в сравнение с HRP. Той може да остане стабилен и при съхранение на стайна температура. Този анализ може да бъде проведен в рамките на 16 минути, много по-бързо в сравнение с обичайните 1-2 часа, необходими за прилаганите в момента анализи на нуклеинови киселини. Освен това, детектирането на сигнал е възможно с помощта на камерата на обикновен смартфон. Компонентите за нанозимния синтез са леснодостъпни, което значително намалява общите разходи [20, 30].

3.2.6. Метало-органични рамки (MOF)

Порестите наноматериали могат да бъдат използвани за детектиране на различни патогени. Не е необходимо аналитът (патогенът) да бъде абсорбиран от порестите наноматериали, но патогена трябва да взаимодейства с повърхността на MOF, която бива модифицирана от различни NPs. Чрез това взаимодействие могат да бъдат оптимизирани допълнителни „изключване/включване“ или „включване/изключване“ оптични механизми за детектиране на патогена. В този случай различни оптични активни компоненти могат да бъдат използвани като гасители или активатори. При SARS-CoV-2 няма необходимост от детектиране на същия генетичен материал и генетична последователност на повърхността на маски или дрехи поради значителните несъответствия между концентрациите на SARS-CoV-2 и други вируси. Вместо това, чрез флуоресцентен модел „отпечатък“ върху контактната повърхност на газовата и твърдата фаза може да бъде измерен същия обхват на SARS-CoV-2 чрез оптични промени. Освен това, ако базираните на MOF биосензори работят успешно за детектиране на HIV-1, H1N1, ZIKA и други патогени със значителна прецизност и добра граница на детектиране, тогава морфологично и оптично-базирания биосензор за детекция на SARS-CoV-2 също трябва да функционира. [26].

4. Предизвикателства и ограничения на наноматериалите

Наноматериалите могат да бъдат изключително ценни в биомедицинската практика. Те обаче имат някои ограничения, като например токсичността им. Едно от значителните предизвикателства пред наноматериалите е да се гарантира безопасното им използване. Друго предизвикателство е, че поведението на наноматериалите в тялото може да се промени, когато те достигнат кръвообращението. Това се дължи на формирането на белтъчна корона. Поради това са необходими достоверни in vivo модели, за да бъде проучено достатъчно токсикокинетичното поведение на наночастиците в тялото, особено при дългосрочно им използване.

Друг проблем е липсата на стандартизирани протоколи за физикохимично и биологично дефиниране на наноматериалите и липсата на общоприето определение за наноматериал. Капацитетът за широкомащабно производство е друго препятствие, което трябва да бъде преодоляно за по-широкото комерсиализиране на нано-базирани формули. Поради множеството взаимодействия между наноматериалите и биологичните системи е много трудно да се предвиди поведението на тези материали при физиологични условия. Веднъж попаднали в тялото, наночастиците достигат кръвообращението, сложна матрица, съдържаща йони, малки молекули, белтъци и клетки. [37].

