Νανοϋλικά στο σχεδιασμό και την εφαρμογή μεθόδων ανίχνευσης SARS-CoV-2

Περίληψη

Για την καταπολέμηση της τρέχουσας πανδημίας COVID-19, τα νανοϋλικά μπορούν να θεωρηθούν άριστα υποψήφια κατά των ιογενών λοιμώξεων, ιδιαίτερα των CoV, λόγω της ικανότητάς τους να διεισδύουν στα κύτταρα εύκολα, να αλληλεπιδρούν με ιούς και να αποφεύγουν την αναπαραγωγή ιικού γονιδιώματος. Επιπλέον, η χρήση νανοσωματιδίων επιτρέπει την άμεση ανίχνευση μεταδοτικών παραγόντων σε μικροσκοπικούς όγκους δειγμάτων σε ευαίσθητη, ακριβή και γρήγορη μορφή με χαμηλότερο κόστος από τις τρέχουσες τεχνολογίες σε χρήση. Αυτή η πρόοδος στην έγκαιρη ανίχνευση επιτρέπει την ακριβή και γρήγορη θεραπεία.

Λέξεις-κλειδιά: νανοϋλικά, COVID-19, ανίχνευση

1. Εισαγωγή

Η συνεχιζόμενη έκρηξη της νέας νόσου του κορωνοϊού COVID-19 προσελκύει παγκόσμια ανησυχία λόγω της παρατεταμένης διάρκειας επώασης και της σημαντικής μολυσματικότητάς της. Η ταχεία παγκόσμια εξάπλωση της πανδημίας, λόγω του σκληρού οξέος αναπνευστικού SARS-CoV-2, έχει δημιουργήσει μια πιεστική ανάγκη για τη διάγνωση και τη θεραπεία της. Ως αποτέλεσμα, πολλοί ερευνητές προσπάθησαν να βρουν τις πιο αποτελεσματικές και κατάλληλες μεθόδους για τον εντοπισμό και τη θεραπεία του SARS-CoV-2. Η δοκιμή αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης ανάστροφης μεταγραφάσης σε πραγματικό χρόνο (RT-PCR) χρησιμοποιείται επί του παρόντος ως μία από τις πιο αξιόπιστες προσεγγίσεις για την ανίχνευση του νέου ιού. Ωστόσο, αυτή η διαδικασία είναι χρονοβόρα, έντασης εργασίας και απαιτεί εκπαιδευμένους εργαστηριακούς εργαζόμενους. Επιπλέον, παρά την υψηλή οξυδέρκεια και ειδικότητά του, τεκμηριώνονται ψευδώς αρνητικά, ιδιαίτερα σε δείγματα μη ρινοφαρυγγικού επιχρίσματος που αποδίδουν χαμηλότερα ιικά φορτία. Κατά συνέπεια, η ανάπτυξη και η χρήση ταχύτερων και πιο αξιόπιστων μεθόδων φαίνεται κρίσιμη. Τα τελευταία χρόνια, έχουν γίνει πολλές προσπάθειες για την κατασκευή διαφόρων βιοαισθητήρων με βάση νανοϋλικά για την ανίχνευση ιών και βακτηρίων σε κλινικά δείγματα [27, 46].

Απαιτείται ιδιαίτερα ένας διακριτικός τρόπος για τη διάγνωση της νόσου του κορωνοϊού COVID-19 για την καταπολέμηση των υπαρχόντων και επερχόμενων παγκόσμιων κινδύνων για την υγεία. Τα νανοσωματίδια προσφέρουν ευνοϊκή εφαρμογή και σημαντικές προοπτικές να λειτουργήσουν ως πλατφόρμα για γρήγορη διάγνωση ιογενών λοιμώξεων με αυξημένη ευαισθησία. Νανοσωματίδια όπως νανοσωματίδια χρυσού, μαγνητικά νανοσωματίδια και γραφένιο (G) εφαρμόστηκαν για την ανίχνευση του SARS-CoV 2. Έχουν χρησιμοποιηθεί για μοριακές διαδικασίες διάγνωσης και ορολογικές προσεγγίσεις. Τα νανοσωματίδια ενίσχυσαν τη σαφήνεια και συντόμυναν τον χρόνο που απαιτείται για τη διάγνωση. Μπορούν να εκτελεστούν σε μικροσκοπικές συσκευές που ενθαρρύνουν την αυτοδιάγνωση στο σπίτι ή σε μέρη όπως αεροδρόμια και καταστήματα. Μέθοδοι που βασίζονται σε νανοσωματίδια μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανάλυση δειγμάτων μολυσμένων από ιούς από ασθενή, επιφάνεια και αέρα [1].

2. Τρέχουσες μέθοδοι ανίχνευσης του SARS-CoV-2

Συμβατικές μέθοδοι για την ανίχνευση του SARS-CoV-2 είναι η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής (RT-PCR), η αξονική τομογραφία (CT) και ο προσδιορισμός αλληλουχίας επόμενης γενιάς (NGS).1 26, 40] (Εικ. 1). Η RT-PCR και η αξονική τομογραφία θώρακα είναι οι πιο τυπικές διαγνωστικές τεχνικές για την ανίχνευση του COVID-19. Επιπλέον, διάφορες διαγνωστικές μέθοδοι όπως ομαδοποιημένες τακτικά διακεκομμένες σύντομες παλινδρομικές επαναλήψεις (CRISPR) – ειδικό ξεκλείδωμα ενζυμικού ανταποκριτή υψηλής ευαισθησίας (SHERLOCK), ισοθερμική ενίσχυση με τη μεσολάβηση βρόχου αντίστροφης μεταγραφής (RT-LAMP), ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία (ELISA) , και η αλληλουχία είναι υπό ανάπτυξη για βελτιωμένη ανίχνευση του ιού σε ελάχιστο χρονικό διάστημα [1, 9]. Η RT-PCR έχει αναγνωριστεί ως η κορυφαία και πιο αποτελεσματική μέθοδος για την ανίχνευση του κορωνοϊού [1, 26].

Σχήμα 1. Συμβατικές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται επί του παρόντος για την ανίχνευση του σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου του κοροναϊού 2 (SARS-CoV-2). (Α) Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής (RT-PCR). cDNA, συμπληρωματικό DNA. (Β) Αξονική τομογραφία. (Γ) Ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία.

2.1. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής (RT-PCR)

Η RT-PCR χρησιμοποιείται ευρέως για την ανίχνευση του COVID-19. Βασίζεται στη σύνθεση cDNA από γονιδιωματικό RNA και ακολουθείται από ενίσχυση [26, 38]. Η ενίσχυση ελάχιστων ποσοτήτων ιικού γενετικού υλικού σε ένα μείγμα άλλων σειρών νουκλεϊκών οξέων γίνεται αποτελεσματικά με RT-PCR. Αυτή τη στιγμή είναι η τυπική τεχνική χρυσού για την ανίχνευση του SARS-CoV-2 σε δείγματα της ανώτερης αναπνευστικής οδού. Πολλές μελέτες έχουν χρησιμοποιήσει δείγματα ορού, οφθαλμών και κοπράνων για την ανίχνευση με βάση την RT-PCR. Μια σύγχρονη μέθοδος έχει χρησιμοποιήσει δείγματα σάλιου που συλλέγονται μόνοι τους ως μη επεμβατική και ασφαλή τεχνική για τους παρόχους υγειονομικής περίθαλψης πριν κάνουν RT-PCR. Σε αυτή τη μέθοδο, η αντίστροφη μεταγραφάση μεταβάλλει πρώτα το γονιδίωμα του ιού RNA σε DNA χρησιμοποιώντας έναν εκκινητή διαδοχής μικρής αλληλουχίας και τη δημιουργία συμπληρωματικού DNA (cDNA). Στη συνέχεια, μια φθορίζουσα χρωστική ή ένας ανιχνευτής DNA με σήμανση φθορισμού, ειδικής αλληλουχίας, παρατηρεί την ενίσχυση του DNA σε πραγματικό χρόνο. Τέλος, ένα φθορίζον ή ηλεκτρικό σήμα εμφανίζει το cDNA του ιού μετά από διαδοχικούς κύκλους ενίσχυσης [1, 9, 22].

Οι συμβατικές διαδικασίες RT-PCR περιλάμβαναν προσεγγίσεις ενός ή δύο σταδίων. Ενώ οι μέθοδοι ενός σταδίου εμπλέκουν έναν μόνο σωλήνα που περιέχει εκκινητή, η διαδικασία δύο σταδίων χρησιμοποιεί περισσότερους από έναν σωλήνες για τη διεξαγωγή των αντιδράσεων. Παρόλα αυτά, παρέχει μια πιο συνετή και ευέλικτη διαδρομή. Επίσης, μπορεί να αποθηκεύσει cDNA για τον ποσοτικό προσδιορισμό διαφορετικών στόχων με λιγότερα αρχικά υλικά. Ωστόσο, η τυπική μέθοδος για την ανίχνευση του SARS-CoV-2 είναι η προσέγγιση ενός βήματος, καθώς είναι πιο γρήγορη, απαιτεί λιγότερο χειρισμό δειγμάτων, μειώνει τον χρόνο στο πάγκο και μειώνει τα σφάλματα με πιπέτα [9, 43].
Η ανίχνευση που βασίζεται σε RT-PCR συνδέεται επίσης με ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα, τα οποία μπορεί να οφείλονται στο χαμηλό ιικό φορτίο στο λαιμό των ασθενών, στον ακατάλληλο χειρισμό των δειγμάτων RNA ή στην έλλειψη επαρκών εσωτερικών ελέγχων [8, 9, 16]. Το κύριο θέμα της RT-PCR είναι η χαμηλή ευαισθησία της στις σαρώσεις θώρακος λόγω του ανεπαρκούς αριθμού ιών στο αίμα της RT-PCR. Επιπλέον, είναι χαμηλής ευαισθησίας στις σαρώσεις θώρακος λόγω του ανεπαρκούς αριθμού ιών στο αίμα ή της ανακρίβειας του κιτ εργαστηρίου [26].

