SARS-CoV-2 için teşhis tekniklerinde nanoteknoloji

Özet

Nanoteknolojideki ilerlemeler COVID-19 tanısında büyük önem taşımaktadır. Enfeksiyonun yayılmasını kontrol etmek için koruma ve teşhis gereklidir. Nanoteknoloji, hızlı teşhis, erken evre enfeksiyon tespiti ve COVID-19’un tanımlanması için yeni teknikler sunar. Nanoteknoloji ürünleri, daha küçük boyutları ve daha geniş yüzey alanları nedeniyle hastalığı yüksek hassasiyetle tespit edebilir. COVID-19 semptomları diğer solunum yolu hastalıklarının semptomlarıyla çok benzer olduğundan, enfeksiyonu erken bir aşamada tespit etmek için kesin, hassas ve hızlı teşhis araçlarına sahip olmak çok önemlidir.

Anahtar kelimeler: nanoteknoloji, COVID-19, tanı

1. Giriş

Şiddetli akut solunum sendromukoronavirüs 2’nin (SARSCoV-2) neden olduğu koronavirüs hastalığı 2019 (COVID-19), DSÖ’nün pandemi ilan ettiği küresel bir sağlık sorunudur. COVID-19, dünya çapında bir kilitlenme ile sonuçlandı ve küresel ekonomiyi tehlikeye attı. SARS-CoV-2 dünya çapında hızla yayılarak küresel bir pandemik sayıca üstündür. Bu virüs damlacıklar ve sıkı temas yoluyla insandan insana bulaşabilmekte ve her yaştan insan bu virüse maruz kalmaktadır. COVID-19 salgını, modern toplumlar, özellikle sağlık hizmetleriyle bağlantılı altyapı üzerinde uluslararası baskı yarattı. Bu nedenle, pozitif vakaların sağlanması, hasta taraması ve viralsürveyans yapılması için bu hastalığa özel tanı testlerine acilen ihtiyaç duyulmaktadır. Teşhis, vakaları tespit edip izole ederek ve temaslı takibi yoluyla yayılmayı sınırlayan yönetim eylemlerinin hızlı bir şekilde yürütülmesine izin vererek COVID-19’u önlemede etkili bir rol oynayabilir. Sonuç olarak, dünya yeni bir zorlukla karşı karşıya: 2019 yeni koronavirüsünü (COVID-19) veya şiddetli akut solunum sendromu (SARS)tespit etmede oldukça etkili olan ultra hızlı, ultra hassas cihazlar ve nano ölçekli analitik araçlar veya algılama sistemleri (örneğin nanobiyosensörler) oluşturmak [3][10][17].

Nanoteknolojideki gelişmelerle birlikte, sinyalleri güçlendirme yetenekleri de dahil olmak üzere olağanüstü özellikleri, diğer teşhis araçlarıyla birlikte erken aşama tespiti için kullanılabilen nanobiyosensörlerin ve nanogörüntüleme süreçlerinin geliştirilmesi için kullanılabilir. Nanoteknoloji, sağlık bakım yükünü hafifletmek için teşhis teknikleri, terapötikler, aşılar ve stratejilerin geliştirilmesinde kapsamlı bir şekilde incelenmektedir [10].

2. SARS-CoV-2 teşhisi için mevcut laboratuvar yöntemleri

COVID-19 tanısı, hastalık nedeniyle hastanın tepkisinin analizine veya virüs içeriğinin, örneğin RNA veya proteinlerinin çalışmasına dayanır. Hastanın vücut ısısı (artan vücut ısısı), bitkin hissetme ve nefes almada zorluk enfeksiyon olduğunu düşündürür. Bununla birlikte, bu semptomlar belirli değildir ve diğer patojenlerle enfeksiyon nedeniyle gözlenebilir. Bilgisayarlı tomografi (BT) taraması ile hastanın göğüs gibi organlarındaki patolojik değişiklikleri gözlemlenebilir. BT taraması, diğer pnömoni türleri gibi SARS-COV 2 vakalarını taramak için güvenilir bir test olabilir. Ancak, analiz özel ekipman gerektirdi ve önemli ölçüde gereksinimleri karşılayamadı. COVID-19, laboratuvar ölçümleriyle teşhis edilebilir. Bu yöntemler genellikle hastaların incelenmesi için kullanılır. Yüzey ve hava gibi kontamine örnekleri analiz etmek için kullanılamazlar [1].

Şekil 1: COVID-19 için teşhis yöntemleri

COVID-19 tanısı için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Teşhis için ana testler üç ana kategoride sınıflandırılabilir [1]:

1. Genetik testler (viral nükleik asit testleri): gerçek zamanlı kantitatif ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR), izotermal amplifikasyon (örn., Döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP), nükleik asit gibi yöntemler kullanılarak viral genom analizi) sekans bazlı amplifikasyon (NASBA), transkripsiyon aracılı amplifikasyon (TMA), yuvarlanan daire amplifikasyonu (RCA), Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR) ve nanopor hedefli dizileme (NTS).
2. Antijen testleri:kolorimetrik, alan etkili transistör (FET), enzim bağlantılı immünosorbent tahlili (ELISA) ve kütle spektrometrisi (MS) gibi teknikler kullanılarak viral proteinlerin (zara bağlı spike proteinler veya nükleokapsid proteinler) analizi
3. Serolojik testler: virüse karşı antikorların (Immunoglobulin M (IgM) ve Immunoglobulin G (IgG)) analizi [188–190]. Hastanın antikorlarının incelenmesi, elektriksel (EC) biyosensörler, lokalize yüzey plazmon rezonansı (LSPR), yüzey güçlendirilmiş Raman saçılması (SERS), kuvars kristal mikro denge (QCM), floresan bazlı biyosensör, kolorimetrikbiyosensöraltın immünokromatografi, ELISA, kemilüminesansimmünoassay ve piezoelektrik mikro konsol sensörleri (PEMS)gibi yöntemler kullanılarak gerçekleştirilebilir.