---

Тест LO 3.1

---

5. Литература

1. Abdelhamid H., and Badr G., (2021). Nanobiotechnology as a platform for the diagnosis of COVID‐19: a review. Nanotechnology for Environmental Engineering 6:19 https://doi.org/10.1007/s41204-021-00109-0
2. Abraham AM., Kannangai R., and Sridharan G., (2008). Nanotechnology: A new frontier in virus detection in clinical practice. Indian Journal of Medical Microbiology, 26(4): 297-301
3. Alhalaili B., Popescu I.N., Kamoun O., Alzubi F., Alawadhia S., Vidu R. (2020) Nanobiosensors for the detection of novel coronavirus 2019-nCoV and other pandemic/Epidemic Respiratory viruses: A review. Sensors 2020, 20, 6591. [CrossRef]
4. Alimardani V., Abolmaali S., Tamaddon A., (2021). Recent Advances on Nanotechnology-Based Strategies for Prevention, Diagnosis, and Treatment of Coronavirus Infections. Journal of Nanomaterials Volume 2021, Article ID 9495126, 20 pages https://doi.org/10.1155/2021/9495126
5. Alphandery E., (2020). The Potential of Various Nanotechnologies for Coronavirus Diagnosis/Treatment Highlighted through a Literature Analysis. Bioconjugate Chem. 2020, 31, 1873−1882. https://dx.doi.org/10.1021/acs.bioconjchem.0c00287
6. Bendavid E., Mulaney B., Sood N., Shah S., Ling E., Bromley-Dulfano R. (2020). COVID-19 Antibody Seroprevalence in Santa Clara County, California. MedRxiv
7. Carter L. J., Garner L. V., Smoot J. W., Li Y., Zhou Q., Saveson C. J., et al. (2020). Assay techniques and test development for COVID-19 diagnosis. ACS Cent. Sci. 6, 591–605. doi: 10.1021/acscentsci.0c00501
8. Di Paolo M., Iacovelli A., Olmati F., Menichini I., Oliva A., Carnevalini M., et al. (2020). False-negative RT-PCR in SARS-CoV-2 disease: experience from an Italian COVID-19 unit. ERJ Open Res. 6, 324–2020. doi: 10.1183/23120541.00324-2020
9. Eftekhari A., Alipour M., Chodari L., Maleki Dizaj S., Ardalan M., Samiei M., Sharifi S., Zununi Vahed S., Huseynova I., Khalilov R. et al. (2021). A Comprehensive Review of Detection Methods for SARS-CoV-2. Microorganisms, 9, 232. https://doi.org/10.3390/ microorganisms9020232
10. Ghaemi F., Amiri A., Bajuri M., Yuhana N., Ferrara M., (2021), Role of different types of nanomaterials against diagnosis, prevention and therapy of COVID-19. Sustainable Cities and Society 72 (2021) 103046
11. Gupta R., Sagar P., Priyadarshi N., Kaul S., Sandhir R., Rishi V. and Singhal N.K. (2020). Nanotechnology-Based Approaches for the Detection of SARS-CoV-2. Front. Nanotechnol. 2:589832. doi: 10.3389/fnano.2020.589832
12. Huang C., Wen T., Shi F.J., Zeng X.Y., Jiao Y.J., (2020). Rapid Detection of IgM Antibodies against the SARS-CoV-2 Virus via Colloidal Gold Nanoparticle-Based Lateral-Flow Assay. ACS Omega 2020, 5, 12550–12556.
13. Jiang M., Pan W., Arasthfer A., Fang W., Ling L., Fang, H., et al. (2020). Development and validation of a rapid, single-step reverse transcriptase loop- mediated isothermal amplification (RT-LAMP) system potentially to be used for reliable and high-throughput screening of COVID-19. Front. Cell. Infect. Microbiol. 10:331. doi: 10.3389/fcimb.2020.00331
14. Jindal S., and Gopinath P., (2020) Nano Ex. 1 022003
15. Kang J., Tahir A., Wang H., Chang J. (2021). Applications of nanotechnology in virus detection, tracking, and infection mechanisms. WIREs Nanomed Nanobiotechnol. 2021;13:e1700. https://doi.org/10.1002/ wnan.1700