2.2. Αξονική τομογραφία (CT)

Μια άλλη μέθοδος για την ανίχνευση και τη διαχείριση του COVID-19 είναι η αξονική τομογραφία θώρακα, η οποία εφαρμόζει ακτινογραφία του θώρακα ενός ασθενούς σε διαφορετικές γωνίες. Σύμφωνα με ακτινολογικές αναφορές, τυχόν ασυνήθιστα χαρακτηριστικά στην εκτύπωση αξονικής τομογραφίας μπορεί να οφείλονται σε προσβολή από τον COVID-19. Τυπικά παρατηρούμενα χαρακτηριστικά σε μια σάρωση θώρακος ασθενούς με COVID-19 είναι η θολερότητα από εσμυρισμένο γυαλί (GGO), ειδικά στους περιφερικούς και πιο κατώτερους λοβούς, εδραιώσεις (αύξηση της αδιαφάνειας του παρεγχύματος, που οδηγεί σε κάλυψη των υποκείμενων αγγείων ), ακανόνιστο μοτίβο επίστρωσης (GGO με πάχυνση ενδολοβιακού και μεσολοβιακού διαφράγματος) και γραμμικές αδιαφάνειες. Η CT υψηλής ανάλυσης θα μπορούσε να βοηθήσει στην ανίχνευση των GGO στα πρώιμα στάδια της μόλυνσης [9, 26, 40].

Η ευαισθησία στην αξονική τομογραφία φαίνεται να είναι αυξημένη σε ασθενείς με θετική RT-PCR (86–97% σε διάφορες περιπτωσιολογικές μελέτες) και χαμηλότερη σε ασθενείς με μόνο δομικά και μη αναπνευστικά συμπτώματα (περίπου 50%). Το υπερηχογράφημα έχει χρησιμοποιηθεί ως διαγνωστικό εργαλείο σε ελάχιστο αριθμό περιπτώσεων. Το υπερηχογράφημα έχει πολύ χαμηλή εξειδίκευση και, παρά το γεγονός ότι επηρεάζεται από παράγοντες όπως η ένταση της νόσου, το βάρος του ασθενούς και η επιδεξιότητα του χειριστή, η ευαισθησία εκτιμάται ότι είναι περίπου 75%. Ωστόσο, το υπερηχογράφημα μπορεί να παίζει ρόλο στην παρατήρηση της εξέλιξης της νόσου μέσω της ανίχνευσης χαρακτηριστικών της ενδιάμεσης πνευμονοπάθειας [26].

2.3. ΣΕΡΛΟΚ

Πέρα από τις σαρώσεις RT-PCR και CT, έχουν επίσης αναπτυχθεί διάφορες άλλες τεχνικές ανίχνευσης για SARS-CoV-2. Όπως περιγράφεται από τον Gupta at. all. το SHERLOCK έχει αναπτυχθεί από τους Zhang et al.45 «για την ανίχνευση θραυσμάτων RNA του SARS-CoV-2 με 10–100 αντίγραφα/μl της εισόδου. Η βασική αρχή της διάγνωσης SHERLOCK είναι η ανίχνευση με βάση το CRISPR. Αυτή η δοκιμή μπορεί να πραγματοποιηθεί σε < 60 λεπτά, χωρίς να απαιτούνται συγκεκριμένα όργανα. Επέλεξαν δύο στόχους, το γονίδιο S και το γονίδιο Orf1ab, από το γονιδίωμα SARS-CoV-2. Για να ελαχιστοποιήσουν τη διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με άλλα γονιδιώματα του αναπνευστικού ιού, επέλεξαν επίσης συγκεκριμένες αλληλουχίες-οδηγούς». [9].

2.4. RT-LAMP

Μια βελτιστοποιημένη μέθοδος ανίχνευσης που βασίζεται σε RT-LAMP έχει μεγαλύτερη ευαισθησία από τις παραδοσιακές μεθόδους PT-PCR και χρειάζεται λιγότερο χρόνο (Εικ. 2). Ως αποτέλεσμα, αυτή η διαδικασία μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ταχεία διάγνωση του κοροναϊού και την αύξηση της ικανότητας δοκιμών κατά 2-2,5 φορές [9, 13].

Εικόνα 2. Σύγκριση ροής εργασιών της δοκιμασίας RT-LAMP σε σχέση με το qRT-PCR για επείγουσες περιπτώσεις (εξωτερικοί ασθενείς) και εσωτερικούς ασθενείς. Η ανάλυση RT-LAMP είναι 2–2,5 φορές ταχύτερη από τις δοκιμές qRT-PCR και μπορεί να αποσταλεί σε θερμοκρασία δωματίου.

Ο Gupta et al. συνόψισε τις τρέχουσες τεχνικές που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση μόλυνσης από SARS-CoV-2 στο Σχήμα 39.

Εικόνα 3. Σύγχρονες τεχνικές που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση του σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου του κορωνοϊού 2 (SARS-CoV-2).

3. Νανοϋλικά για ανίχνευση SARS-CoV-2

Η δοκιμή νουκλεϊκού οξέος με αλυσιδωτή αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής-πολυμεράσης (RT-PCR) είναι η τρέχουσα μέθοδος για την ανίχνευση της λοίμωξης COVID-19. Αν και η RT-PCR χρησιμοποιείται ευρέως για την ανίχνευση του COVID-19, υπάρχουν αρκετά ζητήματα [3, 14, 29, 35].

1. Εσφαλμένα αρνητικά αποτελέσματα.
2. Μεγάλοι χρόνοι απόκρισης / Χρονοβόρα.
3. Η RT-PCR δεν είναι σε θέση να ανιχνεύσει ασυμπτωματικούς ασθενείς, καθώς απαιτεί την ύπαρξη παρατηρήσιμου SARS-CoV-2 σε δείγματα που συλλέγονται.
4. Κακή αναλυτική ευαισθησία.
5. Ένταση εργασίας;
6. Τα κέντρα υγειονομικής περίθαλψης σε μη αστικά περιβάλλοντα δεν διαθέτουν επαρκή υποδομή PCR για να φιλοξενήσουν αυξημένη απόδοση δειγμάτων.
7. Ακριβή
8. Η διαθεσιμότητα κιτ και αντιδραστηρίων RT-PCR δεν μπορεί να καλύψει την αυξημένη ζήτηση.

Η παρούσα κατάσταση απαιτεί την ανάπτυξη τεχνικών ανίχνευσης που να είναι γρήγορες, οικονομικά αποδοτικές και εύχρηστες. Για να ξεπεραστούν οι περιορισμοί των παραδοσιακών μεθόδων, απαιτείται μια βελτιωμένη διεπιστημονική προσέγγιση. Οι τεχνολογικές λύσεις που βασίζονται σε νανοϋλικά παρουσιάζουν ποικίλες πιθανές εφαρμογές για την καταπολέμηση του ιού [10, 32].

3.1. Ιδιότητες νανοϋλικών

Τα μοναδικά χαρακτηριστικά των νανοσωματιδίων διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο στην αντιμετώπιση της πανδημίας και τον μετριασμό της μελλοντικής επιδημίας. Τα νανοσωματίδια παρουσιάζουν χαρακτηριστικές ιδιότητες όπως:

• μικροσκοπικό μέγεθος
• διαλυτότητα
• πολυλειτουργικότητα
• στόχος-ικανότητα
• χαρακτηριστικά που ανταποκρίνονται στα ερεθίσματα.
• μεγάλη επιφάνεια
• προσαρμοστικότητα επιφάνειας.

Ως εκ τούτου, έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως για πολλές εφαρμογές σε διάφορους τομείς όπως η αναλυτική χημεία, η φαρμακευτική, η ανίχνευση/βιοαισθητήρα, η βιοτεχνολογία, η νανοϊατρική, η διανομή φαρμάκων, η βιολογική ανίχνευση, η μεταφορά γονιδίων, η οπτική, η επούλωση πληγών, οι εφαρμογές που βασίζονται στην ενέργεια, η γεωργία και περιβαλλοντικές εφαρμογές. Τα νανοσωματίδια ενίσχυσαν αυτές τις εφαρμογές παρέχοντας αυξημένη απόδοση με σημαντική προοπτική για ενσωμάτωση σε μια μικροσκοπική μηχανή, συμπεριλαμβανομένων των φορητών ηλεκτρονικών. Ως εκ τούτου, δείχνουν τις τεράστιες δυνατότητες βελτίωσης της ποιότητας ζωής μέσω της ρύθμισης της εξάπλωσης του ιού μέσω της πρόωρης ανίχνευσης. Τα νανοσωματίδια έχουν τουλάχιστον μία διάσταση στην περιοχή των νανομέτρων (1 nm =10 -9 ) (Εικ. 4) [1, 15, 30, 36].

