Nanomaterialien in Design und Anwendung von SARS-CoV-2-Nachweismethoden

Zusammenfassung

Aufgrund ihrer Fähigkeit, leicht in Zellen einzudringen, mit Viren zu interagieren und die Reproduktion des Virusgenoms zu verhindern, als hervorragende Kandidaten gegen Virusinfektionen, insbesondere CoVs , angesehen werden. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von Nanopartikeln den sofortigen Nachweis von ansteckenden Erregern in winzigen Probenvolumina in einem empfindlichen, präzisen und schnellen Format zu niedrigeren Kosten als derzeit verwendete Technologien. Dieser Fortschritt in der Früherkennung ermöglicht eine genaue und schnelle Behandlung.

Schlüsselwörter/Phrasen: Nanomaterialien, COVID-19, Nachweis

1. Einführung

Die anhaltende Explosion der neuartigen Coronavirus-Krankheit COVID-19 zieht weltweite Überlegungen aufgrund ihrer verlängerten Inkubationsdauer und erheblichen Infektiosität an. Die schnelle weltweite Ausbreitung der Pandemie, angetrieben durch das schwere akute respiratorische SARS-CoV-2, hat einen dringenden Bedarf an seiner Diagnose und Behandlung geschaffen. Infolgedessen haben viele Forscher versucht, die effizientesten und geeignetsten Methoden zum Nachweis und zur Behandlung von SARS-CoV-2 zu finden. Echtzeit-Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktionstests (RT-PCR) werden derzeit als einer der zuverlässigsten Ansätze zum Nachweis des neuen Virus verwendet. Dieser Prozess ist jedoch zeitaufwändig, arbeitsintensiv und erfordert geschultes Laborpersonal. Darüber hinaus werden trotz seiner hohen Wahrnehmungsfähigkeit und Spezifität falsch negative Ergebnisse dokumentiert, insbesondere bei nicht nasopharyngealen Abstrichproben, die eine geringere Viruslast ergeben. Folglich scheint die Entwicklung und Nutzung schnellerer und zuverlässigerer Methoden von entscheidender Bedeutung zu sein. In den letzten Jahren wurden viele Versuche unternommen, verschiedene Nanomaterial-basierte Biosensoren herzustellen, um Viren und Bakterien in klinischen Proben nachzuweisen [27, 46].

Eine diskrete Methode zur Diagnose der Coronavirus-Krankheit COVID-19 ist sehr gefragt, um die bestehenden und kommenden globalen Gesundheitsgefahren zu bekämpfen. Nanopartikel bieten eine günstige Implementierung und erhebliche Aussichten, als Plattform für die schnelle Diagnose einer Virusinfektion mit erhöhter Sensitivität zu fungieren. Nanopartikel wie Goldnanopartikel, magnetische Nanopartikel und Graphen (G) wurden zum Nachweis von SARS- CoV 2 eingesetzt. Sie wurden für molekularbasierte Diagnoseverfahren und serologische Ansätze eingesetzt. Nanopartikel erhöhten die Eindeutigkeit und verkürzten die für die Diagnose erforderliche Zeit. Sie können in winzige Geräte ausgeführt werden, die die Selbstdiagnose zu Hause oder an Orten wie Flughäfen und Geschäften fördern. Nanopartikelbasierte Methoden können zur Analyse viruskontaminierter Patienten-, Oberflächen- und Luftproben eingesetzt werden [1].

2. Aktuelle Methoden zum Nachweis von SARS-CoV-2

Konventionelle Methoden zum Nachweis von SARS-CoV-2 sind die Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), die Computertomographie (CT) und Next-Generation-Sequencing (NGS) [1, 26, 40] (Abb. 1) . RT-PCR und Brust-CT-Bildgebung sind die typischsten Diagnosetechniken zum Nachweis von COVID-19. Darüber hinaus stehen mehrere diagnostische Methoden wie Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) – Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter Unlocking (SHERLOCK), Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP), Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) , und die Sequenzierung befinden sich in der Entwicklung, um das Virus in kürzester Zeit besser nachweisen zu können [1, 9]. RT-PCR wurde als führende und effektivste Methode zum Coronavirus-Nachweis anerkannt [1, 26].

Abbildung 1. Herkömmliche Methoden, die derzeit zum Nachweis des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) verwendet werden. (A) Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR). cDNA, komplementäre DNA. (B) Computertomographie-Scan. (C) Enzyme-Linked Immunosorbent Assay.

2.1. Reverse Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)

RT-PCR wird in großem Umfang zum Nachweis von COVID-19 verwendet. Es basiert auf der cDNA-Synthese aus genomischer RNA und wird von einer Amplifikation gefolgt [26, 38]. Die Amplifikation von minimalen Mengen viralen genetischen Materials in einer Mischung anderer Nukleinsäureserien wird effektiv durch RT-PCR durchgeführt. Es ist derzeit die goldene Standardtechnik zum Nachweis von SARS-CoV-2 in Proben der oberen Atemwege. Mehrere Studien haben Serum-, Augen- und Stuhlproben für den RT-PCR-basierten Nachweis verwendet. Eine zeitgemäße Methode verwendet selbst gesammelte Speichelproben als nicht-invasive und sichere Technik für Gesundheitsdienstleister vor der RT-PCR. Bei diesem Verfahren verändert die Reverse Transkriptase zuerst das virale RNA- Genom in DNA unter Verwendung eines Sequenzprimers mit kleiner Sequenz und der Generierung komplementärer DNA (cDNA). Dann beobachtet ein fluoreszierender Farbstoff oder eine fluoreszenzmarkierte sequenzspezifische DNA-Sonde die Amplifikation der DNA in Echtzeit. Schließlich zeigt ein fluoreszierendes oder elektrisches Signal die virale cDNA nach aufeinanderfolgenden Amplifikationszyklen [1, 9, 22].