Ne yazık ki, RT-PCN gibi birçok geleneksel solunum yolu virüs tespit yönteminin birçok dezavantajı vardır. Bunlar arasında zaman alıcı olması, maliyetli olması, her zaman belirlenebilir veya tekrarlanabilir olmayan ve kalifiye personel ve diğer teknik olanaklar talep edilen unsurlar yer almaktadır [3].

Şekil 2: Geleneksel yöntemlerin dezavantajları

3. Nanoteknoloji

Nanoteknoloji, özellikle nanobiyosensörler kullanarak tespit sürecinin verimliliğini ve kalitesini artırmada, hızlı teşhis, erken evre enfeksiyon tespiti ve pandemiye neden olan virülent patojenlerin tanımlanması için yeni teknikler sunar. Ayrıca, yeni nanoyapılar ve nanosensörler, makroskobik düzeyde görülmeyen özellikler ve performanslar sergilemekte, bu da önemli ölçüde nano ölçekli bir seviyede olayları tespit etmek ve algılamak için önemli [3].

Nanoteknoloji, COVID-19 tanısını iyileştirebilir ve Bakım Noktası (POC) algılama teknolojisine dayalı son teknoloji bir teşhis yöntemi önerebilir. Ayrıca, veri depolama, paylaşım ve analitik yoluyla pratik bilişimi incelemek için yapay zeka (AI) teknikleri ve tıbbi nesnelerin interneti (IoMT) ile entegrebiyosensörlerlearayüz oluşturulabilir. Ayrıca, düşük hassasiyet, düşük seçicilik, yüksek maliyet ve uzun tanılama süresi gibi geleneksel süreçleri atlayabilirler. Grafen oksit (GO)/Au/Fiber Bragg ızgara (FBG) probu kullanarak hastanın tükürüğünü analiz etmek gibi ağrısız numune analizi için yeni yöntemler kullanılabilir. Nanoteknoloji, etiketsiz biyosensörler, kâğıt yanal akış deneyleri, optik teknolojiler ve dijital teknolojiler gibi teknolojileri geliştirebilir [1].

3.1. Nanobiyosensörler

Viral salgınların daha yüksek üstünlüğü, bulaşıcı ajanları tespit etmek için kullanılan uygun olmayan tespit araçlarına bağlanabilir. Sonuç olarak, bu, biyoalgılama özelliklerinde güçlü, hızlı, talepkar ve kesin olan bir algılama veya teşhis aracı gerektirir. Biyosensörler, biyolojik numunelerdeki (insan serumu, kan, gözyaşı, tükürük vb. gibi) bir analitin düşük konsantrasyonlarını değerlendirebilen analitik araçlar olarak karakterize edilebilir. Geleneksel kalitatif ve kantitatif test kitleriyle karşılaştırıldığında, bu biyosensörler olumlu bir şekilde kesindir ve yönlendirilmiş hedefe karşı hassastır [15].

Şekil 3: Çeşitli biyosensörlerin sınıflandırılması ve uygulamaları

COVID-19’u teşhis etmede doğruluk ve hız ihtiyacı, COVID-19’u tespit etmek ve teşhis etmek için rutin olarak kullanılan geleneksel seroloji tabanlı testler ve ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) yöntemleriyle karşılanmamaktadır.Bu koşul, yeni koronavirüs tespitinde önemli bir rol oynayan ultra hassas nanobiyosensörler kullanılarak yerine getirilebilir. Nanobiyosensörler, SARS-CoV-2’nin tespiti için hızlı, uygun maliyetli, hassas ve minyatür bir platform sunar [10]. Biyosensörler tipik olarak bir sinyal dönüştürücünün yüzeyine sabitlenmiş bir biyolojik tanıma molekülü içerir ve daha büyük popülasyonların analizi, teşhisi, korunması, güvenliği ve test edilmesi için kullanılabilir [3].

Nanobiyosensörler, algılamanın etkili olmasına neden olan çeşitli avantajlar sağlar, örneğin [3]:

• Uygun maliyetli;
• Uzun öz yaşam;
• Kullanımı kolay;
• Özerk;
• Hassas;
• Taşınabilirlik;
• Hızlı cevap;
• Yüksek hassasiyet;
• Çoğullama yetenekleri;
• Uygulanabilir süreç.

Nanobiyosensörler, dönüştürücünün hedef bileşeni yakalamak, biyolojik yanıtı elektrik sinyallerine dönüştürmek ve onunla yüksek hassasiyette hızlı algılamak için değiştirildiği cihazlardır. Fiziksel tepkiler, nükleik asitler, antijenler, DNA probu, peptit, tam hücre, mikroorganizma ve doku gibi uygun biyoreseptörler belirlenerek hesaplanabilir. Bu reseptörler kolayca tanınabilir, oldukça hassastır ve spesifikbiyoanaliti saptar.Elektrokimyasal, empedans, kuvars kristal mikro dengesi ve optik ve yüzey plazmonrezonansına dayalı çoklu nanobiyosensörlerde nükleik asitler (NA), immünoafinite ve protein gibi virüsleri yakalamak için çeşitli biyoreseptör türleri araştırılmıştır. Hedef molekül, olağandışı bir reaksiyonla biyolojik bir molekülü yakalamak için biyoreseptöre bağlanır. Ardından, belirli bir yanıtla entegre moleküllü dönüştürücü. Ardından, entegrenanoyapılara sahip dönüştürücü, algılamayı dedektör tarafından tanımlanan bir elektrik sinyaline dönüştürür (Şekil 4) [3].

Şekil 4: Solunum virüsleri için tipik bir nanobiyosensör tasarımının parçaları olarak farklı analitlerin, biyolojik tanıma elemanları için biyoreseptörlerin, entegrenanoyapılara sahip dönüştürücülerin şematik diyagramı

SARS veya MERS koronavirüslerinin tespiti için kullanılan nanobiyosensörler, viral hedefin biyolojik molekülüne (nükleik asitler, antijenler veya antikorlar) göre nükleik asit-bazlı biyosensör, antijen-tabanlı biyosensör ve antikor-tabanlı biyosensör olarak sınıflandırılabilir (Şekil 5) [3].