Εικόνα 4. Κλίμακα νανοσωματιδίων με μερικά παραδείγματα.

Η υψηλή αναλογία επιφάνειας προς όγκο των νανοσωματιδίων, η υψηλή προσρόφηση, τα φαινόμενα κβαντικού μεγέθους και η υψηλή αντιδραστικότητα επιτρέπουν την αποτελεσματική αλληλεπίδραση με τις αναλυόμενες ουσίες του δείγματος. Επιπλέον, έχουν εξαιρετικές ικανότητες πολυπλεξίας, καθιστώντας τις κατάλληλες για ενσωμάτωση σε τεχνολογίες αιχμής για την ανίχνευση ιών. Επιπλέον, τα νανοσωματίδια προσφέρουν ευκολία στη λειτουργικότητα της επιφάνειας, υποδηλώνοντας ότι μπορούν να συνδεθούν πολλαπλοί συνδέτες μέσω ομοιοπολικού ή μη ομοιοπολικού δεσμού, κάτι που βελτιώνει περαιτέρω την εκλεκτικότητα και την ιδιαιτερότητα και μειώνει τον χρόνο ανίχνευσης. Επιπλέον, τα νανοϋλικά μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν ως ετικέτες για τη βελτίωση των σημάτων, κάτι που βοηθά στην ανίχνευση σημάτων πολύ μικρού μεγέθους [32].

3.2. Κατηγορίες νανοϋλικών

Έχουν δημιουργηθεί μια ποικιλία νανοϋλικών για την ανίχνευση και την παρακολούθηση ιών, τα οποία συμβάλλουν στον φωτισμό μηχανισμών μόλυνσης από ιούς, όπως [11]:

• Μεταλλικά νανοσωματίδια, π.χ. νανοσωματίδια χρυσού (ΝΣΧ), νανοσωματίδια αργύρου (ΝΣΑ).
• Νανοσωματίδια οξειδίου μετάλλου, π.χ. μαγνητικά νανοσωματίδια οξειδίου του σιδήρου (Fe 3 O 4 NPs).
• Νανοϋλικά άνθρακα που περιλαμβάνουν 0-διάστατα (0D, π.χ. φουλλερένια (C60), κουκκίδες άνθρακα (C-dots)), 1D (νανομελέτες άνθρακα (CNTs), 2D (π.χ. γραφένιο (G), οξείδιο γραφενίου (GO) και 3D (π.χ. γραφίτης).
• Κβαντικές κουκκίδες (ΚΚ): CdS ΚΚ, CdTe ΚΚ, ΚΚ άνθρακα;
• Πορώδη υλικά: μεταλλικά-οργανικά πλαίσια (MOFs), ομοιοπολικά οργανικά πλαίσια (COFs).
• Πολυμερή: φυσικά πολυμερή (π.χ. χιτοζάνη, κυτταρίνη) και συνθετικά (π.χ. πολυθειοφαίνιο, πολυπυρρόλη).
• Λιπιδικά νανοσωματίδια (LNPs): τριγλυκερίδια, λιπαρά οξέα, στεροειδή και κεριά.

Εικόνα 5. Σχηματικά διαγράμματα που δείχνουν διαφορετικά παραδείγματα μεθόδων ανίχνευσης COV που βασίζονται σε νανοϋλικά. (α) Τα Fluorescent Zr ΚΚ και τα μαγνητικά νανοσωματίδια συζευγνύονται με αντισώματα που συνδέονται ειδικά με τον COV. Παρουσία COV, σχηματίζεται ένα μαγνητικό φθορίζον σύμπλεγμα, το οποίο απομονώνεται μαγνητικά και ανιχνεύεται με μετρήσεις φθορισμού. (β) Οι νανοπαγίδες χρησιμοποιούνται για τη συγκέντρωση του COV και τη βελτίωση της σταθερότητάς τους, διευκολύνοντας έτσι τον εντοπισμό τους. (γ) Η PCR αντίστροφης μεταγραφής πραγματοποιείται παρουσία νανοσωματιδίων, βελτιώνοντας την αποτελεσματικότητα της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης και καταλήγοντας σε καλύτερη ευαισθησία ανίχνευσης αυτής της μεθόδου. (δ) μέθοδος ανίχνευσης COV, η οποία βασίζεται στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ συμπληρωματικού DNA που προέρχεται από COV και ανιχνευτή acpnPNA στην επιφάνεια του Ag NP, που οδηγεί σε διαχωρισμό μεταξύ ΝΣΑ και σε ένα κίτρινο χρώμα που σχετίζεται με τη φωταύγεια του καλά διασκορπισμένου ΝΣΑ, αποκαλύπτοντας περαιτέρω την παρουσία COV.

Εικόνα 6. Διαφορετικά νανοσωματίδια.

Τα νανοϋλικά μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε διάφορους ρόλους για τον COVID-19. Οι Rasmi και όλοι συνοψίζουν τις λειτουργίες και τον πρωταρχικό ρόλο των νανοϋλικών στον παρακάτω πίνακα (Εικ. 7) [30].

Εικόνα 7. Σύνοψη του ρόλου στα νανοϋλικά για το COVID-19.

3.2.1. Gold NPs (ΝΣΧ)

Τα νανοσωματίδια χρυσού (ΝΣΧ) χρησιμοποιούνται ολοένα και περισσότερο σε πλατφόρμες ανίχνευσης SARS-CoV-2 λόγω των αξιοσημείωτων οπτικών ιδιοτήτων τους, όπως αυξημένοι συντελεστές εξαφάνισης και συντονισμένος εντοπισμένος συντονισμός πλασμονίου επιφάνειας (LSPR), επιτρέποντας ξεχωριστή έγχρωμη ανάγνωση με απλό εξοπλισμό ή γυμνό μάτι. Για την ανίχνευση αντισωμάτων SARS-CoV-2 (IgG, IgM ή IgA), έχουν προταθεί αναλύσεις AuNP και φθορισμού που βασίζονται σε νανοσωματίδια [17].

Το νανοσωματίδιο χρυσού (ΝΣΧ) είναι ένα από τα πιο τυπικά χρησιμοποιούμενα νανοϋλικά για γρήγορη διάγνωση. Το νανοσωματίδιο χρυσού χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του δίκλωνου DNA των ιών-στόχων (dsDNA). Συγκεκριμένα, μονόκλωνο DNA (ssDNA) ή ssRNA μπορεί να αλληλεπιδράσει με κιτρικά ιόντα στην επιφάνεια του AuNP. Η προσθήκη αλατιού στο διάλυμα μπορεί να σταθεροποιήσει τα σωματίδια και να αλλάξει το χρώμα. Επιπλέον, εφαρμόστηκε ένας απλός χρωματομετρικός προσδιορισμός υβριδισμού για την ανίχνευση dsDNA του SARS-CoV, που αναπτύχθηκε από ssRNA. Αυτή η ανάλυση μπορεί να δει τον στόχο στα 4,3 nM σε 10 λεπτά χωρίς να χρειάζεται καμία δυσκίνητη συσκευή [18, 30].

Προσέγγιση αλλαγής χρώματος

Μια άλλη ανάλυση εισήγαγε μια μέθοδο για την οπτική ανίχνευση του ιού COVID-19 χωρίς εξελιγμένα εργαλεία. Η χρωματομετρική ανίχνευση σχεδιάστηκε χρησιμοποιώντας τροποποιημένα με θειόλη αντιπληροφοριακά ολιγονουκλεοτίδια (ASOs) επικαλυμμένα AuNP που προορίζονται ρητά για το. Τα τροποποιημένα με θειόλη ASO-cap AuNP συγκεντρώθηκαν επιλεκτικά στην ύπαρξη της αλληλουχίας RNA στόχου SARS-CoV-2 και παρείχαν μια τροποποίηση στον επιφανειακό συντονισμό του πλασμονίου. Το αποτέλεσμα μπορεί να παρατηρηθεί σε 10 λεπτά με όριο ανίχνευσης 0,18 ng/μL [23, 30].

Εικόνα 8: Σχηματική αναπαράσταση για την επιλεκτική ανίχνευση με γυμνό μάτι του RNA του SARS-CoV-2 με τη μεσολάβηση των κατάλληλα σχεδιασμένων AuNP με κάλυψη ASO.

Η αποτελεσματική ανίχνευση του COVID-19 αναπτύχθηκε με την ακινητοποίηση πρωτεϊνών στην επιφάνεια του Au χρησιμοποιώντας τα πολυπεπτίδια που δεσμεύουν το Au. Χρησιμοποιώντας τη βελτιωμένη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη, την πρωτεΐνη SARS-CoV-E και τη στρεπταβιδίνη του πυρήνα του Streptomyces avidinii ως παραδείγματα, η πρωτεΐνη σύντηξης πολυπεπτιδίου που δεσμεύει το Au ακινητοποιήθηκε ρητά στο AuNP και επιδείχθηκαν τα νανομοτίβα πρωτεΐνης στη γυμνή επιφάνεια του Au. Αυτά τα σύμπλοκα αλληλεπιδρούν με το αντίσωμα, με αποτέλεσμα την απορρόφηση και την αλλαγή χρώματος [25, 30].