Herkömmliche RT-PCR-Verfahren umfassten einstufige oder zweistufige Ansätze. Während einstufige Verfahren ein einzelnes Röhrchen enthalten, das einen Primer enthält, verwendet das zweistufige Verfahren mehr als ein Röhrchen, um die Reaktionen durchzuführen. Dennoch bietet es einen umsichtigeren und flexibleren Weg. Außerdem kann es cDNA für die Quantifizierung verschiedener Ziele mit weniger Ausgangsmaterialien vorrätig halten. Die Standardmethode zum Nachweis von SARS-CoV-2 ist jedoch der einstufige Ansatz, da er schneller ist, weniger Probenhandhabung erfordert, die Laborzeit verkürzt und Pipettierfehler verringert [9, 43].

Der RT-PCR-basierte Nachweis ist auch mit falsch-negativen Ergebnissen verbunden, was auf die niedrige Viruslast im Rachen der Patienten, den unsachgemäßen Umgang mit RNA-Proben oder das Fehlen ausreichender interner Kontrollen zurückzuführen sein könnte [8, 9, 16]. Das Hauptproblem der RT-PCR ist ihre geringe Empfindlichkeit gegenüber Brustscans aufgrund der unzureichenden Anzahl von Viren im Blut der RT-PCR. Darüber hinaus ist es aufgrund der unzureichenden Anzahl von Viren im Blut oder der Ungenauigkeit des Laborkits eine geringe Empfindlichkeit gegenüber Brustscans [26].

2.2. Computertomographie (CT)

Eine weitere Methode zur Erkennung und Behandlung von COVID-19 ist der Brust-CT-Scan, bei dem Röntgenaufnahmen der Brust eines Patienten in verschiedenen Winkeln durchgeführt werden. Laut radiologischen Berichten können ungewöhnliche Merkmale auf dem CT-Scan-Ausdruck auf einen COVID-19-Befall zurückzuführen sein. Typische Merkmale, die bei einem Brustscan eines Patienten mit COVID-19 beobachtet werden, sind Milchglastrübung (GGO), insbesondere an den peripheren und tieferen Lappen, Konsolidierungen (Anstieg der Trübung des Parenchyms, was zu einer Abdeckung der darunter liegenden Gefäße führt ), Crazy-Paving-Muster (GGO mit intralobulärer und interlobulärer Septumverdickung) und lineare Trübungen. Das hochauflösende CT könnte helfen, GGOs in frühen Stadien der Infektion zu erkennen [9, 26, 40].

Die CT-Empfindlichkeit scheint bei Patienten mit positiver RT-PCR erhöht zu sein (86–97 % in verschiedenen Fallstudien) und niedriger bei Patienten mit nur konstitutionellen und nicht-respiratorischen Symptomen (ca. 50 %). Ultraschall wurde in einer minimalen Anzahl von Fällen als diagnostisches Instrument verwendet. Ultraschall hat eine sehr geringe Spezifität, und trotz der Beeinflussung durch Faktoren wie Krankheitsstringenz, Patientengewicht und Geschicklichkeit des Bedieners wird die Empfindlichkeit auf etwa 75 % geschätzt. Ultraschall kann jedoch eine Rolle bei der Beobachtung des Fortschreitens der Krankheit spielen, indem er Merkmale einer interstitiellen Lungenerkrankung erkennt [26].

2.3. SHERLOCK

Neben RT-PCR und CT-Scans wurden auch verschiedene andere Nachweisverfahren für SARS- CoV – 2-Nachweise entwickelt. Wie es in Gupta überhaupt beschrieben ist, wurde SHERLOCK von Zhang et al. [45] „zum Nachweis von RNA-Fragmenten von SARS- CoV – 2 mit 10–100 Kopien/ μl der Eingabe. Das Grundprinzip der SHERLOCK-basierten Diagnose ist die CRISPR-basierte Erkennung. Dieser Test kann in < 60 min durchgeführt werden, ohne dass spezielle Instrumente erforderlich sind. Sie wählten zwei Ziele, das S-Gen und das Orf1ab-Gen, aus dem SARS-CoV-2-Genom aus. Um die Kreuzreaktivität mit anderen Genomen von Atemwegsviren zu minimieren, wählten sie auch spezifische Leitsequenzen aus.“ [9].

2.4. RT-LAMPE

Eine optimierte RT-LAMP-basierte Nachweismethode hat eine höhere Empfindlichkeit als herkömmliche PT-PCR-Methoden und benötigt weniger Zeit (Abb. 2). Infolgedessen kann dieses Verfahren zur schnellen Diagnose des Coronavirus genutzt und die Testkapazität um das 2–2,5-fache erhöht werden [9, 13].

Abbildung 2.. Arbeitsablaufvergleich unseres RT-LAMP-Assays im Vergleich zur qRT-PCR für Notfälle (ambulant) und stationäre Patienten. Unser RT-LAMP-Assay ist 2- bis 2,5-mal schneller als die qRT-PCR-Assays und kann bei Raumtemperatur versendet werden.

Gupta et al. fasste die aktuellen Techniken zum Nachweis einer SARS-CoV-2-Infektion in Abb. 3 zusammen [9] .

Abbildung 3. Aktuelle Techniken, die zum Nachweis des Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) mit schwerem akutem respiratorischem Syndrom verwendet werden.

3. Nanomaterialien für den SARS-CoV-2-Nachweis

Nukleinsäuretests durch Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) sind die aktuelle Methode zum Nachweis einer COVID-19-Infektion. Obwohl RT-PCR weit verbreitet ist, um COVID-19 nachzuweisen, gibt es mehrere Probleme [3, 14, 29, 35].

1. Falsch negative Ergebnisse;
2. lange Reaktionszeiten / zeitaufwändig;
3. RT-PCR ist nicht in der Lage, asymptomatische Patienten zu erkennen, da sie das Vorhandensein von beobachtbarem SARS-CoV-2 in gesammelten Proben erfordert;
4. schlechte analytische Empfindlichkeit;
5. arbeitsintensiv;
6. Gesundheitszentren in nicht städtischen Umgebungen verfügen nicht über eine angemessene PCR-Infrastruktur, um einen erhöhten Probendurchsatz zu bewältigen;
7. teuer;
8. die Verfügbarkeit von RT-PCR-Kits und Reagenzien kann die erhöhte Nachfrage nicht befriedigen.