Şekil 5: SARS ve MERS koronavirüslerinin tespiti için farklı biyosensör sınıflandırmalarının şematik gösterimi

3.1.1. Elektrokimyasal Nanobiyosensörler

Elektrokimyasal biyosensörler, en yaygın olarak kullanılan ve en çok tercih edilen algılama mekanları türüdür. Uluslararası Saf ve Uygulamalı Kimya Birliği (IUPAC) tanımına göre elektrokimyasal biyosensör “bir elektrokimyasal transdüksiyon elemanı ile doğrudan uzamsal temasta tutulan bir biyolojik tanıma elemanı (biyokimyasal reseptör) kullanarak spesifik nicel veya yarı nicel analitik bilgi sağlayabilen kendi kendine yeten entegre bir cihaz” [8][13].

Bir elektrokimyasal nanobiyosensör, kullanılabilir bir elektrik sinyali oluşturmak için biyolojik bir tanıma olayını bir elektrot dönüştürücü ile eşleştiren moleküler bir algılama cihazıdır. Elektrokimyasal nanosensörler elektrotları içerdiğinden, yarı iletken özellikleri, dielektrik özellikler ve yük dağılımı kritik unsurlardır [3].

Şekil 6: Biyokimyasal bilgiyi bir elektrokimyasal dönüştürücü yüzeyinde akım veya voltaj sinyallerine dönüştüren bir elektrokimyasal biyoalgılama platformunun kullanılmasına özel vurgu yapılarak, hedef analit numunelerinin algılanması için kullanılan biyosensör tasarım bileşenlerini gösteren şema.

Elektrokimyasal biyosensörlerin başlıca faydaları [5][11]:

• Kolay geliştirme
• Minyatürleştirme imkanı
• Yüksek hassasiyet
• Nispeten düşük maliyet

Elektrokimyasal sensörler, a. düşük maliyetli mikro elektronik devreler, b. çip üzerinde minyatür laboratuvar, c. elektronik okuma ile arayüz oluşturma ve d. bir sinyal işleme birimi gibi çoklu modüllerle sorunsuz bir şekilde birleştirilebildikleri için çeşitli biyomolekülleri tespit etmek için çekici bir seçimdir. Elektrokimyasal biyosensörler hassas, minyatürleştirmesi kolay, küçük analit hacimleri gerektirir, analit tespitinin üstün limiti ve yerinde sonuçları gösterir, tıbbi teşhis ve gıda güvenliği ve çevresel izleme dahil olmak üzere diğer birçok araştırma alanında en çok tercih edilir [8].

Elektrokimyasal biyosensör, sinyal ölçümleri için kullanılan dönüştürücü modlarına göre kategorize edilebilir. Bunlar, kondüktometri ve yüzey yükü, amperometri ve potansiyometri transdüksiyon platformlarını içerir. Elektrokimyasal biyoalgılamanın (biyo-elektrokimya) genel prensibi, elektrotun üzerinde veya yakınında ve/veya elektrotlar arasında meydana gelen elektrokimyasal tepki (i) ölçülebilir bir akım sinyali (amperometrik), (ii) kümülatif yük veya potansiyel (potansiyometrik) veya (iii) ortamın iletkenliğindeki değişiklikler (kondüktometrik) üzerine kuruludur [8].

Şekil 7: Dönüştürücü tipine ve sinyal modlarına göre elektrokimyasal biyosensörlerin sınıflandırılması

Viral nükleik asitleri tanımlamak için elektrokimyasal nanobiyosensörler de kullanılabilir. SARS’ı saptamak için geliştirilen bir elektrokimyasal genosensör, altın nanoparçacıklarla kaplı karbon elektrotlar üzerinde kendi kendine birleştirilen tek bir tiyollenmiş oligonükleotit tabakası kullanılarak geliştirildi. Oligonükleotid dizileri, SARS’ın nükleokapsid proteini için kesindir ve viral enfeksiyon, viral DNA’nın enzimatik amplifikasyonu yoluyla saptanır. Nanobiyosensör, SARS’ın duyarlı tespitine yardımcı olur. Bir karbon elektrot ve rekombinant spike protein S1 ile değiştirilen altın nanopartiküller kullanılarak üretilen bir elektrokimyasal nanobiyosensör, MERS-CoV’leri tespit etmek için tasarlandı; yine de, bu yaklaşım aynı zamanda koronavirüslerin tespiti için de imkan sağlıyor. Elektriksel iletkenliği nedeniyle, biyosensör, sinyal yükseltici olarak flor katkılı substrat ve altın nanoparçacıklar kullanılarak oluşturulmuştur [10].

Altın nanopartiküller (AuNP’ler) ile elektrokimyasal algılama arayüzlerinin değiştirilmesi, geliştirilmiş uygulamalar gösterir ve MERS-CoV’yi tespit etmek için kullanılabilir. AuNP’ler, elektrokatalitik özelliklere sahip çalışan arayüzler olarak hareket eder ve elektrik reaksiyonunun amplifikasyonuna izin verir (Şekil 8). Elektrokimyasal sensörler ve altın nanopartiküller birbirine bağlayan olasılığını MERS-CoV virüsünü tespit etmek için bir immünosensör tasarlandı. Nanobiyosensör, bir grup karbon elektrot kaplı altın nanoparçacık ile geliştirildi.

Şekil 8: COVID-19 elektrokimyasal algılama platformu için işlem adımları: (A) nazal sürüntü veya tükürük yoluyla numune toplama, (B) RNA ekstraksiyonu, (C) grafen-ssDNA-AuNP platformunun üstünde RNA ekstraktının immobilizasyonu , (D) 5 dakikalık inkübasyon ve (E) dijital elektrokimyasal çıktı kaydı.