 Μη επεμβατική προσέγγιση

Η ανίχνευση του COVID-19 χρησιμοποιώντας μη επεμβατικές προσεγγίσεις έχει προταθεί από την εκπνεόμενη αναπνοή χρησιμοποιώντας έναν αισθητήρα που βασίζεται σε AuNP. Ο αισθητήρας αποτελούνταν από διαφορετικά AuNP συνδεδεμένα με οργανικούς συνδέτες και φιλμ ανόργανου νανοϋλικού. Το ανόργανο φιλμ είναι υπεύθυνο για την ηλεκτρική αγωγιμότητα. Επομένως, όταν εκτίθεται στις πτητικές οργανικές ενώσεις (VOCs) από την εκπνεόμενη αναπνοή, το οργανικό φιλμ αντιδρά με τις πτητικές οργανικές ενώσεις, με αποτέλεσμα το ανόργανο φιλμ να διογκώνεται ή να συρρικνώνεται και τις αλλαγές στην ηλεκτρική αγωγιμότητα. Επομένως, αυτός ο μη επεμβατικός αισθητήρας θα μπορούσε ενδεχομένως να χρησιμοποιηθεί για την ταχεία εξέταση του COVID-19 [30, 32].

Προσέγγιση ηλεκτροχημικού υβριδισμού

Μια μέθοδος ηλεκτροχημικού υβριδισμού με βάση το AuNP ορίστηκε χρησιμοποιώντας έναν αισθητήρα γονιδίου που αποτελείται από έναν ανιχνευτή θειολιωμένου DNA που ακινητοποιήθηκε στο ηλεκτρόδιο άνθρακα ΝΣΧ για να υβριδοποιήσει το βιοτινυλιωμένο DNA στόχο. Ένα ηλεκτροχημικό τσιπ παρουσιάστηκε μέσω ενός ηλεκτροδίου άνθρακα που αποτελείται από συστοιχία AuNP. Η πρωτεΐνη του κοροναϊού δεσμεύτηκε σε ένα ηλεκτρόδιο AuNP και τόσο η πρωτεΐνη του κορωνοϊού όσο και οι ελεύθεροι ιοί ανταγωνίζονται για θέσεις δέσμευσης στην ύπαρξη αντισωμάτων. Υπήρξε μια εξαιρετική γραμμική αντίδραση μεταξύ της απόκρισης του αισθητήρα και των συγκεντρώσεων του κορωνοϊού που κυμαίνονταν από 0,001 έως 100 ng mL−1. Η ανάλυση πέτυχε το όριο ανίχνευσης τόσο χαμηλό όσο 1,0 pg mL−1. Η μέθοδος ήταν ενός σταδίου, ευαίσθητη και ακριβής (Εικ. 9) [17, 30].

Εικόνα 9. Τσιπ συστοιχίας ανοσοαισθητήρα COV (α), Τα βήματα κατασκευής ανοσοαισθητήρα (β), η διαδικασία ανίχνευσης του ανταγωνιστικού ανοσοαισθητήρα για τον ιό (γ).

Ανοσοχρωματογραφική προσέγγιση

Μια ανάλυση πλευρικής ροής για την ταχεία ανίχνευση IgM έναντι του COVID-19 σχεδιάστηκε μέσω της προσέγγισης έμμεσης ανοσοχρωματογραφίας. Η νουκλεοπρωτεΐνη SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2 NP) επικαλύφθηκε σε μια αναλυτική μεμβράνη για τη σύλληψη του στόχου και το αντι-ανθρώπινο IgM συζεύχθηκε με το AuNP, λειτουργώντας ως αναφορά ανίχνευσης. Η ανάλυση AuNP-LF έδειξε αξιοσημείωτη επιλεκτικότητα στην ανίχνευση IgM χωρίς παρεμβολές από άλλους ιούς. Κάθε ανάλυση χρειάζεται μόνο 10–20 μL ορού και το αποτέλεσμα μπορεί να ληφθεί εντός 15 λεπτών [12, 30].

3.2.2. Κβαντικές κουκκίδες (ΚΚ)

Οι κβαντικές κουκίδες (ΚΚ) είναι πολύπλευροι μηχανισμοί που μπορούν να πολεμήσουν ενάντια στον ιό COVID-19. Οι κβαντικές κουκκίδες (ΚΚ), επίσης γνωστές ως «νανοϋλικά ημιαγωγών», παίζουν ζωτικό ρόλο στην ανίχνευση του COVID-19. Οι ΚΚ έχουν αναγνωριστεί ως ένας νέος ανιχνευτής φθορισμού για μοριακή απεικόνιση. Το μέγεθος των ΚΚ ποικίλλει από 1 έως 10 nm. Τα εξαιρετικά χαρακτηριστικά των ΚΚ, συμπεριλαμβανομένων των εξαιρετικών οπτικών και ημιαγωγικών ιδιοτήτων, της φωτοσταθερότητας, της υψηλής κβαντικής απόδοσης και του στενού φάσματος εκπομπής με ρυθμιζόμενο μέγεθος, τα έχουν καταστήσει σημαντικό υποψήφιο για λειτουργία ως φθορίζουσα ετικέτα. Λόγω αυτών των εξαιρετικών ιδιοτήτων, οι ΚΚ μπορούν να θεωρηθούν εξαιρετικός παράγοντας για την καταπολέμηση των ιογενών λοιμώξεων. Επιπλέον, η ενσωμάτωση πιθανών βιοσυμβατών φορέων μπορεί να βοηθήσει στη διεπιστημονική μελέτη και να επιτρέψει κλινικές προσεγγίσεις για την καταπολέμηση του ιού. Λόγω των ανώτερων ιδιοτήτων τους, οι ΚΚ είναι πλέον κυρίαρχοι ανιχνευτές απεικόνισης (χημειοαισθητήρες και βιοαισθητήρες) για ανίχνευση [21, 30].

Εικόνα 10. Περιγραφή της Αρχής Λειτουργίας της Λωρίδας AuNP=LF.

Οι ΚΚ χρησιμοποιούνται λόγω της ιχνηλασιμότητας τους κάτω από ένα συγκεκριμένο μήκος κύματος φωτός. Επιπλέον, τα ΚΚ μπορούν να ρυθμιστούν στο επιθυμητό μέγεθος (1–10 nm) και σχήμα που στοχεύει/διεισδύει αποτελεσματικά στον SARS-CoV-2 με εύρος μεγέθους μεταξύ 60 και 140 nm. Επιπλέον, το θετικό επιφανειακό φορτίο των ΚΚ με βάση τον άνθρακα θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για τη δέσμευση/απενεργοποίηση της πρωτεΐνης S του SARS-CoV-2. Επιπλέον, τα κατιονικά επιφανειακά φορτία που επιδεικνύονται από τις ΚΚ αλληλεπιδρούν με τον αρνητικό κλώνο RNA του ιού, κατευθύνοντας την παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου εντός του SARS-CoV-2 [21].

Ένα τσιπ που βασίζεται σε απταμερές RNA συζευγμένο με ΚΚ εισήχθη για ευαίσθητη και ταχεία ανίχνευση της πρωτεΐνης SARS-CoV N με όριο ανίχνευσης 0,1 pg mL−1 σε ένα ανεπτυγμένο τσιπ. Το απταμερές RNA συζευγμένο με ΚΚ μπορεί να συνδεθεί με την πρωτεΐνη SARS-CoV N που είναι ακινητοποιημένη στο τσιπ, δημιουργώντας ένα οπτικό σήμα. Η χρήση ΚΚ με βάση το φθορισμό μπορεί να βοηθήσει τους ερευνητές να σχεδιάσουν ένα εύκολο, ευαίσθητο και γρήγορο διαγνωστικό εργαλείο για το COVID-19 [30, 31].

Εικόνα 11. Σχηματική αναπαράσταση των ενεργειών που ασκούνται από τα ΚΚ στον SARS-CoV-2. ΚΚ, κβαντική κουκκίδα. πρωτεΐνη S, πρωτεΐνη ακίδας; SARS-CoV-2, σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο κοροναϊός τύπου 2

Κβαντικές κουκκίδες άνθρακα

Οι κβαντικές κουκκίδες άνθρακα (ΚΚΚ) μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευση μικροβίων, βιομορίων και λοιμώξεων. Επιπλέον, μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως βιοσυμβατά συστήματα αδρανοποίησης για παθογόνες λοιμώξεις από ανθρώπινο κορωνοϊό ως κυρίαρχοι ανιχνευτές απεικόνισης (χημειοαισθητήρες και βιοαισθητήρες) με αντιική δράση. Τα ΚΚΚ είναι περίπου 10 nm με υψηλή διαλυτότητα στο νερό, κατασκευάστηκαν μέσω υδροθερμικής ενανθράκωσης προδρόμων ουσιών άνθρακα. Ορισμένες καινοτόμες προσεγγίσεις για την ανίχνευση κοροναϊών έχουν επικεντρωθεί στην εφαρμογή των ΚΚΚ. Σε μία μέθοδο, οι αντιικές δραστηριότητες επτά τύπων ΚΚΚ χρησιμοποιήθηκαν για τη θεραπεία των μεταδοτικών λοιμώξεων από τον ανθρώπινο κορωνοϊό. Χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικά είδη ΚΚΚ με υδροθερμική ενανθράκωση και σύζευξη βορονικού οξέος. Αποκαλύφθηκε ότι η αναστολή του ιού πιθανώς οφείλεται στην ανταλλαγή μεταξύ των λειτουργικών ομάδων ΚΚΚ με υποδοχείς εισόδου του ιού [10].