Die gegenwärtige Situation erfordert die Entwicklung von Erkennungstechniken, die schnell, kostengünstig und einfach zu bedienen sind. Um die Einschränkungen traditioneller Methoden zu überwinden, ist ein verbesserter multidisziplinärer Ansatz erforderlich. Auf Nanomaterialien basierende technologische Lösungen bieten vielfältige Anwendungsmöglichkeiten im Kampf gegen das Virus [10, 32].

3.1. Eigenschaften von Nanomaterialien

Die einzigartigen Eigenschaften von Nanopartikeln spielen eine entscheidende Rolle bei der Bekämpfung von Pandemien und der Eindämmung künftiger Ausbrüche. Nanopartikel zeigen charakteristische Eigenschaften wie:

• winzige Größe;
• Löslichkeit;
• Multifunktionalität;
• Zielfähigkeit;
• Reizreaktionsfunktionen;
• große Oberfläche;
• Oberflächenanpassung.

Daher wurden sie für verschiedene Anwendungen in einer Vielzahl von Bereichen wie analytische Chemie, Pharmazie, Sensorik/Biosensorik, Biotechnologie, Nanomedizin, Arzneimittelabgabe, biologische Erkennung, Gentransfer, Optik, Wundheilung, energiebasierte Anwendungen und Landwirtschaft eingesetzt und Umweltanwendungen. Nanopartikel verbesserten diese Anwendungen, indem sie eine höhere Leistung mit einer erheblichen Aussicht auf die Umsetzung in eine miniaturisierte Maschine, einschließlich tragbarer Elektronik, lieferten. Daher zeigen sie das enorme Potenzial, die Lebensqualität zu verbessern, indem sie die Virusausbreitung durch Früherkennung regulieren. Nanopartikel haben mindestens eine Dimension im Nanometerbereich (1 nm = 10 -9) (Abb. 4) [1, 15, 30, 36].

Abbildung 4. Skala von Nanopartikeln mit einigen Beispielen.

Das hohe Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnis, die hohe Adsorption, die Quantengrößeneffekte und die hohe Reaktivität der Nanopartikel ermöglichen eine effiziente Wechselwirkung mit Probenanalyten. Darüber hinaus verfügen sie über außergewöhnliche Multiplexing-Fähigkeiten, die sie für die Integration in hochmoderne Technologien zur Virenerkennung geeignet machen. Darüber hinaus bieten Nanopartikel eine einfache Oberflächenfunktionalisierung, was darauf hindeutet, dass mehrere Liganden über kovalente oder nichtkovalente Bindungen gebunden werden können, was die Selektivität und Besonderheit weiter verbessert und die Nachweiszeit verkürzt. Darüber hinaus können Nanomaterialien auch als Markierungen zur Verbesserung der Signale verwendet werden, wodurch Signale mit sehr geringer Stärke erkannt werden können [32].

3.2. Kategorien von Nanomaterialien

Eine Vielzahl von Nanomaterialien für die Erkennung und Verfolgung von Viren wurde entwickelt, die zur Aufklärung von Virusinfektionsmechanismen beitragen , wie z. B. [11]:

• Metallische Nanopartikel, z. B. Gold-Nanopartikel (Au-NPs), Silber-Nanopartikel (Ag-NPs);
• Metalloxid-Nanopartikel, z. B. magnetische Eisenoxid-Nanopartikel (Fe 3 O 4 NPs);
• Kohlenstoff-Nanomaterialien einschließlich 0-dimensional (0D, z. B. Fullerene (C60), Kohlenstoffpunkte (C-Punkte)), 1D (Kohlenstoff-Nanotunes (CNTs)), 2D (z. B. Graphen (G), Graphenoxid (GO) und 3D (z. B. Graphit);
• Quantenpunkte (QDs): CdS-QDs, CdTe-QDs, Kohlenstoff-QDs ;
• Poröse Materialien: metallorganische Gerüste (MOFs), kovalente organische Gerüste (COFs);
• Polymere: natürliche Polymere (z. B. Chitosan, Cellulose) und synthetische (z. B. Polythiophen, Polypyrrol);
• Lipid-Nanopartikel (LNPs): Triglyceride, Fettsäuren, Steroide und Wachse.

Abbildung 5. Schematische Diagramme, die verschiedene Beispiele für COV-Nachweismethoden auf Nanomaterialbasis zeigen. (a) Fluoreszierende Zr-QDs und magnetische Nanopartikel werden mit Antikörpern konjugiert, die spezifisch an COV binden. In Gegenwart von COV wird ein magnetisch fluoreszierender Komplex gebildet, der magnetisch isoliert und durch Fluoreszenzmessungen nachgewiesen wird. (b) Nanofallen werden verwendet, um COV zu konzentrieren und ihre Stabilität zu verbessern, wodurch ihr Nachweis erleichtert wird. (c) Reverse Transkriptions-PCR wird in Gegenwart von Nanopartikeln durchgeführt, wodurch die Wirksamkeit der Polymerase-Kettenreaktion verbessert wird und eine bessere Nachweisempfindlichkeit dieses Verfahrens resultiert. (d) COV-Nachweisverfahren, das auf den Wechselwirkungen zwischen komplementärer DNA, die aus COV stammt, und einer acpnPNA-Sonde an der Oberfläche von Ag-NP basiert, was zu einer Trennung zwischen Ag-NPs und einer gelben Farbe führt, die mit der Lumineszenz von gut dispergiertem Ag verbunden ist NPs, die das Vorhandensein von COV weiter aufdecken.

Abbildung 6. Verschiedene Nanopartikel.

Nanomaterialien können in einer Vielzahl von Rollen für COVID-19 eingesetzt werden. Rasmi et al. fassen die Funktionen und die primäre Rolle von Nanomaterialien in der folgenden Tabelle zusammen (Abb. 7) [30].