Rekombinant başak (S1) proteininin altın nanopartiküllere hareketsiz hale geldiği ve antikora bağlanmak için virüs partikülleri ile rekabet ettiği gözlemlenmiştir. Virüs enfeksiyonu olmadığında, hareketsizleştirilmiş spike proteinine bağlanır. Bu nanobiyosensör yönteminin bir grup elektrotu olduğundan, çeşitli koronavirüsleri tespit etmek için kullanılabilir [5][10].

 SARS-CoV-2’nin grafen arayüzlü elektrokimyasal tespiti

Elektrokimyasal transdüksiyon platformları, spesifik biyolojik tanıma elemanlarını kullanarak virüsleri veya herhangi bir canlı mikrobiyal patojeni tespit edebilir. Hastalığa neden olan mekanizmaların elektrokimyasal tespiti için birkaç alternatif yol vardır. Bununla birlikte, elektrokimyasal algılama platformlarını kullanan genetik belirteçlerin saptanması, özellikle viral enfeksiyonların erken başlangıcında saptanamayan viral titreleri nedeniyle viral saptamalara duyarlı değildir [8][14].

Son yıllarda, virüsleri veya viral enfeksiyonları tespit etmek için elektrokimyasal glukometrelere benzer stratejiler uygulamaya yönelik birkaç girişimde bulunulmuştur. Torrente-Rodriguez ve ark. COVID-19 için serum ve tükürük örneklerinde hızlı teşhis ve biyokimyasal izleme belirteçleri için düşük maliyetli grafen entegre taşınabilir elektrokimyasal biyosensör geliştirdiler [8][14].

Elektrokimyasal sensör elektrotları, viral enfeksiyon biyobelirteçlerinin (antijenler ve antikorlar) çoğul tespiti için esnek bir poliimid (PI) polimerik substrat üzerine yazılmış grafendir. Torrente-Rodriguez vd., SARS-CoV-2 spike proteini (S1), SARS’ın nükleokapsid proteini, CRP, hem kanda hem de tükürükte ve örneğin S1-IgM ve S1-IgG gibi spesifik immünoglobulinlerde (Igs) fizyolojik olarak ilgili aralıklarda inflamasyon için bir protein biyobelirteç gibi COVID-19’un spesifik biyobelirteçlerinin nicel olarak saptandığını gösterdi. Bu mekan, birden fazla SARS-Co-V2 oluşturucuyu algılamak için çoğullama kapasitesine sahip artırılmış hassasiyete sahip grafen elektrotlar üzerinde yakalanan antijenleri ve antikorları kullanırken, elde edilen yanıt verileri kablosuz olarak taşınabilir bir mobil cihaza iletilir. Bu tür minyatürleştirilmiş elektrokimyasal platform, gelecekteki PoC elektrokimyasal ve kişiselleştirilmiş sağlık cihazları için büyük bir umut vaat ediyor [8][14].

3.1.2. Optik Nanobiyosensörler

Optik biyosensörlerin yüksek hassasiyet, etiketsiz olma, sağlamlık, elektromanyetik parazitlere karşı bağışıklık, hesaplanabilir optik çıkışlara sahip olma, minyatürleştirmeye uygun olma, entegrasyon yetenekleri, taşınabilirlik, çoğullama kapasitesi ve çeşitli hedeflerin aynı anda tespiti yapabilme gibi istisnai özelliklerinden dolayı, optik biyosensörler solunum yolu virüsü enfeksiyonu için teşhis araçları olarak kullanılır. Bu nedenle, optik biyosensörler bakım noktası bölgesi için uygundur [9] [10].

Şekil 9: Kan ve Tükürükte SARS-CoV-2’nin Hızlı ve Multipleks Elektrokimyasal Tespiti için Kablosuz Grafen Tabanlı Teletıp Platformu (SARS-CoV-2 RapidPlex) (A) SARS-CoV-2 viral proteinlerin, antikorların (IgG ve IgM) ve inflamatuar biyobelirteç C-reaktif proteinin (CRP) tespiti için SARS-CoV-2 RapidPlex çok sensörlü teletıp platformunun şematik gösterimi . Veriler kablosuz olarak bir mobil kullanıcı arayüzüne iletilebilir. WE, çalışma elektrodu; CE, karşı elektrot; RE, referans elektrotu. (B)Mass üretilebilir lazerle oyulmuş grafen sensör dizileri. (C) Tek kullanımlık ve esnek bir grafen dizisinin fotoğrafı. (D) Sinyal işleme ve kablosuz iletişim için baskılı devre kartına bağlı bir grafen sensör dizisine sahip bir SARS-CoV-2 RapidPlex sisteminin görüntüsü

Karbon nanotüpler, altın nano adalar ve grafen büyük ölçüde optik ve elektrokimyasal biyosensörlerde kullanılmaktadır. Küçük altın nanoyapılardan oluşan altın nanoadalar, yapay olarak sentezlenmiş DNA reseptörleri ve bir cam substrat üzerinde SARS-CoV-2’nin tamamlayıcı RNA dizileri ile oluşturulabilir. COVID-19, tek sarmallı bir RNA virüsü olduğundan, nanobiyosensörün reseptörü, koronavirüsün RNA dizisine tamamlayıcı bir ardışıklık görevi görür ve virüsü tespit eder. Sensöre bağlanan RNA dizisinin saptanması için LSPR (lokal yüzey plazmon rezonansı) kullanılır. Molekülleri nanobiyosensörün yüzeyine bağladıktan sonra, yerel kızılötesi indeks değişir ve bir optik nanobiyosensör modifikasyonları hesaplar ve RNA ipliklerinin varlığını belirler [9] [10].