Κβαντικές κουκκίδες ζιρκονίου (Zr ΚΚ)

Το ζιρκόνιο, λόγω των ιδιοτήτων του όπως η μηχανική σταθερότητα, η θερμική ανθεκτικότητα και η δέσμευση του φωτός UV, έχει χρησιμοποιηθεί σε πολλούς βιοϊατρικούς τομείς ως μη τοξική μετάβαση. Εξάλλου, το νανομέγεθος του Zr έχει μοναδικές φυσικές και χημικές πτυχές λόγω της μεγάλης επιφάνειάς του και της αιχμαλωσίας ηλεκτρονικών καταστάσεων σε σύγκριση με το καθεστώς χύδην του [10].

Γενικά, η χρήση των ΚΚ κατά του κορωνοϊού είναι μια από τις πιο κατάλληλες επιλογές λόγω της εξαιρετικής θεραπευτικής του αποτελεσματικότητας. Επιπλέον, τα ΚΚ μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως ισχυρός ανιχνευτής απεικόνισης και αισθητήρας στη διάγνωση και την προγνωστική. Επιπλέον, τα φάρμακα μπορούν να επικαλυφθούν στην επιφάνεια των ΚΚ για να στοχεύσουν τον COVID-19. Ωστόσο, θα πρέπει να δίνεται προσοχή για να αποφευχθεί η νεφρική διήθηση και πρόσθετες παρενέργειες.

3.2.3. Νανοϋλικά με βάση τον άνθρακα

Τα υλικά άνθρακα είναι λειτουργικά σε κάθε πτυχή της καθημερινότητάς μας επειδή είναι άφθονα και αβαρή υφάσματα που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για συνδυασμό εφαρμογών. Τα νανοϋλικά με βάση τον άνθρακα μπορούν να κατηγοριοποιηθούν με βάση τις διαστάσεις τους (D) ως zero-D (0D) όπως κουκκίδες άνθρακα, one-D (1D) όπως στα CNT και δύο-D (2D) σε νανοδομές γραφενίου. Αυτά τα νανοϋλικά διατηρούν πιο εξαντλητική λειτουργική θερμοκρασία, οξυδέρκεια και μεγαλύτερο εύρος δυναμικού σήματος μεταγωγής ακόμη και σε ακραίες περιβαλλοντικές καταστάσεις [24].

Τα νανοϋλικά με βάση τον άνθρακα έχουν χρησιμοποιηθεί εκτενώς για την ανάπτυξη μιας πλατφόρμας για την ανίχνευση του COVID-19. Τα εξαιρετικά φυσικοχημικά και αντιικά χαρακτηριστικά τους υποδηλώνουν ότι τα νανοϋλικά διαδραματίζουν ζωτικό ρόλο κατά του COVID-19. Αυτά τα νανοϋλικά, όπως το γραφένιο και το οξείδιο του γραφενίου, η κβαντική κουκκίδα άνθρακα, ο νανοσωλήνας άνθρακα και το φουλερένιο με εξαιρετικές ιδιότητες κυρίως αισθητικής, αντιιικές και αντιμικροβιακές ιδιότητες, είναι ανώτερες επιλογές με πιθανές εφαρμογές κατά του COVID-19 σε βιοαισθητήρες για διάγνωση, αντιική επικάλυψη, διήθηση ιού με αέρα , μάσκα προσώπου και χορήγηση φαρμάκου [10, 24, 30].

 Γραφένιο και οξείδιο του γραφενίου

Οι αντιμικροβιακές και αντιικές ιδιότητες του νανοϋλικού γραφενίου και οξειδίου του γραφενίου έχουν δύο διαστάσεις που αιχμαλώτισαν πολλή ευαισθητοποίηση και εξέταση. Πρώτον, τα τρανζίστορ φαινομένου πεδίου με βάση το γραφένιο (FET) ως πόσιμοι αισθητήρες έχουν αναπτυχθεί για την ανάλυση του ιικού φορτίου του COVID-19 σε κλινικά ρινοφαρυγγικά δείγματα, χρησιμοποιώντας μοναδικά αντισώματα κατά της πρωτεΐνης ακίδας. Οι κατασκευασμένοι αισθητήρες FET μπορούν να πιάσουν την πρωτεΐνη ακίδας SARS-CoV-2 σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά και σύστημα ιατρικής μεταφοράς 100 fg mL− 1, σε επίπεδο συγκέντρωσης 1fgmL− 1 και όριο ανίχνευσης ~1,6 × 101 pfu mL-1 και ~2,42 × 10 2 pfu mL-1 για το καλλιεργημένο δείγμα και την ιατρική δοκιμή, αντίστοιχα. Αυτός ο αισθητήρας δείχνει ότι είναι εξαιρετικά ευαίσθητος στον προσυμπτωματικό έλεγχο και τη διάγνωση της νέας νόσου του κοροναϊού 2019 χωρίς καμία προκαταρκτική αγωγή δείγματος. Η ύπαρξη γραφενίου οδηγεί σε βελτιωμένη αναλογία σήματος προς θόρυβο [10].

Εικόνα 12. Σχηματική απεικόνιση ορισμένων αλλοτροπών νανοϋλικών άνθρακα για ανάπτυξη νανοβιοαισθητήρα.

Νανοσωλήνες άνθρακα

Οι νανοσωλήνες άνθρακα (CNTs) εφαρμόστηκαν ευρέως για τη βιολογία και τις βιοϊατρικές επιστήμες λόγω των ακόλουθων ιδιοτήτων και ανοίγουν νέους ορίζοντες για επιστημονική ανάπτυξη [10]:

• 10− 100 nm διαστάσεις
• αντιική και αντιμικροβιακή δράση.
• καλή απόδοση μετατροπής φωτός-θερμότητας.
• μεγάλη αναλογία όγκου επιφάνειας.
• ελαφρά πυκνότητα
• μικρό μέγεθος πόρων
• ευκαμψία
• αντοχή σε οξέα και βάσεις.
• μεγάλη μηχανική αντοχή
• ικανότητα δημιουργίας αντιδραστικών ειδών οξυγόνου.
• αντίσταση στα αναπνευστικά σταγονίδια.
• βιολογική συμβατότητα με πολλά φάρμακα.

Οι κουκκίδες άνθρακα βρέθηκαν το 2004 και συνήθως έχουν φωτοφωταύγεια, βιοσυμβατότητα και υψηλή ανθεκτικότητα, προδιαθέτοντάς τους σε ποικίλες εφαρμογές, συμπεριλαμβανομένου του βιοαισθητήρα και της βιοαπεικόνισης. Οι νανοσωλήνες άνθρακα (CNTs), το γραφένιο και οι κουκκίδες άνθρακα (CD) μπορούν να ταξινομηθούν ως μηδενικά (0D), μονο(1D) και δισδιάστατα νανοϋλικά άνθρακα [10, 30].

Εικόνα 13. Μελλοντικές προοπτικές των CNT στην πρόληψη, διάγνωση και θεραπεία της λοίμωξης SARS-CoV-2.

Ο υψηλός χώρος αποθήκευσης, η υψηλή επιφάνεια, η υψηλή βιοσυμβατότητα, η εξαιρετική διαπερατότητα των βιολογικών φραγμών, ο λογικός ρυθμός βιοαπορρόφησης, η ικανότητα πολλαπλής ενέργειας χημικής λειτουργικής ομάδας επιφάνειας/σωλήνα και η στοχευμένη ισχύς τροποποίησης βιομορίων είναι εξαιρετικές ιδιότητες των CNT που παρέχουν νέες προτάσεις για την αντιμετώπιση του COVID- 19. Ομοίως, οι CNT χρησιμοποιούνται ως συστήματα διάγνωσης, φιλτραρίσματος και παράγοντας απενεργοποίησης ιών [10].

Μια μικροσυσκευή εμπλουτισμού με δυνατότητα ρύθμισης μεγέθους CNT (CNT-STEM) σχεδιάστηκε για τον εμπλουτισμό και τη συγκέντρωση ιών από ακατέργαστα δείγματα. Οι CNT μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη διάγνωση ιών του αναπνευστικού, συμπεριλαμβανομένων των SARS-CoV-1 και SARS-CoV-2. Το πλευρικό τοίχωμα καναλιού στη μικροσυσκευή κατασκευάστηκε από πολυτοιχώματα CNT με πρόσμειξη αζώτου, όπου ο ενδοσωληνικός χώρος μεταξύ των CNT είναι βελτιστοποιημένος ώστε να αντιστοιχεί στο μέγεθος διαφορετικών ιών. Με τη χρήση αυτής της συσκευής, προσδιορίστηκε το στέλεχος του ιού της γρίπης των πτηνών. Το CNT-STEM βελτιώνει σημαντικά τα ποσοστά απομόνωσης του ιού και την αντιληπτικότητα ανίχνευσης. Λόγω της ευκολίας και της αξιοπιστίας αυτής της τεχνικής, μπορεί να προσαρμοστεί ώστε να ανιχνεύει RNA ή πρωτεΐνες SARS-CoV-2 [30, 34].