Abbildung 7. Zusammenfassung der Rolle von Nanomaterialien für COVID-19.

3.2.1. Gold-NPs (Au-NPs)

Goldnanopartikel (AuNPs) werden aufgrund ihrer bemerkenswerten optischen Eigenschaften wie erhöhte Extinktionskoeffizienten und abstimmbare lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanz (LSPR) zunehmend in SARS-CoV-2-Detektionsplattformen eingesetzt, die eine separate Farbauslesung mit einer einfachen Ausrüstung oder nackt ermöglichen Auge. Für den Nachweis von SARS-CoV-2-Antikörpern (IgG, IgM oder IgA) wurden AuNP- und fluoreszierende Nanopartikel-basierte Assays vorgeschlagen [17].

Gold-Nanopartikel (AuNPs) sind eines der am häufigsten verwendeten Nanomaterialien für die Schnelldiagnostik. Das Gold-Nanopartikel wurde verwendet, um die doppelsträngige DNA (dsDNA) von Zielviren nachzuweisen. Insbesondere kann einzelsträngige DNA (ssDNA) oder ssRNA mit Citrationen auf der AuNP-Oberfläche interagieren. Die Zugabe von Salz zur Lösung kann die Partikel stabilisieren und ihre Farbe ändern. Weiterhin eine einfache Farbmetrik Hybridisierungsassay wurde angewendet, um dsDNA von SARS- CoV nachzuweisen, die aus ssRNA entwickelt wurde. Dieser Assay kann das Ziel bei 4,3 nM in 10 min sehen, ohne dass ein umständliches Gerät erforderlich ist [18, 30].

Farbwechsel -Ansatz

Eine andere Analyse führte eine Methode ein, um das COVID-19-Virus ohne ausgefeilte Werkzeuge visuell zu erkennen. Der kolorimetrische Nachweis wurde unter Verwendung von Thiol-modifizierten Antisense-Oligonukleotiden (ASOs)-beschichteten AuNPs entwickelt, die explizit für die bestimmt sind. Thiol-modifizierte ASO-Cap-AuNPs wurden selektiv in der Existenz der SARS-CoV-2-Ziel-RNA-Sequenz aggregiert und lieferten eine Modifikation ihrer Oberflächenplasmonresonanz. Das Ergebnis kann in 10 min mit einer Nachweisgrenze von 0,18 ng/ μL beobachtet werden [23, 30].

Abbildung 8: Schematische Darstellung für den selektiven Nachweis von SARS-CoV-2-RNA mit bloßem Auge, vermittelt durch die geeignet gestalteten ASO-bedeckten AuNPs.

Ein effektiver Nachweis von COVID-19 wurde durch Immobilisieren von Proteinen auf der Au-Oberfläche unter Verwendung der Au-bindenden Polypeptide entwickelt. Unter Verwendung des verbesserten grün fluoreszierenden Proteins, des SARS- CoV -E -Proteins und des Kern-Streptavidins von Streptomyces avidinii als Beispiele wurde das Au-bindende Polypeptid-Fusionsprotein explizit auf AuNP immobilisiert, und die Protein-Nanomuster auf der bloßen Au-Oberfläche wurden demonstriert. Diese Komplexe interagieren mit dem Antikörper, was zu Absorption und Farbänderung führt [25, 30].

 Nicht-invasiver Ansatz

Der Nachweis von COVID-19 mit nicht-invasiven Ansätzen wurde aus der ausgeatmeten Luft unter Verwendung eines AuNP-basierten Sensors vorgeschlagen. Der Sensor bestand aus verschiedenen AuNPs, die an organische Liganden und einen Film aus anorganischem Nanomaterial gebunden waren. Der anorganische Film ist für die elektrische Leitfähigkeit verantwortlich. Daher reagiert der organische Film, wenn er den flüchtigen organischen Verbindungen (VOCs) aus der Ausatmung ausgesetzt wird, mit den VOCs, was zum Quellen oder Schrumpfen des anorganischen Films und zu Änderungen der elektrischen Leitfähigkeit führt. Daher könnte dieser nicht-invasive Sensor möglicherweise zum schnellen Screening von COVID-19 verwendet werden [30, 32].

Elektrochemischer Hybridisierungsansatz

Ein AuNP-basiertes elektrochemisches Hybridisierungsverfahren wurde unter Verwendung eines Gensensors definiert, der aus einer thiolierten DNA-Sonde besteht, die auf der AuNPs-Kohlenstoffelektrode immobilisiert ist, um biotinylierte Ziel-DNA zu hybridisieren. Ein elektrochemischer Chip wurde über eine Kohlenstoffelektrode präsentiert, die aus einem AuNP-Array bestand. Das Coronavirus-Protein wurde an eine AuNP-Elektrode gebunden, und sowohl das Coronavirus-Protein als auch freie Viren konkurrieren um Bindungsstellen in der Existenz von Antikörpern. Es gab eine ausgezeichnete lineare Reaktion zwischen der Sensorantwort und den Konzentrationen des Coronavirus im Bereich von 0,001 bis 100 ng ml−1. Der Assay erreichte die Nachweisgrenze von nur 1,0 pg mL−1. Die Methode war einstufig, sensibel und präzise (Abb. 9) [17, 30].

Abbildung 9. COV-Immunsensor-Array-Chip (a), die Herstellungsschritte des Immunsensors (b), der Nachweisprozess des kompetitiven Immunsensors für das Virus (c).

Immunchromatographischer Ansatz

Ein Lateral-Flow-Assay zum schnellen Nachweis von IgM gegen COVID-19 wurde durch den Ansatz der indirekten Immunchromatographie entwickelt. Das SARS-CoV-2-Nukleoprotein (SARS-CoV-2-NP) wurde zur Zielerfassung auf eine analytische Membran aufgetragen, und Anti-Human-IgM wurde an AuNP konjugiert, das als Detektionsreporter diente. Die AuNP-LF-Analyse zeigte eine bemerkenswerte Selektivität beim IgM-Nachweis ohne Störung durch andere Viren. Jeder Assay benötigt nur 10–20 μl Serum, und das Ergebnis kann innerhalb von 15 min empfangen werden [12, 30].