Özellikle, SARS-CoV-2’nin oldukça etkili optik biyosensör tabanlı tespiti, yüzey plazmon rezonansı ve floresan ile sunulmuştur. Bir optik biyosensör, yüzey plazmon rezonans yöntemiyle birleştirildiğinde, elde edilen yöntem, SARS enfeksiyonunun hızlı teşhisi için enzim bağlantılı immünosorbent deneylerinden (ELISA) daha değerlidir. Lokalize yüzey plazmonu ile ilişkili floresansa (LSPCF) dayalı fiber optik özellikli bir biyosensör, AuNP’leri kullanarak rekombinant N proteinini (SARS-CoV-N) algılayabilir. Fiber optik tabanlı nano-etkin biyosensör kullanılarak 15 dakika içinde 106 parçacık/mL kadar küçük bir viral stoğun tespit edilebileceği işaretlenir. Bu araştırmalar, viral solunum yolu enfeksiyonlarının, nanomateryal özellikler kullanılarak hızlı ve tez bir şekilde teşhis edilebileceğini göstermektedir [9].

Şekil 10: Bir optik biyosensörün şeması

3.1.3. Grafen tabanlı biyosensörler

COVID-19 hastalarının nazofaringeal sürüntülerinde SARS-CoV-2 viral yükünü belirlemek için grafen bazlı bir FET (alan etkili transistör) cihazı kullanılır. Grafen bazlı FET nanobiyosensör, algılama alanı olarak bir SiO2/Si substratına taşınan bir grafen tabakasından ve grafen tabakası üzerinde hareketsiz hale getirilmiş SARS-CoV-2 spike antikorundan oluşur. Biyosensörler, fosfat tamponundaki 1 fg/mL konsantrasyonda bile SARS-CoV-2 antijen sıçramasının saptanmasına yardımcı olur [10].

Grafen tabanlı biyosensörler, aşağıdakilerin test edilmesi ve en son teknolojiyle tespiti için değerlidir [9]:

• kan şekeri
• solunum sayısı
• gerçek zamanlı vücut ısısı
• kan basıncı
• virüs
• küçük moleküller

Maliyet etkinliği, yüksek ilişkilendirme ve üretim kolaylığı nedeniyle, grafen bazlı nanomalzemeler, biyosensörler için en çekici malzemelerdir. Örneğin, SARS-CoV-2’yi (spike protein) tespit etmek için transistör tabanlı bir biyosensör başarıyla geliştirildi. Biyosensör, spesifik bir antikora sahip alan etkili transistör (FET) kaplı grafen levhalar kullanılarak üretildi (Şekil 9). Grafen ve türevleri, şu anda mevcut olan diğer tanı yöntemlerine göre faydaları olduğu için virüsleri yakalamak için uygun bütünlük FET tabanlı biyoalgılama cihazlarını göstermektedir [9].

FET tabanlı biyoalgılama cihazları, az miktarda analit kullanarak hassas ve anlık ölçümler yapabilir. Ayrıca, FET tabanlı biyosensörlerin klinik teşhis, görüşte tespit ve bakım noktası testlerinde muhtemel ve faydası vardır. İnsan boğaz sürüntü örneklerinde SARS-CoV-2 RNA’yı tespit etmek için büyütülmemiş ve hızlı bir nanoalgılama platformu oluşturulmuştur. Altın nanoparçacığı (AuNP) göstermek için bir grafen alan etkili transistör (G-FET) sensörü tasarlanmıştır. AuNP’lerin yüzeylerinde tamamlayıcı fosforodiamidat morfolino oligo (PMO) probları hareketsizleştirilmiştir. PMO, SARS-CoV-2 RdRp’ye karşı oldukça hassas olduğundan, bu sensör düşük bir arka plan sinyaline yönlendirir. Bir grafen alan etkili transistör, CRISPR-Cas9 tabanlı bir biyosensör ile bağlandığında, amplifiye edilmemiş hedef genleri tespit edebilecek ve böylece SARS-CoV-2 nükleik asitleri gibi viral hedefler için değerlendirilebilecektir. [9].

3.1.4. Kiral Nanobiyosensörler

Kiral biyosensörler, ultra hassaslıkları ve hızlı tepki süreleri nedeniyle yakında biyonanoteknoloji alanının öncüsü olacak. SARS-CoV-2 pandemisinde etkili olacaklar. Nano-chiroptics’in popülaritesi, ayarlanabilir bir yüzey morfolojisine sahip tasarlanmış metalik nanoyapılar üretmek ve nano montajlarını tamamlamak için yeni yöntemler nedeniyle patladı. Bu, elektronik ve optik özellikleri üzerinde benzersiz bir güç sunar. Bu tür nanohibrit yapıların en önemli yararı, kiral biyoalgılama ile bağlantılı çeşitli uygulamalarda önemli bir ilgi uyandıran ve yeni araştırma alanları açan kayroptik reaksiyonu geliştirmeleridir. Doğal kiral moleküllerle karşılaştırıldığında, kiral plazmonik nanoyapılar sadece önemli kayroptik etkilere yol açmakla kalmaz, aynı zamanda teknolojik uygulamalarda tamamen benzersiz süperkiral ışık fikirleri sunar [2][5].

Şekil 11: FET’leri kullanarak SARS-CoV-2’nin saptanması: Şema, bir hastadan alınan biyolojik örneklerin bir koleksiyonunu ve bunların bir FET biyosensörünün grafen tabanlı algılama alanına uygulanmasını gösterir. SAR-CoV2 virüsüyle ilişkili bağlanma olayları sensör tarafından gerçek zamanlı olarak yakalanabilir.

Ahmed vd., altın nanoparçacıklar ve kuantum noktaları kullanan bir kiral immünosensör geliştirmek için kendi kendine monte edilen bir teknik geliştirdiler. Zirkonyum kuantum noktaları ve manyetik nanopartiküller, koronavirüse özgü antikorlarla konjuge edildi ve karıştırıldı. Bir viral hedefin varlığında, hem kuantum noktaları hem de nanopartiküller viral hedefe bağlanacak ve bir dış mıknatısın bölebileceği manyeto plazmonik-floresan nanohibritleri geliştirecektir. Analit konsantrasyonuna daha sonra ayrılan nanohibritlerin floresan atılganlığı hesaplanarak karar verildi. Bu algılama işlemi, 79.15 EID/50 µl [2][5][10] algılama sınırına sahiptir.