16. Kelly J. C., Dombrowksi M., O’Neil-Callahan M., Kernberg A. S., Frolova A. I., and Stout M. J. (2020). False-negative testing for severe acute respiratory syndrome coronavirus 2: consideration in obstetrical care. Am. J. Obstet. Gynecol. 2(Suppl. 3):100130. doi: 10.1016/j.ajogmf.2020.100130
17. Layqah L.A., Eissa S. (2019). An Electrochemical Immunosensor for the Corona Virus Associated with the Middle East Respiratory Syndrome Using an Array of Gold Nanoparticle-Modified Carbon Electrodes. Microchimica Acta 2019, 186, 224.
18. Lew T., Aung K., Ow S., Amrun S., Sutarlie L., Ng L., and Su X., (2021). Epitope-Functionalized Gold Nanoparticles for Rapid and Selective Detection of SARS-CoV‐2 IgG Antibodies. ACS NANO, https://doi.org/10.1021/acsnano.1c04091
19. Li H., and Rothberg L., (2004). Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, 14036–14039
20. Liu D., Ju C., Han C., Shi R., Chen X., Duan D., Yan J., Yan, X. (2021). Nanozyme Chemiluminescence Paper Test for Rapid and Sensitive Detection of SARS-CoV-2 Antigen. Biosens. Bioelectron. 2021, 173, 112817
21. Manivannan S., Ponnuchamy K. (2020). Quantum Dots as a Promising Agent to Combat COVID-19. Appl. Organomet. Chem. 2020, 34, e5887
22. Mizumoto K., Kagaya K., Zarebski A., Chowell G.J.E. (2020). Estimating the asymptomatic proportion of coronavirus disease 2019 (COVID-19) cases on board the Diamond Princess cruise ship, Yokohama, Japan, 2020. Eurosurveillance , 25, 2000180
23. Moitra P., Alafeef M., Dighe K., Frieman M.B., Pan D. (2020). Selective Naked-Eye Detection of SARS-CoV-2 Mediated by N Gene Targeted Antisense Oligonucleotide Capped Plasmonic Nanoparticles. ACS Nano, 14, 7617–7627.
24. Ozmen E., Kartal E., Turan M., Yazicioglu A., Hiazi J., and Qureshi A., (2021). Graphene and carbon nanotubes interfaced electrochemical nanobiosensors for the detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) and other respiratory viral infections: A review. Materials Science & Engineering C 129 (2021) 112356
25. Park T.J., Lee S.Y., Lee S.J., Park J.P., Yang K.S., Lee K.-B., Ko S., Park J.B., Kim T., Kim S.K., (2006). Protein Nanopatterns and Biosensors Using Gold Binding Polypeptide as a Fusion Partner. Anal. Chem. 2006, 78, 7197–7205
26. Pascarella G., Strumia A., Piliego C., Bruno F., Del Buono R., Costa F., et al. (2020). COVID-19 diagnosis and management: a comprehensive review. J. Intern. Med. 288, 192–206. doi: 10.1111/joim.13091
27. Pishva P., and Yuce M., (2021). Nanomaterials to tackle the COVID-19 pandemic. Emergent Materials https://doi.org/10.1007/s42247-021-00184-8
28. Rabiee N., Bagherzadeh M., Ghasemi A., Zare H., Ahmadi S., Fatahi Y., Dinarvand R., Rabiee M., Ramakrishna S., Shokouhimehr M., Varma R.S. (2020). Point-of-Use Rapid Detection of SARS-CoV-2: Nanotechnology-Enabled Solutions for the COVID-19 Pandemic. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 5126. https://doi.org/10.3390/ijms21145126
29. Rai M., Bonde S., Yadav A., Bhowmik A., Rathod S., Ingle P., Gade A. (2021). Nanotechnology as a Shield against COVID-19: Current Advancement and Limitations. Viruses 2021,13,1224. https:// doi.org/10.3390/v13071224
30. Rasmi Y., Saloua K.S., Nemati M., Choi J.R. (2021). Recent Progress in Nanotechnology for COVID-19 Prevention, Diagnostics and Treatment. Nanomaterials 2021, 11, 1788. https://doi.org/10.3390/ nano11071788