3.2.2. Quantenpunkte (QDs)

Quantenpunkte (QDs) sind facettenreiche Mechanismen, die gegen das COVID-19-Virus kämpfen können. Quantenpunkte (QDs), auch als „Halbleiter-Nanomaterialien“ bekannt, spielen eine entscheidende Rolle bei der Erkennung von COVID-19. QDs wurden als neue fluoreszierende Sonde für die molekulare Bildgebung erkannt . Die Größe der QDs variiert von 1 bis 10 nm. Die außergewöhnlichen Eigenschaften von QDs, einschließlich hervorragender optischer und Halbleitereigenschaften, beispielhafter Photostabilität, hoher Quantenausbeute und schmalem Emissionsspektrum mit einstellbarer Größe, haben sie zu einem bedeutenden Kandidaten für den Einsatz als Fluoreszenzmarker gemacht. Aufgrund dieser herausragenden Eigenschaften können QDs als hervorragendes Mittel zur Bekämpfung von Virusinfektionen angesehen werden. Darüber hinaus kann die Einbeziehung möglicher biokompatibler Träger interdisziplinäre Studien unterstützen und klinische Ansätze zur Bekämpfung des Virus ermöglichen. Aufgrund ihrer überlegenen Eigenschaften sind QDs heute dominante bildgebende Sonden ( Chemosensoren und Biosensoren) für die Sensorik [21, 30].

Abbildung 10. Beschreibung des Funktionsprinzips des AuNP=LF-Streifens.

QDs werden aufgrund ihrer Rückverfolgbarkeit unter einer bestimmten Lichtwellenlänge eingesetzt. Darüber hinaus können QDs auf die gewünschte Größe (1–10 nm) und Form abgestimmt werden, die SARS-CoV-2 mit einer Größenspanne zwischen 60 und 140 nm effizient angreifen/durchdringen. Darüber hinaus könnte die positive Oberflächenladung von kohlenstoffbasierten QDs genutzt werden, um das S-Protein von SARS-CoV-2 zu sequestrieren/deaktivieren. Darüber hinaus interagieren kationische Oberflächenladungen, die QDs aufweisen, mit dem negativen RNA-Strang des Virus, was zur Produktion reaktiver Sauerstoffspezies innerhalb von SARS-CoV-2 führt [21].

Ein QD-konjugierter RNA-Aptamer-basierter Chip wurde für den sensitiven und schnellen Nachweis des SARS- CoV -N-Proteins mit einer Nachweisgrenze von 0,1 pg mL−1 auf einem entwickelten Chip eingeführt. Das QD-konjugierte RNA-Aptamer kann an das auf dem Chip immobilisierte SARS- CoV -N-Protein binden und ein optisches Signal erzeugen. Die Verwendung von fluoreszenzbasierten QDs kann Forschern bei der Entwicklung eines einfachen, sensitiven und schnellen Diagnosewerkzeugs für COVID-19 helfen [30, 31].

Abbildung 11 . Schematische Darstellung der Wirkungen von QDs auf SARS-CoV-2. QD, Quantenpunkt; S-Protein, Spike-Protein; SARS-CoV-2, schweres akutes respiratorisches Syndrom, Coronavirus Typ 2

Kohlenstoff-Quantenpunkte

Kohlenstoff-Quantenpunkte (CQDs) können verwendet werden, um Mikroben, Biomoleküle und Infektionen zu erkennen. Darüber hinaus können sie als dominante bildgebende Sonden ( Chemosensoren und Biosensoren) mit antiviraler Aktivität als biokompatible Inaktivierungssysteme für pathogene humane Coronavirus-Infektionen verwendet werden. Die CQDs sind etwa 10 nm groß und weisen eine hohe Löslichkeit in Wasser auf. Sie wurden durch hydrothermale Karbonisierung von Kohlenstoffvorläufern hergestellt. Einige innovative Ansätze zum Nachweis von Coronaviren haben sich auf die Anwendung von CQDs konzentriert. Bei einer Methode wurden die antiviralen Aktivitäten von sieben CQD-Typen verwendet, um Ansteckungen mit dem menschlichen Coronavirus zu heilen. Es wurden verschiedene Arten von CQDs durch hydrothermale Karbonisierung und Konjugation von Boronsäure verwendet. Es wurde offengelegt, dass die Virushemmung möglicherweise auf den Austausch zwischen CQD-operierenden Gruppen mit Eintrittsrezeptoren des Virus zurückzuführen ist [10].

Zirkonium-Quantenpunkte (Zr QDs)

Zirkonium wurde aufgrund seiner Eigenschaften wie mechanische Stabilität, thermische Belastbarkeit und UV-Lichteinfang in vielen biomedizinischen Bereichen als ungiftiger Übergang verwendet. Außerdem hat die Nanogröße von Zr aufgrund seiner großen Oberfläche und der Gefangenschaft elektronischer Zustände im Vergleich zu seinem Bulk-Regime einzigartige physikalische und chemische Aspekte [10].

Im Allgemeinen ist der Einsatz von QDs gegen das Coronavirus aufgrund seiner hervorragenden kurativen Wirksamkeit eine der am besten geeigneten Optionen. Darüber hinaus können QDs als robuste bildgebende Sonde und Sensor in der Diagnose und Prognose eingesetzt werden. Darüber hinaus können die Medikamente auf die Oberfläche von QDs aufgetragen werden, um auf COVID-19 abzuzielen. Dennoch ist Vorsicht geboten, um eine Nierenfiltration und zusätzliche Nebenwirkungen zu vermeiden.