3.1.5. Aptamer Bazlı Biyosensör

Sağlam tarama yöntemi sayesinde aptamerler viral genleri, proteinleri veya diğer viral enfeksiyon belirteçlerini tespit edebilir. Aptamer bazlı sensörler, geliştirilen testleri ayarlayarak, enfekte ve enfekte olmayan konak hücreleri veya aktif ve aktif olmayan viral formları ayırt edebilir. Özellikleri nedeniyle, aptamer bazlı algılama, çok çeşitli sıcaklık ve durumlarda yüksek esneklik, üstel zenginleştirme (SELEX) yöntemiyle ligandların sistematik evrimi yoluyla doğrudan sentez ve ihtiyaçlara göre kolay dönüşüm tahlili dâhil olmak üzere antikorlara göre önemli avantajlara sahiptir [4].

Şekil 12: Aptamer bazlı biyosensörler kullanılarak SARS-CoV ve SARS-CoV-2’nin tespiti

Biyosensörler, antikor ve aptamer bazlı algılama mekanizmalarını kullanır. Aptamerler, antikorlardan daha dayanıklı, daha ekonomik ve sentezlenmesi daha hızlıdır. “Kimyasal antikorlar” veya “yapay antikorlar” olarak da bilinen aptamerler, hedeflerine yönelik kritik özellikleri açısından genellikle antikorlara benzetilir. Bazı aptamerler SARS-CoV-2’de izole edilmiş ve aptasensing platformlarına dahil edilmiştir [7].

Aptamerler, özellikle;

• amino asitler, nükleotidler ve antibiyotikler gibi küçük moleküller
• nükleik asitler ve proteinler gibi makromoleküller
• ve hatta tüm bakteri, virüs ve diğer hücreleri taşıyan yüzey epitopu gibi

spesifik olarak farklı biyomolekülleri tanımak ve bunlara bağlanmak üzere tasarlanabilen oligonükleotit dizileridir.
Aptamerler, özel olarak analitlere sabitlenirken benzersiz üç boyutlu (3D) yapılar oluşturur. Bunlar hızlı bir şekilde modellenebilir ve biyosensörlerin yüzeyinde sabit bir şekilde hareketsiz hale getirilebilir. Aptamer bazlı biyosensörler (aptasensörler), birleştirilmiş kimyasal ve/veya biyokimyasal yüzey etkileşimlerinden geliştirilen sinyali hesaplanarak hedef analitleri nicel olarak tespit edebilir. Aptamerler, virüsleri tespit etmek için umut verici bir teşhis aracı olarak kabul edilmiştir [7].

Aptasensörler, ölçülebilir bir sinyal üretme mekanizmasıyla ilgili farklı biyokimyasal reaksiyonlar yoluyla hedef analit biyomoleküllerini keşfetmek ve ölçmek için tasarlanmış aptamer bazlı biyosensörlerdir. Spesifik aptamerlerin hedef biyomoleküllerle değişimi, ek olarak orantılı bir sinyale dönüştürülen olayın biyolojik olarak tanınmasını ve yakalanmasını temsil eder. Yakın zamanda SARS-CoV-2’yi tespit etmek için rapor edilen aptasensörler, sinyal iletiminin doğasına göre genel olarak iki kategoriye ayrılabilir: optik ve elektrokimyasal aptasensörler [7].

3.2. Bakım Noktası Testi

Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri tarafından tanımlandığı şekliyle Bakım Noktası testleri, “örnek alınan yerde veya yakınında yapılan tanı testleridir ve saatler değil dakikalar içinde sonuç verirler. Bunlar Nüklelik Asit Amplifikasyon Testi (NAAT), antijen veya antikor testleri olabilir”[18].

Bakım noktası testi (POCT) bulaşıcı hastalık pazarı, endüstrinin küresel in-vitro teşhislerinde (IVD) elverişli ve önemli bir artışı temsil ediyor. Gelişmekte olan ülkelerde insan immün yetmezlik virüsü (HIV), tüberküloz (TB) ve sıtmanın artan yayılımı ve Orta Doğu solunum sendromu (MERS), şiddetli akut solunum sendromu (SARS) gibi bulaşıcı hastalıkların ortaya çıkma ve yeniden ortaya çıkma tehlikesi, ZIKA, çeşitli influenza suşları ve Batı Nil virüsü, POCT ihtiyacını artıran faktörlerdir [6].

Bulaşıcı hastalıklar insan sağlığı için önemli bir tehdit oluşturuyor ve dünya çapında ölümlerin yarısından fazlasına neden oluyor. Ayrıca, yaygın bulaşıcı hastalıklar gelişmekte olan ülkelerde ölüm oranlarını sürekli olarak artırmıştır. Salgını kontrol altına almanın en etkili yolu, pahalı ve kapsamlı ekipman, uzmanlar ve yavaş veri çıkışı nedeniyle ortak yaklaşımları kullanmak zor olmasından dolayı erken teşhistir. Bu nedenle, cihaz maliyetini küçülterek ve azaltarak ve özel eğitim gerektirmeden erişilebilir, hızlı, kullanımı kolay tanı testleri sunarak bu yüklerin üstesinden gelmek için hızlı POCT yöntemleri gereklidir [6].
POC testi, hasta numunelerini laboratuvarlara göndermeden enfekte kişilerin teşhisini sağlar. Bu, numune testi için uygun laboratuvar altyapısına sahip olmayan yerler veya sakinler için son derece önemlidir. POC testinin temel parçası, patojeni tespit etmek de kullanılan bir biyokimyasal tahlil için kullanılan biyosensördür.
POC testi kullanmanın avantajları şunlardır [4]:

1. Test ve depolama için minimum alan koşulu,
2. Geniş kapsamlı analiz,
3. Test çeşitli yerlerde gerçekleştirilebilir ve
4. Çeşitli tıbbi ihtiyaçları karşılamak için uyarlanabilir.