Εικόνα 14. Η αρχή λειτουργίας του εμπλουτισμού του ιού και του συντονισμού από δείγματα πεδίου. (Α) Ένα αρχειοθετημένο δείγμα που περιέχει ιούς (μωβ σφαίρες) συλλέγεται από βαμβάκι ή ως δείγμα ιστού. (Β) Το υπερκείμενο του δείγματος πεδίου ρέει μέσω του CNT-STEM και οι ιοί εμπλουτίζονται μέσα στη συσκευή. Ένθετο (δεξιά): Απεικόνιση εμπλουτισμού ιών βάσει μεγέθους από τα ευθυγραμμισμένα N-MWCNT. Ένθετο (κάτω δεξιά): Εικόνα SEM (γραμμή κλίμακας, 100 nm) των ιοσωμάτων H5N2 AIV που έχουν παγιδευτεί μέσα στα ευθυγραμμισμένα N-MWCNT. Ένθετο (κάτω αριστερά): Εικόνα TEM σκοτεινού πεδίου (γραμμή κλίμακας, 100 nm) εμπλουτισμένου H5N2 AIV μετά την ανάκτηση των ευθυγραμμισμένων δομών N-MWCNT από το CNT-STEM.

Νανοδιαμάντια

Λόγω της υψηλής σταθερότητάς τους και της χαμηλής κυτταροτοξικότητάς τους, τα νανοδιαμάντια έχουν λάβει σημαντική προσοχή για τη διάγνωση του COVID-19. Ως εκ τούτου, τα φθορίζοντα νανοδιαμάντια χρησιμοποιήθηκαν για τον ανοσοπροσδιορισμό πλευρικής ροής COVID-19 ως υπερευαίσθητη ετικέτα. Αυτά τα νανοδιαμάντια ακινητοποιήθηκαν στη γραμμή δοκιμής και χρησιμοποιήθηκε ένα πεδίο μικροκυμάτων για να διαχωρίσει επιλεκτικά το σήμα φθορισμού τους από το σήμα φόντου, γεγονός που ενίσχυσε σημαντικά την ευαισθησία ανίχνευσης. Αυτή η ανάλυση ήταν 105 πιο ευαίσθητη από την παραδοσιακή ανάλυση πλευρικής ροής που βασίζεται σε νανοσωματίδια χρυσού. Τα νανοϋλικά με βάση τον άνθρακα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως αντιιικοί θεραπευτικοί παράγοντες για το COVID-19 [30].

3.2.4. Μαγνητικά NPs (ΜΝΣ)

Πριν από την ανίχνευση, τα μαγνητικά NPs (ΜΝΣ) χρησιμοποιούνται συνήθως για την ανίχνευση του SARS-CoV-2, την απόκριση αντισώματος ξενιστή και τον διαχωρισμό νουκλεϊκών οξέων. Αποδείχθηκε ότι τα επικαλυμμένα με πυρίτιο NP οξειδίου του σιδήρου έχουν σημαντική συσχέτιση με το RNA του SARS-CoV-2, καθώς οι σπασμένοι ανοίγουν τον ιό. Ο μαγνήτης χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση των επικαλυμμένων με RNA NP από το διάλυμα του δείγματος. Αυτή η μέθοδος είναι οικονομική και απλή, επιτρέποντας την αποτελεσματική εξαγωγή RNA από δείγματα ασθενών [15, 30].

Η ακριβής ανίχνευση απαιτεί αποτελεσματική εκχύλιση και διαχωρισμό των νουκλεϊκών οξέων από τα δείγματα, επιτρέποντας τον καθαρισμό του στόχου. Σε μία μελέτη χρησιμοποιήθηκαν υπερπαραμαγνητικά νανοσωματίδια (80 nm) συζευγμένα με έναν συμπληρωματικό ανιχνευτή στην αλληλουχία στόχο SARS-CoV. Χρησιμοποιώντας έναν μαγνήτη, τα λειτουργικά υπερπαραμαγνητικά νανοσωματίδια μπορούν να εξαγάγουν cDNA στόχο από δείγματα. Η ποσότητα του εξαγόμενου DNA ενισχύθηκε μέσω PCR η οποία δοκιμάστηκε χρησιμοποιώντας νανοσωματίδια φθορισμού επικαλυμμένα με πυρίτιο συζευγμένα με μια συμπληρωματική αλληλουχία. Τα επικαλυμμένα με πυρίτιο NP φθορισμού παράγουν σήματα φθορισμού που σχετίζονται άμεσα με τη συγκέντρωση του cDNA στόχο [30].

Τα επιφανειακά λειτουργικά MNP προσροφούν το νουκλεϊκό οξύ από το διάλυμα λύσης και διαχωρίζονται γρήγορα από τις περισσότερες μολύνσεις με τη βοήθεια ενός εξωτερικού μαγνητικού πεδίου. Ακολουθώντας αυτή τη σύντομη διαδικασία, το νουκλεϊκό οξύ μπορεί επιπρόσθετα να διαχωριστεί από την λειτουργική επιφάνεια των MNP με τη διαδικασία εκρόφησης στο μέσο έκλουσης. Ωστόσο, αν και αυτή η διαδικασία είναι πολύ πιο εύκολη και συντομότερη από τις παραδοσιακές διαδικασίες, η υποβοηθούμενη διαδικασία εξαγωγής του MNP εξακολουθεί να αποτελείται από πολλά στάδια, τα οποία είναι ανεπαρκή για πρακτική ανίχνευση. Τα νανοσωματίδια φερρίτη ψευδαργύρου συντέθηκαν με εκκένωση και οι επιφάνειες των νανοσωματιδίων λειτουργικοποιήθηκαν με πυρίτιο και τροποποιημένη με καρβοξυλική πολυβινυλική αλκοόλη. Αυτή η πλατφόρμα δείχνει την ικανότητα αυτόματης αφαίρεσης του ιικού RNA από διάφορους τύπους δειγμάτων. Μειώνει τα λειτουργικά βήματα, γεγονός που παρουσιάζει μια σημαντική προοπτική για διαγνωστικά σε μοριακό επίπεδο COVID-19 [30, 34].

Ένα πιο απλό και σύγχρονο πρωτόκολλο υποβοηθούμενης εξαγωγής RNA του MNP προτείνεται για πιθανή εξαγωγή και διάγνωση με βάση την RT-PCR του COVID-19. Τα MNP του φερρίτη ψευδαργύρου (ZNF) κατασκευάστηκαν με την οικονομική οδό αυτόματης καύσης sol-gel και στη συνέχεια, η επιφάνειά του λειτουργικοποιήθηκε με πολυμερή που περιέχουν καρβοξυλικά (CPoly). Μεταξύ των μαγνητικών υλικών, ο φερρίτης ψευδάργυρος επιλέχθηκε λόγω της υψηλής χημικής ανθεκτικότητας, της ομαλής μαγνητικής συμπεριφοράς, της απλής προετοιμασίας και του βιοσυμβατού χαρακτήρα του. Λόγω της ισχυρής διεπαφής μεταξύ νουκλεϊκών οξέων και καρβοξυλικών ομάδων, τα επιφανειακά λειτουργικά MNP προάγουν τη γρήγορη και πιθανή προσρόφηση του ιικού RNA. Αυτή η οικονομικά αποδοτική και απλή τεχνική μπορεί να προσφέρει μια κατάλληλη εναλλακτική λύση για τις συμβατικές μεθόδους34 .

Εικόνα 15. Σχηματική διαδικασία για το πρωτόκολλο υποβοηθούμενης εξαγωγής RNA MNP με λειτουργική επιφάνεια.

Επιπλέον, υπάρχει μια διαδικασία εκχύλισης νουκλεϊκού οξέος ενός σταδίου που συνδέει ιδιαίτερα το ιικό RNA χρησιμοποιώντας πολυκαρβοξυλικά λειτουργικά τροποποιημένα με αμινομάδα MNP (επικαλυμμένα με PC NH2-MNP). Τα νουκλεϊκά οξέα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μαγνητικό πεδίο και στη συνέχεια απελευθερώθηκαν από τα MNP με την προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης. Με τη σύλληψη ψευδοϊών COVID-19, τα πολυκαρβοξυλικά λειτουργικά MNP εμφάνισαν τέλεια απορρόφηση και παραμαγνητικές ιδιότητες μέσω γρήγορης σύλληψης (μαγνητική σύλληψη 30 δευτερολέπτων) στόχων [30, 46].

Εικόνα 16: Μια σχηματική αναπαράσταση της μεθόδου εκχύλισης ιικού RNA που βασίζεται σε pcMNP.

3.2.5. Νανοένζυμα

Τα νανοένζυμα είναι αφύσικα ένζυμα που αποτελούνται από νανοϋλικά με παρόμοια αποτελεσματικότητα με τα φυσικά ένζυμα. Επιπλέον, τα νανοένζυμα έχουν ανώτερη καταλυτική δράση, γρήγορη απόκριση και ικανότητα αυτοσυναρμολόγησης, που χρησιμοποιούνται ευρέως για τη διάγνωση και τη θεραπεία ασθενειών. Μια νέα ανάλυση χαρτιού χημειοφωταύγειας βασισμένη σε νανοζύμα για ταχεία και οξεία ανίχνευση αντιγόνου ακίδας SARS-CoV-2 συνδυάζει την ανοσοδοκιμασία νανοζυμικής και ενζυμικής χημειοφωταύγειας με τη λωρίδα πλευρικής ροής που δημιουργήθηκε.