3.2.3. Kohlenstoffbasierte Nanomaterialien

Kohlenstoffmaterialien sind in jedem Aspekt unseres täglichen Lebens funktional, da es sich um reichlich vorhandene und schwerelose Stoffe handelt, die für eine Kombination von Anwendungen verwendet werden können. Nanomaterialien auf Kohlenstoffbasis können basierend auf ihren Dimensionalitäten (D) als Null-D (0D) wie Kohlenstoffpunkte, Ein-D (1D) wie in CNTs und Zwei-D (2D) in Graphen-Nanostrukturen kategorisiert werden . Diese Nanomaterialien behalten auch in extremen Umweltsituationen eine umfassendere Betriebstemperatur, Wahrnehmungsfähigkeit und einen größeren dynamischen Signalumwandlungsbereich bei [24].

Kohlenstoffbasierte Nanomaterialien wurden in großem Umfang bei der Entwicklung einer Plattform für den COVID-19-Nachweis eingesetzt. Ihre herausragenden physikalisch-chemischen und antiviralen Eigenschaften legen nahe, dass Nanomaterialien eine entscheidende Rolle gegen COVID-19 spielen. Diese Nanomaterialien, einschließlich Graphen und Graphenoxid, Kohlenstoff-Quantenpunkt, Kohlenstoff-Nanoröhrchen und Fulleren mit hervorragenden Eigenschaften, hauptsächlich sensorischen, antiviralen und antimikrobiellen Eigenschaften, sind überlegene Optionen mit potenziellen Anwendungen gegen COVID-19 in Biosensoren für die Diagnose, antivirale Beschichtung, luftgetragene Virusfiltration , Gesichtsmaske und Arzneimittelabgabe [10, 24, 30].

 Graphen und Graphenoxid

Die antimikrobiellen und antiviralen Eigenschaften der Nanomaterialien Graphen und Graphenoxid haben zwei Dimensionen, die viel Aufmerksamkeit und Untersuchung erregt haben. Zunächst wurden graphenbasierte Feldeffekttransistoren (FET) als tragbare Sensoren entwickelt, um die COVID-19-Viruslast in klinischen Nasen-Rachen-Proben zu analysieren, wobei einzigartige Antikörper gegen sein Spike-Protein verwendet werden. Die hergestellten FET-Sensoren können das SARS-CoV-2-Spike-Protein in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung und 100 fg mL–1 medizinischem Transfersystem, bei einer Konzentration von 1 fgmL–1 und einer Nachweisgrenze von ~1,6 × 101 pfu mL–1 und erfassen ~2,42 × 10 2 pfu mL-1 für die kultivierte Probe bzw. den medizinischen Test. Dieser Sensor zeigt eine hohe Empfindlichkeit für das Screening und die Diagnose der neuartigen Coronavirus-Krankheit 2019 ohne Probenvorbehandlung. Die Existenz von Graphen führt zu einem verbesserten Signal-Rausch-Verhältnis [10].

Abbildung 12. Schematische Darstellung bestimmter Allotrope von Kohlenstoff-Nanomaterialien für die Entwicklung von Nanobiosensoren.

Kohlenstoff-Nanoröhren

Kohlenstoffnanoröhren (CNTs) wurden aufgrund der folgenden Eigenschaften in großem Umfang in der Biologie und in den biomedizinischen Wissenschaften eingesetzt und eröffnen neue Horizonte für die wissenschaftliche Entwicklung [10]:

• 10− 100 nm Abmessungen;
• antivirale und antimikrobielle Aktivität;
• gute Licht-Wärme-Umwandlungseffizienz;
• großes Oberflächenvolumenverhältnis;
• geringe Dichte;
• kleine Porengröße;
• Flexibilität;
• Beständigkeit gegen Säuren und Basen;
• große mechanische Festigkeit;
• Fähigkeit, reaktive Sauerstoffspezies zu erzeugen ;
• Resistenz gegen Atemtröpfchen;
• biologische Kompatibilität mit mehreren Arzneimitteln.

Kohlenstoffpunkte wurden 2004 gefunden, und sie haben normalerweise Photolumineszenz, Biokompatibilität und hohe Belastbarkeit, was sie für verschiedene Anwendungen prädisponiert, einschließlich Biosensorik und Biobildgebung. Kohlenstoffnanoröhren (CNTs), Graphen und Kohlenstoffpunkte (CDs) können als null-(0D), ein-(1D) und zwei-(2D) dimensionale Kohlenstoffnanomaterialien klassifiziert werden [10, 30].

Abbildung 13. Zukunftsaussichten von CNTs in der Prävention, Diagnose und Behandlung einer SARS-CoV-2-Infektion.

Hoher Speicherplatz, große Oberfläche, hohe Biokompatibilität, hervorragende Durchlässigkeit biologischer Barrieren, angemessene Bioabsorptionsrate, Fähigkeit zur chemischen funktionellen Gruppe von Oberflächen/Röhren mit mehreren Energien und gezielte Biomolekül-Modifikationsstärke sind hervorragende Eigenschaften von CNTs, die neuartige Vorschläge zur Bekämpfung von COVID- 19. In ähnlicher Weise werden CNTs als Diagnosesysteme, Filter und Virusinaktivierungsmittel verwendet [10].

Ein CNT-Größenanreicherungs-Mikrogerät (CNT-STEM) wurde entwickelt, um Viren aus Rohproben anzureichern und zu konzentrieren. CNTs können zur Diagnose von Atemwegsviren, einschließlich SARS-CoV-1 und SARS-CoV-2, verwendet werden. Die Kanalseitenwand in der Mikrovorrichtung wurde aus stickstoffdotierten mehrwandigen CNTs hergestellt, wobei der intratubuläre Raum zwischen CNTs optimiert ist , um der Größe verschiedener Viren zu entsprechen. Mit diesem Gerät wurde der Stamm des Vogelgrippevirus bestimmt. Das CNT-STEM verbessert die Virenisolationsraten und die Erkennungswahrnehmung erheblich. Aufgrund der Einfachheit und Vertrauenswürdigkeit dieser Technik kann sie angepasst werden, um SARS-CoV-2-RNA oder -Proteine nachzuweisen [30, 34].