31. Roh C., Jo S.K., (2011). Quantitative and Sensitive Detection of SARS Coronavirus Nucleocapsid Protein Using Quantum Dots- Conjugated RNA Aptamer on Chip. J. Chem. Technol. Biotechnol. 2011, 86, 1475–1479.
32. Shan B., Broza Y.Y., Li W., Wang, Y., Wu S., Liu Z., Wang J., Gui S., Wang L., Zhang Z., et al. (2020). Multiplexed Nanomaterial-Based Sensor Array for Detection of COVID-19 in Exhaled Breath. ACS Nano 2020, 14, 12125–12132.
33. Singh P., Singh D., Sa P., Mohapatra P., Khuntia A., and Sahoo S. (2021). Insights from nanotechnology in COVID-19: prevention, detection, therapy and immunomodulation. Nanomedicine (Lond.) (2021) 16(14), 1219–1235
34. Somvanshi S., Kharat P., Saraf T., Somwanshi S., Shejul S., and Jadhav K. (2021). Multifunctional nano-magnetic particles assisted viral RNA-extraction protocol for potential detection of COVID-19, Materials Research Innovations, 25:3, 169-174, DOI: 10.1080/14328917.2020.1769350
35. Talebian S., Wallace g., Schroeder A., Stellacci F., and Conde J. (2020). Nature Nanotechnology, Vol 15, August 2020, 618-624, www.nature.com/naturenanotechnology
36. Tavakol S., Zahmatkeshan M., Mohammadinejad R., Mehrzadi S., Joghataei M., Alavijeh M., Seifalian A. (2021). The role of nanotechnology in current COVID-19 outbreak. Heliyon 7 (2021) e06841
37. Tharayil A., Rajakumari R., Chirayil C., Thomas S. and Kalarikkal N., (2021) A short review on nanotechnology interventions against COVID-19. Emergent Materials (2021). 4:131–141  https://doi.org/10.1007/s42247-021-00163-z
38. To K.K.-W., Tsang O.T.-Y., Yip C.C.-Y., Chan K.-H., Wu T.-C., Chan J.M.-C., Leung W.-S., Chik T.S.-H., Choi C.Y.-C., Kandamby D.H. et al. (2020). Consistent Detection of 2019 Novel Coronavirus in Saliva. Clin. Infect. Dis
39. Toledo G., Toledo V., Lanfredi A., Escote M., Champi A., Da silva M., Nantes-Cardoso I., (2020), Promising Nanostructured Materials against Enveloped Virus. An Acad Bras Cienc (2020) 92(4): e20200718 DOI 10.1590/0001-3765202020200718
40. Udugama B., Kadhiresan P., Kozlowski H. N., Malekjahani A., Osborne M., Li V. Y. C., et al. (2020). Diagnosing COVID-19: the disease and tools for detection. ACS Nano 14, 3822–3835. doi: 10.1021/acsnano.0c02624
41. Varghese R., Salvi S., Sood P., Karsiya J., Kumar D. (2021). Carbon nanotubes in COVID-19: A critical review and prospects. Colloid and Interface Science Communications 46 (2022) 100544
42. Waller J. V., Kaur P., Tucker A., Lin, K. K., Diaz M. J., Henry T. S., et al. (2020). Diagnostic tools for coronavirus disease (COVID-19): comparing CT and RT-PCR viral nucleic acid testing. Am. J. Roentgenol. 215, 834–838. doi: 10.2214/AJR.20.23418
43. Wong M.L., Medrano J.F. (2005). Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques 39, 75–85.
44. Yeh Y.-T., Tang Y., Sebastian A., Dasgupta A., Perea-Lopez N., Albert I., Lu H., Terrones M., Zheng, S.-Y., (2016). Tunable and Label-Free Virus Enrichment for Ultrasensitive Virus Detection Using Carbon Nanotube Arrays. Sci. Adv. 2016, 2, e1601026.
45. Zhang F., Abudayyeh O. O., Gootenberg J. S., Sciences C., and Mathers L. (2020). A Protocol for Detection of COVID-19 Using CRISPR Diagnostics.
46. Zhao Z., Cui H., Song W., Ru X., Zhou W., Yu X. (2020). A Simple Magnetic Nanoparticles-Based Viral RNA Extraction Method for Efficient Detection of SARS-CoV-2. bioRxiv 2020.