Şekil 13: SERS tabanlı aptasensör kullanılarak SARS-CoV-2’nin nicel değerlendirmesinin şematik gösterimi. (a) SARS-CoV-2 lizatları hedef spike proteinleri serbest bıraktıktan sonra, Au nanopop corn yüzeylerindeki aptamer DNA’ları tarafından tanınırlar. S proteinine bağlı aptamerler, Au nanopop corn yüzeylerinden uzaklaşarak Cy3 raportörlerinin Raman tepe yoğunluğunun azalmasına yol açar. (b) Cy3-etiketli aptamer DNA’ları, Au nanopopcorn substratı üzerinde yakalama DNA’ları ile hibritlenir. Dahili standart 4-MBA’lar, Au nanopopcorn substratı üzerindeki aptamer DNA’ları ile birlikte hareketsizleştirilir. (c) SARS-CoV-2 S proteininin tanınması aptamer DNA’larının konformasyonel bir değişikliğini indükleyerek aptamer DNA’larının spike protein üzerindeki RBD’ye bağlanmasını sağlar

En cazip POCT’lerden biri, kolometrik biyosensörlere dayananlardır, çünkü bunlar, yardımsız gözle gözlemlenebilen kolay renk değişiklikleri yoluyla analitin saptanmasına izin verir [5].

Şekil 14: Virüsün nanoparçacık tabanlı kolorimetrik tespiti. Bu şekil, virüsün nanopartiküllerin toplanmasına sonucu kırmızıdan mora renk değişimine neden olan mekanizmayı göstermektedir.

Kim vd., MERS-CoV virüsünü tespit etmek için altın nanopartiküller kullanan bir kolorimetrik tahlil oluşturdu. Çift sarmallı DNA (dsDNA) kendi kendine birleşen korumalı altının genişletilmiş yapısına dayanan bir kolorimetrik tahlil önerdiler. Bu tahlil, pozitif elektrolit (örn., 0.1 M MgCl2)[5] [6] altında iki tiyol ile modifiye edilmiş prob ve sitrat başlıklı altın nanopartiküller (AuNP’ler) kullanır.

Altın nanoparçacık bazlı kolorimetrik test, virüsü toplayan ve sıvıda gözlemlenebilir bir renk değişikliği gösteren bir altın nanoparçacık çözeltisi yapar. Bu, altın nanoparçacıkların rengini değiştirerek COVID-19 için hızlı bir test sağlar. Bu düşük maliyetli test, standart PCR testlerine benzer şekilde diğer tanı tekniklerinden çok daha iyi etki eder. Bu testin ana faydası, altın nanoparçacıklarının belirli dalga boylarını absorbe ettikleri için belirli renkler göstermesidir. Altın nanoparçacıklara, SARS-CoV-2 içeren numune katılır, bu da virüsün birikmesine neden olur ve absorpsiyon yüksekliğinde çözeltinin renginin değişmesine neden olan bir dönüşüme neden olur. Renkteki bu kayma çıplak gözle gözlemlenebilir olacaktır ve dezavantajı ise yalnızca virüs yükü çok yüksek olduğunda uygulanabilir olmasıdır [12].

Problar, önemli Au-S değişimleri yoluyla AuNP’lere konjuge edilir. Bir hedefin yokluğunda, AuNP’lerin toplamı (pozitif elektrolitte), ya çıplak gözle tasavvur ederek ya da lokalize yüzey plazmon rezonans (LSPR) kayması ile tespit ederek renk değişimine yol açar. Bununla birlikte, viral hedefin varlığı, pozitif elektrolitlerin varlığında altın nanopartiküllerin birikimini kontrol ederek, AuNP’lerin optik özelliklerinde kaymayı engelleyerek çift sarmallı DNA’nın kapsamlı şekilde kendi kendine toplanmasına neden olur [5] [6].

Bu tahlilin potansiyel saptama limiti, viral hedefin daha düşük miktarlarının saptanmasına izin veren 1 pmol µl-1’dir. Ayrıca, bu tür kolorimetrik temelli tahlillerin kullanılması, karmaşık cihazlara ihtiyaç duymadan düşük maliyetli ve hızlı hastalık teşhisine olanak tanır [5].

3.3. Nano gözenekli hedef dizilimi (NTS)

Nanopore metagenom yönteminin (NTS), solunum yolu bakteriyel enfeksiyonunu ve virüsleri klinik örneklerden anında tespit ettiği gösterilmiştir. Ek olarak, patojenler ve antibiyotik direnç genleri, nanopore sıralayıcıların gerçek zamanlı veri üretimi olarak geleneksel kültür işlemlerinden çok daha hızlı bir şekilde birkaç saat içinde tanınabilir. Ayrıca, SARS-CoV-2’nin transkriptomundaki dizileri yönlendirmek için nanopor dizilimi kullanıldı. NTS yöntemi, SARS-CoV-2 ve diğer on solunum yolu virüsünü sadece 6-10 saat içinde aynı anda tespit eder. Bu nedenle, COVID-19’un mevcut teşhisi için uygundur; bununla birlikte, çerçeve diğer virüsleri ve patojenleri teşhis etmek için genişletilebilir. NTS, 11 SARS-CoV-2 virülansla ilgili ve istisnai gen fragmanının (örn. orf1ab) bir iç birincil panel kullanılarak amplifiye edilmesini ve ardından güçlendirilmiş fragmanın bir nanopore platformunda sekanslanmasını temel alır. Bu görev, uzun nükleik asit parçalarını sıralamak ve eş zamanlı olarak veri çıktısını gerçek zamanlı olarak analiz etmek için dizileme için bir nanopor platformu kullanır. Bu, dizi okumalarını SARS-CoV-2 genomuna eşleyerek ve çıktı dizisinin orijinalliğini, geçerliliğini ve okunan sayı dizisini analiz ederek, dizilemeden sonraki dakikalar içinde SARS-CoV-2 enfeksiyonlarının doğrulanmasına olanak tanır [16]][17].