Abbildung 14. Das Arbeitsprinzip der Virusanreicherung und Konzertierung aus Feldproben. (A) Eine abgelegte Probe, die Viren (violette Kugeln) enthält, wird durch eine Watte oder als Gewebeprobe entnommen. (B) Der Überstand der Feldprobe fließt durch das CNT-STEM, und die Viren werden innerhalb des Geräts angereichert. Einschub (rechts): Illustration der größenbasierten Virusanreicherung durch die ausgerichteten N-MWCNTs. Einschub (unten rechts): SEM-Bild (Maßstab, 100 nm) der H5N2-AIV-Virionen, die in den ausgerichteten N-MWCNTs eingeschlossen sind. Einschub (unten links): Dunkelfeld-TEM-Bild (Maßstab, 100 nm) von angereichertem H5N2-AIV, nachdem die ausgerichteten N-MWCNT-Strukturen aus dem CNT-STEM abgerufen wurden.

Nanodiamanten

Aufgrund ihrer hohen Stabilität und geringen Zytotoxizität haben Nanodiamanten große Aufmerksamkeit für die COVID-19-Diagnostik erhalten. Daher wurden fluoreszierende Nanodiamanten für den Lateral-Flow-Immunoassay von COVID -19 als hochempfindliche Markierung verwendet. Diese Nanodiamanten wurden auf der Testlinie immobilisiert , und ein Mikrowellenfeld wurde verwendet, um ihr Fluoreszenzsignal selektiv vom Hintergrundsignal zu trennen, was die Nachweisempfindlichkeit erheblich verbesserte. Dieser Assay war um 105 empfindlicher als der herkömmliche Lateral-Flow-Assay auf Gold-Nanopartikelbasis. Kohlenstoffbasierte Nanomaterialien können als antivirales Therapeutikum für COVID-19 eingesetzt werden [30].

3.2.4. Magnetische NPs (MNPs)

Vor dem Nachweis werden magnetische NPs (MNPs) typischerweise zum Nachweis von SARS-CoV-2, der Antikörperantwort des Wirts und der Nukleinsäuretrennung verwendet. Es wurde gezeigt, dass mit Kieselsäure beschichtete Eisenoxid-NPs eine signifikante Assoziation mit SARS-CoV-2-RNA haben, da das Virus aufgebrochen wird. Der Magnet wurde verwendet, um die RNA-beschichteten NPs aus der Probenlösung zu isolieren. Diese Methode ist wirtschaftlich und unkompliziert und ermöglicht eine effiziente Extraktion von RNA aus Patientenproben [15, 30].

Ein präziser Nachweis erfordert eine effiziente Extraktion und Trennung von Nukleinsäuren aus Proben, die eine Zielreinigung ermöglichen. In einer Studie wurden superparamagnetische Nanopartikel (80 nm) verwendet, die mit einer komplementären Sonde an die Zielsequenz SARS -CoVs konjugiert waren. Mithilfe eines Magneten können die funktionalisierten superparamagnetischen Nanopartikel Ziel-cDNA aus Proben extrahieren. Die Menge der extrahierten DNA wurde durch PCR erhöht, die unter Verwendung von Silica-beschichteten Fluoreszenz-Nanopartikeln getestet wurde, die mit einer komplementären Sequenz konjugiert waren. Silikabeschichtete Fluoreszenz-NPs erzeugen Fluoreszenzsignale, die direkt mit der Konzentration der Ziel-cDNA korrelieren [30].

Die oberflächenfunktionalisierten MNPs adsorbieren die Nukleinsäure aus der Lyselösung und werden mit Hilfe eines externen Magnetfelds schnell von den meisten Verunreinigungen getrennt. Nach diesem kurzen Vorgang kann die Nukleinsäure zusätzlich durch den Desorptionsprozess im Eluenten von der funktionalisierten Oberfläche der MNPs getrennt werden. Obwohl dieser Prozess viel einfacher und kürzer ist als herkömmliche Verfahren, besteht der unterstützte Extraktionsprozess von MNP immer noch aus mehreren Stufen, was für einen praktischen Nachweis unzureichend ist. Die Zinkferrit-Nanopartikel wurden durch Entladung synthetisiert, und die Nanopartikeloberflächen wurden mit Silica und Carboxyl-modifiziertem Polyvinylalkohol funktionalisiert. Diese Plattform zeigt die Fähigkeit, die virale RNA automatisch aus verschiedenen Probentypen zu entfernen. Es verringert die Funktionsschritte, was eine bedeutende Perspektive für die COVID-19-Diagnostik auf molekularer Ebene darstellt [30, 34].

Für eine mögliche Extraktion und RT-PCR-basierte Diagnose von COVID-19 wird ein einfacheres und zeitgemäßeres MNP-unterstütztes RNA-Extraktionsprotokoll vorgeschlagen. Die MNPs aus Zinkferrit (ZNF) wurden durch die kosteneffiziente Sol-Gel-Selbstverbrennungsroute hergestellt, und danach wurde ihre Oberfläche mit carboxylhaltigen Polymeren ( CPoly ) funktionalisiert. Unter den Magnetmaterialien wurde Zinkferrit aufgrund seiner hohen chemischen Widerstandsfähigkeit, seines sanften magnetischen Verhaltens , seiner unkomplizierten Herstellung und seines biokompatiblen Charakters ausgewählt. Aufgrund der robusten Schnittstelle zwischen Nukleinsäuren und Carboxylgruppen fördern die oberflächenfunktionalisierten MNPs eine schnelle und mögliche virale RNA-Adsorption. Diese kostengünstige und unkomplizierte Technik kann eine qualifizierte Alternative zu herkömmlichen Methoden darstellen [34] .

Abbildung 15. Schematisches Verfahren für das oberflächenfunktionalisierte MNP-unterstützte RNA-Extraktionsprotokoll.