Εικόνα 17: (Α) Σχηματική απεικόνιση της δοκιμής χαρτιού χημειοφωταύγειας νανοενζύμου για αντιγόνο SARS-CoV-2 S-RBD. Αναγνώριση, διαχωρισμός και καταλυτική ενίσχυση από ανιχνευτές νανοζύμων.

Η συμβατική ανοσοδιάγνωση χημειοφωταύγειας χρησιμοποιεί φυσικές πρωτεάσες όπως η HRP ή η αλκαλική φωσφατάση που αποκαλύπτουν περιορισμούς όπως η σπάνια ανθεκτικότητα αποθήκευσης, περίπλοκες μεθόδους παρασκευής και υψηλό κόστος. Ο προτεινόμενος βιοαισθητήρας χρησιμοποίησε νανοένζυμο Co-Fehemin που μιμείται την υπεροξειδάση αντί για φυσική υπεροξειδάση χρένου (HRP) που θα μπορούσε να ενισχύσει σημαντικά το σήμα χημειοφωταύγειας φτάνοντας το όριο ανίχνευσης των 0,1 ng/mL. Το νανοένζυμο Co-Fe@hemin αποδείχθηκε ότι έχει καλύτερη σταθερότητα για τη θερμοκρασία και την οξύτητα ή την αλκαλικότητα σε σύγκριση με το HRP, το οποίο μπορεί να διατηρηθεί σταθερά σε θερμοκρασία δωματίου. Αυτή η δοκιμή μπορεί να διεξαχθεί εντός 16 λεπτών, πολύ πιο γρήγορα σε σύγκριση με τις συνήθεις 1-2 ώρες που απαιτούνται για τις τρέχουσες δοκιμές νουκλεϊκού οξέος. Επιπλέον, η ανίχνευση σήματος είναι δυνατή χρησιμοποιώντας την κάμερα ενός τυπικού smartphone. Τα συστατικά για τη σύνθεση νανοζύμων είναι εύκολα και εύκολα αποκτήσιμα, μειώνοντας σημαντικά το συνολικό κόστος [20, 30].

3.2.6. Μεταλλικό-Οργανικό Πλαίσιο

Τα πορώδη νανοϋλικά μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευση διαφορετικών παθογόνων. Η αναλυόμενη ουσία, το παθογόνο, δεν χρειάζεται να απορροφηθεί από τα πορώδη νανοϋλικά. Ωστόσο, το παθογόνο πρέπει να αλληλεπιδράσει με την επιφάνεια του MOF που τροποποιούν διαφορετικά NP. Με αυτήν την αλληλεπίδραση, μπορούν να βελτιστοποιηθούν πρόσθετοι οπτικοί μηχανισμοί Off-On ή On-Off για την ανίχνευση του παθογόνου και σε αυτή την περίπτωση, διάφορα οπτικά ενεργά συστατικά μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως σβηστές ή ενεργοποιητές. Στο θέμα του SARS-CoV-2, δεν υπάρχει ανάγκη ανίχνευσης του ίδιου γενετικού υλικού και γενετικής αλληλουχίας στην επιφάνεια της μάσκας ή ακόμα και των ρούχων λόγω των σημαντικών διαφορών μεταξύ των συγκεντρώσεων του SARS-CoV-2 με άλλα. Αντίθετα, χρησιμοποιώντας ένα μοτίβο φθορισμού δακτυλικών αποτυπωμάτων, το οποίο έχει βελτιστοποιηθεί στο παρελθόν, το ίδιο εύρος προσοχής του SARS-CoV-2 στην επιφάνεια επαφής των φάσεων αερίου και στερεών μπορεί να μετρηθεί με οπτικές αλλαγές. Επιπλέον, εάν οι βιοαισθητήρες που βασίζονται στο MOF λειτουργούν επιτυχώς για ανιχνεύσεις HIV-1, H1N1, ZIKA και άλλων παθογόνων μικροοργανισμών με μεγάλη ακρίβεια και LOD, τότε ο βιοαισθητήρας μορφολογίας και οπτικής βάσης για ανίχνευση SARS-CoV-2 θα πρέπει επίσης να λειτουργήσει. [26].

4. Προκλήσεις και περιορισμοί των νανοϋλικών

Τα νανοϋλικά μπορεί να είναι σημαντικά πολύτιμα για βιοϊατρικές εφαρμογές. Ωστόσο, έχουν κάποιους περιορισμούς, όπως η τοξικότητα. Μία από τις σημαντικές προκλήσεις είναι η διασφάλιση της ασφαλούς χρήσης των νανοϋλικών. Μια άλλη πρόκληση είναι ότι η συμπεριφορά των νανοϋλικών στο σώμα μπορεί να αλλάξει όταν φτάσουν στην κυκλοφορία του αίματος λόγω του σχηματισμού πρωτεϊνικών κορώνων. Έτσι, τα πιστά in vivo μοντέλα απαιτείται να κατανοήσουν επαρκώς την τοξικοκινητική συμπεριφορά των νανοσωματιδίων στο σώμα, ιδιαίτερα για μακροχρόνια έκθεση.

Ένα άλλο πρόβλημα είναι η απουσία τυποποιημένων πρωτοκόλλων για τον φυσικοχημικό και βιολογικό ορισμό των νανοϋλικών και η έλλειψη ενός καθολικά συμφωνημένου ορισμού του νανοϋλικού. Η ικανότητα παραγωγής μεγάλης κλίμακας είναι ένα άλλο εμπόδιο που πρέπει να ξεπεραστεί για την ευρύτερη εμπορευματοποίηση σκευασμάτων με βάση νανο. Λόγω των πολύπλευρων ανταλλαγών μεταξύ νανοϋλικών και βιολογικών συστημάτων, είναι πολύ απαιτητικό να προβλεφθεί η συμπεριφορά αυτών των υλικών υπό φυσιολογικές συνθήκες. Μόλις εισέλθουν στο σώμα, τα νανοσωματίδια φτάνουν στην κυκλοφορία του αίματος, μια σύνθετη μήτρα που περιέχει ιόντα, μικρά μόρια, πρωτεΐνες και κύτταρα. [37].