4. COVID-19’da Nanoteknolojinin Zorlukları ve Sınırlamaları

Nanoteknoloji tabanlı sistemler, avantajlarına rağmen, piyasaya güvenli bir şekilde sunulmadan önce birçok engelle karşılaşmaktadır. En yaygın sorunlar şunlardır:

1. Ölçeklenebilirlik ve üretim maliyetleri
2. Fikri ve düzenleyici özellikler
3. Potansiyel toksisite ve çevresel etkiler

Nanoteknoloji uygulamalarındaki bazı problemler, sağlık sisteminde yaygın olarak benimsenmeden önce ele alınmalıdır. Birincil görev, biyouyumluluklarının in vitro çalışmaları yoluyla nanomalzemenin güvenliğini sağlamak olacaktır. Nanomalzemelerin kaderi, protein korona oluşumu nedeniyle kanda dolaşırken vücuda dönüşebilir. Bu nedenle, vücuttaki nanopartiküllerin toksisitesini daha iyi anlamak için in vivo çalışmaların dikkatli bir şekilde yürütülmesi gerekir. Kısıtlamalar nedeniyle, araştırma ve geliştirmenin erken bir aşamasında kategorizasyon için nanoteknolojiye dayalı tedavinin klinik çevirisinde başarısızlık olasılığını yanlış hesaplayan jenerik protokoller kullanılmıştır. Diğer sınırlamaların üstesinden gelmek için düzenleyici kurumlar, malzeme bilimi, farmakoloji ve toksikoloji uzmanları arasında daha yakın işbirliğine ihtiyaç vardır [10].

---

Test LO 3.2

---

Kaynaklar

1. Abdelhamid H., and Badr G.
2. (2021). Nanobiotechnology as a platform for the diagnosis of COVID‐19: a review. Nanotechnology for Environmental Engineering 6:19 https://doi.org/10.1007/s41204-021-00109-0.
3. Ahmed SR., Nagy É., and Neethirajan S. (2017). Self-assembled star-shaped chiroplasmonic gold nanoparticles for an ultrasensitive chiro- immunosensor for viruses RSC Adv. 7 40849–57
4. Alhalaili B., Popescu I.N., Kamoun O., Alzubi F., Alawadhia S., Vidu R. (2020). Nanobiosensors for the detection of novel coronavirus 2019-nCoV and other pandemic/Epidemic Respiratory viruses: A review. Sensors, 20, 6591.
5. Gupta R., Sagar P., Priyadarshi N., Kaul S., Sandhir R., Rishi V. and Singhal N.K. (2020). Nanotechnology-Based Approaches for the Detection of SARS-CoV-2. Front. Nanotechnol. 2:589832. doi: 10.3389/fnano.2020.589832
6. Jindal S., and Gopinath P. (2020). Nano Ex. 1 022003
7. Kim H.,Park M.,Hwang J.,Kim J.H., Chung D-R., Lee Kand Kang M. (2019). Development of label-free colorimetric assay for MERS-CoV using gold nanoparticles ACS Sens.
8. Mandal M., Dutta N., and Dutta G. (2021). Aptamer-based biosensors and their implications in COVID-19 diagnosis. Anal. Methods, 2021, 13, 5400
9. Ozmen E., Kartal E., Turan M., Yazicioglu A., Hiazi J., and Qureshi A. (2021). Graphene and carbon nanotubes interfaced electrochemical nanobiosensors for the detection of SARS-CoV-2 (COVID-19) and other respiratory viral infections: A review. Materials Science & Engineering C 129 (2021) 112356
10. Pradhan A., Lahare P., Sinha P., Singh N., Gupta B., Kuca K., Ghosh K.K., Krejcar O. (2021). Biosensors as Nano-Analytical Tools for COVID-19 Detection. Sensors 2021, 21,7823. https://doi.org/10.3390/ s21237823
11. Rai M., Bonde S., Yadav A., Bhowmik A., Rathod S., Ingle P., Gade A. (2021). Nanotechnology as a Shield against COVID-19: Current Advancement and Limitations. Viruses 2021,13,1224. https:// doi.org/10.3390/v13071224
12. Satvekar R. (2021). Electrochemical nanobiosensors perspectives for COVID 19 pandemic.  J. Electrochem. Sci. Eng. 00(0) (2021) 000-000; http://dx.doi.org/10.5599/jese.1116
13. Tavakol S., Zahmatkeshan M., Mohammadinejad R., Mehrzadi S., Joghataei M., Alavijeh M., Seifalian A. (2021). The role of nanotechnology in current COVID-19 outbreak. Heliyon 7, e06841
14. Thevenot D.R., Toth K., Durst R.A., Wilson G.S., Biosens. (2001). Bioelectron. 16:121–131.
15. Torrente-Rodríguez R.M., Lukas H., Tu J., Min J., Yang Y., Xu C., Rossiter H.B., Gao W., (2020). Matter. 3: 1981–1998.
16. Varghese R., Salvi S., Sood P., Karsiya J., Kumar D. (2021). Carbon nanotubes in COVID-19: A critical review and prospects. Colloid and Interface Science Communications 46: 100544
17. Wang M., Fu A., Hu B., Tong Y., Liu R., et al. (2020). Nanopore target sequencing for accurate and comprehensive detection of SARS-CoV-2 and other respiratory viruses. medRxiv.
18. Waris A., Ali M., Khan AU., Ali A. (2020). Baset A. Role of nanotechnology in diagnosing and treating COVID-19 during the Pandemic. Int J Clin Virol. 2020; 4: 065-070.
19. https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/point-of-care-testing.html