Darüber hinaus gibt es ein einstufiges Nukleinsäureextraktionsverfahren, das insbesondere virale RNA unter Verwendung von polycarboxylfunktionalisierten aminogruppenmodifizierten MNPs (PC-beschichtete NH2-MNP) bindet. Nukleinsäuren wurden unter Verwendung eines Magnetfelds gesammelt und dann durch Zugabe von Waschpuffer von den MNPs freigesetzt. Durch das Fangen von COVID-19-Pseudoviren zeigten Polycarboxyl-funktionalisierte MNPs perfekte Absorption und paramagnetische Eigenschaften durch schnelles Einfangen (30 s magnetisches Einfangen) von Zielen [30, 46].

Abbildung 16: Eine schematische Darstellung des pcMNP- basierten viralen RNA-Extraktionsverfahrens.

3.2.5. Nanozyme

Nanozyme sind unnatürliche Enzyme aus Nanomaterialien mit ähnlicher Effizienz wie natürliche Enzyme. Darüber hinaus haben Nanozyme überlegene katalytische Aktivitäten, schnelle Reaktion und Fähigkeit zur Selbstorganisation, die in großem Umfang für die Diagnose und Behandlung von Krankheiten eingesetzt werden. Ein neuartiger Nanozym-basierter Chemilumineszenz-Papierassay zum schnellen und akuten Nachweis von SARS-CoV-2-Spike-Antigen kombiniert Nanozym- und enzymatischen Chemilumineszenz-Immunoassay mit dem geschaffenen Lateral-Flow-Streifen.

Abbildung 17: (A) Schematische Darstellung des Nanozym-Chemilumineszenz-Papiertests für SARS-CoV-2 S-RBD-Antigen. Erkennung, Trennung und katalytische Verstärkung durch Nanozym-Sonden

Konventionelle Chemilumineszenz -Immundiagnostik nutzt natürliche Proteasen wie HRP oder alkalische Phosphatase, die Einschränkungen wie geringe Lagerbeständigkeit, komplizierte Herstellungsverfahren und hohe Kosten aufzeigen. Der vorgeschlagene Biosensor verwendete Peroxidase-nachahmendes Co-Fe@ hemin- Nanozym anstelle von natürlicher Meerrettichperoxidase (HRP), die das Chemilumineszenzsignal stark verstärken könnte und die Nachweisgrenze von 0,1 ng/ ml erreicht. Es wurde gezeigt, dass das Co-Fe@ hemin-Nanozym im Vergleich zu HRP, das bei Raumtemperatur stabil gehalten werden kann, eine bessere Temperaturstabilität und Schärfe oder Alkalinität aufweist. Dieser Test kann innerhalb von 16 Minuten durchgeführt werden, viel schneller im Vergleich zu den üblichen 1-2 Stunden, die für derzeit verwendete Nukleinsäuretests benötigt werden. Darüber hinaus ist eine Signalerkennung mit der Kamera eines typischen Smartphones möglich. Komponenten für die Nanozym-Synthese sind einfach und leicht erhältlich, was die Gesamtkosten erheblich reduziert [20, 30].

3.2.6. Metallorganisches Gerüst

Poröse Nanomaterialien können zum Nachweis verschiedener Krankheitserreger verwendet werden. Der Analyt, das Pathogen, muss nicht von den porösen Nanomaterialien absorbiert werden; Der Erreger muss jedoch mit der Oberfläche des MOF interagieren, das von verschiedenen NPs modifiziert wird. Durch diese Wechselwirkung können zusätzliche optische Off-On- oder On -Off- Mechanismen optimiert werden, um den Erreger nachzuweisen, und in diesem Fall können verschiedene optisch aktive Komponenten als Quencher oder Aktivatoren eingesetzt werden. In der Frage von SARS-CoV-2 besteht aufgrund der erheblichen Diskrepanzen zwischen den Konzentrationen von SARS-CoV-2 und anderen keine Notwendigkeit, dasselbe genetische Material und dieselbe genetische Sequenz auf der Oberfläche der Maske oder sogar der Kleidung nachzuweisen. Stattdessen kann mit einem zuvor optimierten Fingerabdruck-Fluoreszenzmuster der gleiche Aufmerksamkeitsbereich von SARS-CoV-2 auf der Kontaktfläche von Gas- und Festphase durch optische Veränderungen gemessen werden. Wenn die MOF-basierten Biosensoren außerdem erfolgreich für den Nachweis von HIV-1, H1N1, ZIKA und anderen Krankheitserregern mit beträchtlicher Präzision und LOD funktionieren, dann sollte der morphologie- und optisch basierte Biosensor für den Nachweis von SARS-CoV-2 ebenfalls funktionieren. [26].

4. Herausforderungen und Grenzen von Nanomaterialien

Nanomaterialien können für biomedizinische Anwendungen von großem Wert sein. Sie haben jedoch einige Einschränkungen, wie z. B. Toxizität. Eine der größten Herausforderungen besteht darin, die sichere Verwendung von Nanomaterialien zu gewährleisten. Eine weitere Herausforderung besteht darin, dass sich das Verhalten von Nanomaterialien im Körper ändern kann, wenn sie durch die Bildung von Proteinkorona in den Blutkreislauf gelangen. Daher sind originalgetreue In-vivo-Modelle erforderlich, um das toxikokinetische Verhalten der Nanopartikel im Körper, insbesondere bei Langzeitexposition, ausreichend zu verstehen.

Ein weiteres Problem ist das Fehlen standardisierter Protokolle für die physikalisch-chemische und biologische Definition von Nanomaterialien und das Fehlen einer allgemein vereinbarten Definition eines Nanomaterials. Kapazitäten für die Herstellung im großen Maßstab sind eine weitere Hürde, die für die breitere Kommerzialisierung nanobasierter Formulierungen überwunden werden muss. Aufgrund der vielfältigen Wechselwirkungen zwischen Nanomaterialien und biologischen Systemen ist es sehr anspruchsvoll, das Verhalten dieser Materialien unter physiologischen Bedingungen vorherzusagen. Sobald sie sich im Körper befinden, erreichen die Nanopartikel den Blutkreislauf, eine komplexe Matrix, die Ionen, kleine Moleküle, Proteine und Zellen enthält. [37].

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Test LO 3.1

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