---

Τεστ LO 3.1

---

Βιβλιογραφικές αναφορές

1. Abdelhamid H., and Badr G., (2021). Nanobiotechnology as a platform for the diagnosis of COVID‐19: a review. Nanotechnology for Environmental Engineering 6:19 https://doi.org/10.1007/s41204-021-00109-0
2. Abraham AM., Kannangai R., and Sridharan G., (2008). Nanotechnology: A new frontier in virus detection in clinical practice. Indian Journal of Medical Microbiology, 26(4): 297-301
3. Alhalaili B., Popescu I.N., Kamoun O., Alzubi F., Alawadhia S., Vidu R. (2020) Nanobiosensors for the detection of novel coronavirus 2019-nCoV and other pandemic/Epidemic Respiratory viruses: A review. Sensors 2020, 20, 6591. [CrossRef]
4. Alimardani V., Abolmaali S., Tamaddon A., (2021). Recent Advances on Nanotechnology-Based Strategies for Prevention, Diagnosis, and Treatment of Coronavirus Infections. Journal of Nanomaterials Volume 2021, Article ID 9495126, 20 pages https://doi.org/10.1155/2021/9495126
5. Alphandery E., (2020). The Potential of Various Nanotechnologies for Coronavirus Diagnosis/Treatment Highlighted through a Literature Analysis. Bioconjugate Chem. 2020, 31, 1873−1882. https://dx.doi.org/10.1021/acs.bioconjchem.0c00287
6. Bendavid E., Mulaney B., Sood N., Shah S., Ling E., Bromley-Dulfano R. (2020). COVID-19 Antibody Seroprevalence in Santa Clara County, California. MedRxiv
7. Carter L. J., Garner L. V., Smoot J. W., Li Y., Zhou Q., Saveson C. J., et al. (2020). Assay techniques and test development for COVID-19 diagnosis. ACS Cent. Sci. 6, 591–605. doi: 10.1021/acscentsci.0c00501
8. Di Paolo M., Iacovelli A., Olmati F., Menichini I., Oliva A., Carnevalini M., et al. (2020). False-negative RT-PCR in SARS-CoV-2 disease: experience from an Italian COVID-19 unit. ERJ Open Res. 6, 324–2020. doi: 10.1183/23120541.00324-2020
9. Eftekhari A., Alipour M., Chodari L., Maleki Dizaj S., Ardalan M., Samiei M., Sharifi S., Zununi Vahed S., Huseynova I., Khalilov R. et al. (2021). A Comprehensive Review of Detection Methods for SARS-CoV-2. Microorganisms, 9, 232. https://doi.org/10.3390/ microorganisms9020232
10. Ghaemi F., Amiri A., Bajuri M., Yuhana N., Ferrara M., (2021), Role of different types of nanomaterials against diagnosis, prevention and therapy of COVID-19. Sustainable Cities and Society 72 (2021) 103046
11. Gupta R., Sagar P., Priyadarshi N., Kaul S., Sandhir R., Rishi V. and Singhal N.K. (2020). Nanotechnology-Based Approaches for the Detection of SARS-CoV-2. Front. Nanotechnol. 2:589832. doi: 10.3389/fnano.2020.589832
12. Huang C., Wen T., Shi F.J., Zeng X.Y., Jiao Y.J., (2020). Rapid Detection of IgM Antibodies against the SARS-CoV-2 Virus via Colloidal Gold Nanoparticle-Based Lateral-Flow Assay. ACS Omega 2020, 5, 12550–12556.
13. Jiang M., Pan W., Arasthfer A., Fang W., Ling L., Fang, H., et al. (2020). Development and validation of a rapid, single-step reverse transcriptase loop- mediated isothermal amplification (RT-LAMP) system potentially to be used for reliable and high-throughput screening of COVID-19. Front. Cell. Infect. Microbiol. 10:331. doi: 10.3389/fcimb.2020.00331
14. Jindal S., and Gopinath P., (2020) Nano Ex. 1 022003
15. Kang J., Tahir A., Wang H., Chang J. (2021). Applications of nanotechnology in virus detection, tracking, and infection mechanisms. WIREs Nanomed Nanobiotechnol. 2021;13:e1700. https://doi.org/10.1002/ wnan.1700
16. Kelly J. C., Dombrowksi M., O’Neil-Callahan M., Kernberg A. S., Frolova A. I., and Stout M. J. (2020). False-negative testing for severe acute respiratory syndrome coronavirus 2: consideration in obstetrical care. Am. J. Obstet. Gynecol. 2(Suppl. 3):100130. doi: 10.1016/j.ajogmf.2020.100130
17. Layqah L.A., Eissa S. (2019). An Electrochemical Immunosensor for the Corona Virus Associated with the Middle East Respiratory Syndrome Using an Array of Gold Nanoparticle-Modified Carbon Electrodes. Microchimica Acta 2019, 186, 224.
18. Lew T., Aung K., Ow S., Amrun S., Sutarlie L., Ng L., and Su X., (2021). Epitope-Functionalized Gold Nanoparticles for Rapid and Selective Detection of SARS-CoV‐2 IgG Antibodies. ACS NANO, https://doi.org/10.1021/acsnano.1c04091
19. Li H., and Rothberg L., (2004). Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, 14036–14039
20. Liu D., Ju C., Han C., Shi R., Chen X., Duan D., Yan J., Yan, X. (2021). Nanozyme Chemiluminescence Paper Test for Rapid and Sensitive Detection of SARS-CoV-2 Antigen. Biosens. Bioelectron. 2021, 173, 112817
21. Manivannan S., Ponnuchamy K. (2020). Quantum Dots as a Promising Agent to Combat COVID-19. Appl. Organomet. Chem. 2020, 34, e5887
22. Mizumoto K., Kagaya K., Zarebski A., Chowell G.J.E. (2020). Estimating the asymptomatic proportion of coronavirus disease 2019 (COVID-19) cases on board the Diamond Princess cruise ship, Yokohama, Japan, 2020. Eurosurveillance , 25, 2000180
23. Moitra P., Alafeef M., Dighe K., Frieman M.B., Pan D. (2020). Selective Naked-Eye Detection of SARS-CoV-2 Mediated by N Gene Targeted Antisense Oligonucleotide Capped Plasmonic Nanoparticles. ACS Nano, 14, 7617–7627.
24. Ozmen E., Kartal E., Turan M., Yazicioglu A., Hiazi J., and Qureshi A., (2021). Graphene and carbon nanotubes interfaced electrochemical nanobiosensors for the detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) and other respiratory viral infections: A review. Materials Science & Engineering C 129 (2021) 112356
25. Park T.J., Lee S.Y., Lee S.J., Park J.P., Yang K.S., Lee K.-B., Ko S., Park J.B., Kim T., Kim S.K., (2006). Protein Nanopatterns and Biosensors Using Gold Binding Polypeptide as a Fusion Partner. Anal. Chem. 2006, 78, 7197–7205
26. Pascarella G., Strumia A., Piliego C., Bruno F., Del Buono R., Costa F., et al. (2020). COVID-19 diagnosis and management: a comprehensive review. J. Intern. Med. 288, 192–206. doi: 10.1111/joim.13091
27. Pishva P., and Yuce M., (2021). Nanomaterials to tackle the COVID-19 pandemic. Emergent Materials https://doi.org/10.1007/s42247-021-00184-8
28. Rabiee N., Bagherzadeh M., Ghasemi A., Zare H., Ahmadi S., Fatahi Y., Dinarvand R., Rabiee M., Ramakrishna S., Shokouhimehr M., Varma R.S. (2020). Point-of-Use Rapid Detection of SARS-CoV-2: Nanotechnology-Enabled Solutions for the COVID-19 Pandemic. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 5126. https://doi.org/10.3390/ijms21145126
29. Rai M., Bonde S., Yadav A., Bhowmik A., Rathod S., Ingle P., Gade A. (2021). Nanotechnology as a Shield against COVID-19: Current Advancement and Limitations. Viruses 2021,13,1224. https:// doi.org/10.3390/v13071224
30. Rasmi Y., Saloua K.S., Nemati M., Choi J.R. (2021). Recent Progress in Nanotechnology for COVID-19 Prevention, Diagnostics and Treatment. Nanomaterials 2021, 11, 1788. https://doi.org/10.3390/ nano11071788
31. Roh C., Jo S.K., (2011). Quantitative and Sensitive Detection of SARS Coronavirus Nucleocapsid Protein Using Quantum Dots- Conjugated RNA Aptamer on Chip. J. Chem. Technol. Biotechnol. 2011, 86, 1475–1479.
32. Shan B., Broza Y.Y., Li W., Wang, Y., Wu S., Liu Z., Wang J., Gui S., Wang L., Zhang Z., et al. (2020). Multiplexed Nanomaterial-Based Sensor Array for Detection of COVID-19 in Exhaled Breath. ACS Nano 2020, 14, 12125–12132.
33. Singh P., Singh D., Sa P., Mohapatra P., Khuntia A., and Sahoo S. (2021). Insights from nanotechnology in COVID-19: prevention, detection, therapy and immunomodulation. Nanomedicine (Lond.) (2021) 16(14), 1219–1235
34. Somvanshi S., Kharat P., Saraf T., Somwanshi S., Shejul S., and Jadhav K. (2021). Multifunctional nano-magnetic particles assisted viral RNA-extraction protocol for potential detection of COVID-19, Materials Research Innovations, 25:3, 169-174, DOI: 10.1080/14328917.2020.1769350
35. Talebian S., Wallace g., Schroeder A., Stellacci F., and Conde J. (2020). Nature Nanotechnology, Vol 15, August 2020, 618-624, www.nature.com/naturenanotechnology
36. Tavakol S., Zahmatkeshan M., Mohammadinejad R., Mehrzadi S., Joghataei M., Alavijeh M., Seifalian A. (2021). The role of nanotechnology in current COVID-19 outbreak. Heliyon 7 (2021) e06841
37. Tharayil A., Rajakumari R., Chirayil C., Thomas S. and Kalarikkal N., (2021) A short review on nanotechnology interventions against COVID-19. Emergent Materials (2021). 4:131–141  https://doi.org/10.1007/s42247-021-00163-z
38. To K.K.-W., Tsang O.T.-Y., Yip C.C.-Y., Chan K.-H., Wu T.-C., Chan J.M.-C., Leung W.-S., Chik T.S.-H., Choi C.Y.-C., Kandamby D.H. et al. (2020). Consistent Detection of 2019 Novel Coronavirus in Saliva. Clin. Infect. Dis
39. Toledo G., Toledo V., Lanfredi A., Escote M., Champi A., Da silva M., Nantes-Cardoso I., (2020), Promising Nanostructured Materials against Enveloped Virus. An Acad Bras Cienc (2020) 92(4): e20200718 DOI 10.1590/0001-3765202020200718
40. Udugama B., Kadhiresan P., Kozlowski H. N., Malekjahani A., Osborne M., Li V. Y. C., et al. (2020). Diagnosing COVID-19: the disease and tools for detection. ACS Nano 14, 3822–3835. doi: 10.1021/acsnano.0c02624
41. Varghese R., Salvi S., Sood P., Karsiya J., Kumar D. (2021). Carbon nanotubes in COVID-19: A critical review and prospects. Colloid and Interface Science Communications 46 (2022) 100544
42. Waller J. V., Kaur P., Tucker A., Lin, K. K., Diaz M. J., Henry T. S., et al. (2020). Diagnostic tools for coronavirus disease (COVID-19): comparing CT and RT-PCR viral nucleic acid testing. Am. J. Roentgenol. 215, 834–838. doi: 10.2214/AJR.20.23418
43. Wong M.L., Medrano J.F. (2005). Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques 39, 75–85.
44. Yeh Y.-T., Tang Y., Sebastian A., Dasgupta A., Perea-Lopez N., Albert I., Lu H., Terrones M., Zheng, S.-Y., (2016). Tunable and Label-Free Virus Enrichment for Ultrasensitive Virus Detection Using Carbon Nanotube Arrays. Sci. Adv. 2016, 2, e1601026.
45. Zhang F., Abudayyeh O. O., Gootenberg J. S., Sciences C., and Mathers L. (2020). A Protocol for Detection of COVID-19 Using CRISPR Diagnostics.
46. Zhao Z., Cui H., Song W., Ru X., Zhou W., Yu X. (2020). A Simple Magnetic Nanoparticles-Based Viral RNA Extraction Method for Efficient Detection of SARS-CoV-2. bioRxiv 2020.